基于失巢凋亡相關標志物預測膀胱癌患者預后

朱亮，陳業剛

（天津醫科大學第二醫院泌尿外科，天津 300211）

膀胱癌是最普遍的泌尿系統惡性腫瘤之一，也是世界上最常見的十大癌癥之一。根據《2020 年全球癌癥統計》，膀胱癌在全球范圍內造成約212 000 人死亡，而且這一死亡人數隨著時間的推移在不斷增加[1]。根據臨床病理特征，膀胱癌可分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌[2]。大多數膀胱癌患者（75%）表現為非肌層浸潤性膀胱癌，但其中超過60%的患者有復發可能，超過20%的患者最終進展為肌層浸潤性膀胱癌，患者5 年生存率從90%急劇下降到50%以下[3-5]。盡管目前膀胱癌的治療方案越來越多，如手術、放療、化療、靶向治療、免疫治療和新輔助治療等，但仍有相當一部分人沒有從中受益[6]。因此，鑒定膀胱癌的生物標志物和基因靶點以抑制癌癥浸潤進展具有重要的臨床意義。

失巢凋亡是由正常的細胞-細胞或細胞-細胞外基質附著失敗而誘發的一種程序性細胞死亡[7]。與經典的細胞凋亡類似，失巢凋亡通過線粒體途徑或細胞表面死亡受體途徑在人體內發揮作用[8]。失巢凋亡可以防止脫落的細胞黏附在異常部位[9-10]。然而，越來越多的研究表明，侵襲性腫瘤細胞產生失巢凋亡抵抗是腫瘤進展的關鍵因素[11]。失巢凋亡抗性日益成為腫瘤進展的有力標志。但是目前很少有研究探討膀胱癌中失巢凋亡與腫瘤細胞浸潤和遠處轉移之間的聯系。

因此本研究探討了失巢凋亡與膀胱癌之間的預后關系，并建立一個預后評分模型。此外，將腫瘤微環境、藥物敏感性和失巢凋亡相關基因結合起來，進一步探討該風險評分與腫瘤微環境的相關性，為膀胱癌患者的預后評估提供了堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 數據收集 2023 年3 月10 日從The Cancer Genome Atlas（TCGA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中收集了有關膀胱癌的基因轉錄組數據和臨床數據，其中包含19 個正常樣本和412 個腫瘤樣本。進一步從Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載了GSE-3507數據集的相關信息。使用Perl 和WinRAR 軟件對GEO 基因表達數據和TCGA 表達數據進行提取、解壓、清理和合并。轉錄組數據使用的是每千基數的片段（FPKM）。所有的失巢凋亡相關基因都是通過genecards（https：//www.genecards.org/）數據庫[12]和harmonizome（https：//maayanlab.cloud/Harmonizome/）數據庫[13]獲得。在去除重復的數值后，得到516 個失巢凋亡相關基因。為盡量減少數據偏差，從臨床數據中剔除了缺失總生存期（overall survival，OS）和總生存期低于30 d 的樣本（表1）。最后，從UCSC Xena 服務器（https：//xena.ucsc.edu/）上的GDC TCGA膀胱癌項目中獲得膀胱癌患者的拷貝數變異數據。

表1 基于TCGA 及GEO 膀胱癌患者臨床特征分布Tab.1 Distribution of clinical characteristics of bladder cancer patients based on TCGA and GEO

1.2 建立與預后相關的失巢凋亡相關基因風險評分 從TCGA 數據庫中篩選出上述516 個基因表達數據，并使用Wilcoxon秩和檢驗進行差異分析。隨后，進行單因素Cox回歸分析以篩選與生存相關的基因，使用R 包“glmnet”進行最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）回歸分析。多因素Cox回歸被用來提取風險模型構建的核心基因并計算其對應系數（coef）。所有樣本的風險得分按以下公式計算：風險分數=，其中exp（Xi）和coef（Xi）分別代表基因表達水平和對應風險系數。然后，將所有符合標準的樣本按1 ∶1 的比例分成訓練組和測試組。以訓練組中風險分數中位數值為分界點，將所有樣本分為高風險組和低風險組。最后，對所有樣本、測試樣本和訓練樣本中的高、低風險組進行Kaplan-Meier（K-M）分析和受試者工作特征（ROC）曲線分析，以評估模型的預測價值。

1.3 列線圖模型的構建與驗證 根據患者的臨床特征和失巢凋亡相關基因評分，使用R 包的“rms”與“survival”包創建列線圖來預測樣本1、3 和5 年的生存期。校準圖、累積危險曲線和決策曲線分析以驗證列線圖模型的預測能力。

1.4 免疫浸潤與腫瘤微環境分析 采用CIBERSORT 軟件包獲得所有樣本中22 種免疫細胞的表達譜。然后，預估高風險組和低風險組之間22 種免疫細胞浸潤腫瘤的比例，并以柱狀圖和小提琴圖的形式呈現。同時，探索各種免疫細胞之間的相關性。此外，將得到的核心預后失巢凋亡基因，風險得分與22 種免疫細胞進行相關性分析。最后，通過ESTIMATE 算法比較高危組和低危組的純度、基質和免疫評分。

1.5 藥物敏感性分析 通過使用R 包“pRR-ophetic”，測量了不同藥品的50%最大抑制濃度（IC50），并比較不同風險組間的敏感性差異（P<0.001）

1.6 細胞培養及轉染 將人正常膀胱細胞SVHUV-1 及膀胱癌細胞系T24、J82、5637（中國科學院上海細胞庫）接種于含10%胎牛血清的DMEM（日本Takara 公司）中培養，并放置于37℃，5%CO2細胞培養箱中，待細胞生長至80%～90%培養皿時，予胰蛋白酶進行消化、傳代。

1.7 RT-qPCR 實驗檢測基因mRNA 表達量 按照TRIzol 試劑[天根生化科技（北京）公司]說明書所述，提取細胞密度達80%左右時的正常膀胱細胞、T24、J82、5637 膀胱癌細胞系中的總RNA，使用反轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）合成cDNA，應用qRT-PCR 的方法對F10，內參GAPDH 進行擴增，采用2-ΔΔCT法對F10，內參GAPDH 表達水平定量分析，設置qRT-PCR 反應條件：92℃40 s，58℃28 s，72℃28 s，循環36 次，每組6 個重復，每個重復3 個平行。其中所選擇的引物序列如下：F10 上游引物：5′-TCAAGGTGAGGGTAGGGGAC-3′，下游引物：5′-GGAAGGTGATGGGGGTCTTG-3′；GAPDH 上游引物：5′-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA-3′，下游引物：5′-GCCCAATACGACCAAATCAGAG-3′。

1.8 細胞轉染 取對數生長期的膀胱T24 細胞進行轉染，按照LipofectamineTM3000 說明書（美國Invitrogen 公司）的方法操作，分別轉染陰性對照質粒（NC 組）和F10 過表達質粒（OE-F10 組），以pcDNA3.1 為質粒載體。收集轉染完全的對數生長期T24 細胞進行后續研究。

1.9 CCK-8、集落刺激實驗檢測細胞增殖能力 消化、收集對數生長期的NC 組、OE-F10 組細胞，制成單細胞懸液，將轉染后的各組細胞置于96 孔板中進行培養，每組3 個復孔，每孔中加入100 μL 細胞懸液，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培育至0、24、48、72 h 時，加入10 μL CCK-8 溶液（日本Takara 公司），繼續避光孵育2 h，使用酶標儀記錄此刻450 nm 波長對應的吸光度，即OD 值，繪制細胞生長曲線。

同樣，取對數生長期的NC 組、OE-F10 組細胞以每孔1 000 個的密度接種于六孔板上，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中孵育2 周，4%多聚甲醛固定細胞20 min 后，使用0.5%結晶紫（美國Sigma 公司）進行染色，PBS 沖洗、晾干、拍照。

1.10 Transwell 檢測細胞侵襲能力 細胞轉染后，取對數生長期的NC 組、OE-F10 組細胞制備無血清的單細胞懸液，按1×105細胞數/孔（200 μL）加入transwell 上室，下室加入600 μL 含10%胎牛血清的RPMI1640 培養液，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中24 h，棉簽輕拭去未侵襲的細胞，多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗3 次，并采用0.1%結晶紫染料（美國Sigma 公司）染色20 min，再次PBS 清洗，晾干，于顯微鏡下選取合適的視野計數。

1.11 統計學處理 在這項研究中，使用單因素Cox分析、LASSO和多因素Cox回歸分析來獲得膀胱癌的預后基因。ROC 曲線和K-M生存分析用于預測模型的準確性。所有的數據處理都是基于R（4.1.3版）和Perl。相關R 包包括ggplot2、ggpubr、survival、survminer 等均從Bio Conductor 包或R 包中下載。qPCR、CCK-8、transwell、集落等實驗均重復3 次，利用graghpad prism 9.1 進行統計學分析及可視化處理，正態分布的計量資料以表示，兩組間均數比較采用t檢驗。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 失巢凋亡相關基因遺傳變異和表達 共發現516 個失巢凋亡相關基因。與癌旁組織相比，獲取到136 個差異失巢凋亡基因（67 個上調，69 個下調）（圖1A）。單因素Cox回歸分析（P<0.05）顯示136 個差異失巢凋亡基因中有52 個與生存預后相關（圖1B，P<0.001）。52 個失巢凋亡相關基因與預后的相關性表明，GKN1、ID2、CASP6、RPS6KA1 和SATB1是膀胱癌的保護性因素，而其他基因屬于危險因素（圖1C）?？截悢底儺惙治鲲@示了所有與預后相關的失巢凋亡相關基因的拷貝頻率變化（圖1D）。其中，S100A7 在所有樣本中拷貝頻率呈增加趨勢，而MSLN 的拷貝頻率則呈降低趨勢。52 個與預后相關的失巢凋亡相關基因在染色體上的位置見圖1E。

圖1 基于TCGA 膀胱癌患者失巢凋亡相關基因變異與表達Fig.1 Genetic variations and expression of ARGs based on TCGA in bladder cancer patients

2.2 失巢凋亡相關基因風險預后模型建立 對52個失巢凋亡相關基因進行降維，得到16 個基因（圖2A、B）。進一步多因素Cox分析選出9 個失巢凋亡相關風險基因（DNMT1、F10、FASN、PDGFRA、SA-TB1、MSLN、MYC、CALR、CSPG4）。9 個失巢凋亡相關風險基因的表達水平與相關系數見表2。將所有符合標準的樣本按1∶1 的比例分為訓練組（n=280）和測試組（n=279）。以訓練組中風險評分的中位數值為截斷點，將所有樣本分為高、低風險組。K-M分析顯示低風險組整體樣本、測試樣本和訓練樣本的生存生存預后均好于高風險組（圖2C～E）。兩組1、3、5年生存預后的AUC 值都大于0.6，訓練組數值高于0.7（圖2F～H）。

圖2 基于TCGA 及GSE13507 數據集建立風險預后模型Fig.2 Establishing prognostic risk model based on the TCGA and GSE13507 cohort

表2 多因素Cox 分析鑒別9 個失巢凋亡相關基因Tab.2 Nine genes identified by multivariate Cox regression analysis

2.3 列線圖創建與驗證 將膀胱癌患者的臨床特征和風險評分結合，構建一個列線圖來預測患者在1、3 和5 年的生存狀況，顯示該列線圖的良好預測性（圖3A、3B）。累積危險曲線顯示風險評分高的膀胱癌患者OS 逐漸增加（圖3C）。決策曲線分析結果顯示列線圖在預測患者預后方面的表現優于其他臨床相關特征（圖3D～3F）。

圖3 列線圖構建與驗證Fig.3 Construction and validation of nomogram

2.4 失巢凋亡相關基因免疫浸潤、免疫檢查點和腫瘤微環境分析 高風險組和低風險組之間CD8+T細胞（P=0.015）、M0 巨噬細胞（P=0.005）、M2 巨噬細胞（P=0.05）和中性粒細胞（P=0.009）的表達有明顯差異（圖4A～C）。用于構建風險模型的9 個失巢凋亡相關基因與眾多的免疫細胞有較強的關聯性（圖5A）。失巢凋亡風險評分與M0 巨噬細胞、M2 巨噬細胞和中性粒細胞呈正相關，而與濾泡輔助T 細胞、CD8T 細胞和活化NK 細胞呈負相關（圖5B）。高危組基質和免疫評分高于低危組（圖5C）。

圖4 免疫細胞浸潤分析Fig.4 Analysis of immune cell infiltration

圖5 失巢凋亡預后基因免疫檢查點及免疫微環境評估Fig.5 Evaluation of the immune checkpoint genes and immune microenvironment for anoikis-apoptotic prognostic genes

2.5 藥物敏感性分析 共得到65 種符合條件的藥物（P<0.001）。其中，低危人群對Dasatinib、Ribo ciclib、Staurosporine、Luminespib 等藥物具有敏感性（圖6A～6D），而高危人群則對Afatinib、Oxaliplatin、Gemcitabine、Paclitaxel 等藥物更為敏感（圖6E～6H）。

圖6 預測膀胱癌患者高低失巢凋亡評分組的免疫治療反應Fig.6 Prediction of immunotherapy response in high-and low-ARG scores groups in bladder cancer patients

2.6 F10 對膀胱癌細胞增殖、分化、侵襲能力的影響 生物信息學分析顯示，F10 在癌組織中呈低表達狀態（P<0.001，圖7A）。qPCR 顯示F10 基因表達在T24 膀胱癌細胞系中具有差異，于T24 細胞系中呈低表達（t=3.031，P<0.05，圖7B）。CCK-8 實驗顯示，OE-F10 組24、48、72h 細胞活力低于NC 組（0.75±0.02 比0.80±0.02，0.85±0.03 比1.05±0.06，1.01±0.02比1.49±0.04，t=2.578、5.528、19.25，均P<0.001，圖7C）。集落刺激實驗及transwell 實驗顯示，OE-F10 組侵襲、增殖能力低于NC 組（79.67±21.55 比329.67±34.84，69.67±28.54 比575.33±104.08；t=10.570，P<0.001；t=8.115，P<0.005，圖7D、7E）。

圖7 F10 抑制T24 細胞的增殖和侵襲Fig.7 F10 inhibits the proliferation and invasion of T24 cells

3 討論

膀胱癌被公認為是全世界最具侵襲性的腫瘤之一[14]。即使在最初被診斷為非肌層浸潤性膀胱癌的患者中，5 年內也有40%～50%復發，而在高危人群中高達80%[15]。肌層浸潤性膀胱癌是一種更致命的形式，復發的幾率和遠處轉移的風險更高[16]。一旦發生轉移，膀胱癌患者能夠被治愈的可能性就會進一步降低，5 年的OS 僅有6%[17]。作為生物體自身防御機制的一部分，一旦正常細胞脫離了細胞外基質，失巢凋亡的作用是防止這些細胞在不適合的地方種植和生長[18]。然而，研究發現，癌細胞可以通過各種途徑產生失巢凋亡抗性，如分泌性生長因子激活途徑、整合素表達模式的改變、活性氧對細胞因子受體的激活以及上皮-間充質轉化[19]。失巢凋亡抵抗已成為癌細胞浸潤和進展的標志。因此，膀胱癌作為高侵襲性癌癥的代表，迫切需要發現更多預后標志物，從而為潛在的藥物治療奠定基礎。

本研究本研究構建了風險預后模型，其中的基因包括DNMT1、F10、FASN、PDGFRA、SATB1、MSLN、MYC、CALR和CSPG4。DNMT1 是催化DNA 甲基化的關鍵酶之一，可引起異常的高甲基化，導致腫瘤浸潤和生長[20-21]。DNMT 還可促進上皮-間充質轉化，誘導細胞自噬，并增強腫瘤干細胞的增殖，進而使腫瘤細胞可能發生失巢凋亡抗性[22]。F10 常見于婦科惡性腫瘤轉移，具體作用機制可能是加速細胞外基質的降解，增強腫瘤細胞的侵襲性[23]。FSAN 通過脂肪酸代謝合成途徑參與骨肉瘤細胞的轉移與生長，尤其在出現肺部轉移時，腫瘤細胞出現失巢凋亡抗性[24]。PDGFRA 在結直腸癌細胞轉移、血管生成、化療抵抗中發揮了重要作用[25]。Qi 等[26]發現，SATB1 引起前列腺癌上皮-間充質轉化，并加速腫瘤細胞的耐藥性和轉移。MSLN 則在超過70%的惡性腫瘤組織中表達。雖然沒有發現MSLN 的其他功能，但學者們認為其可能參與了細胞黏附的過程，最終誘發癌細胞的遠處轉移[27]。MYC 作為一個原癌基因，參與調控細胞生長、凋亡、代謝、腫瘤發生和其他生命活動[28]。研究人員發現MYC 可能與ATF4的啟動子區域結合，觸發失巢凋亡抵抗、促進骨肉瘤細胞轉移與浸潤[29]。Gao 等[30]證明CALR 可以誘導核因子-κB 信號通路，促進肺癌細胞增殖。CSPG4參與了細胞黏附、運動和侵襲，在惡性細胞的快速浸潤和轉移中發揮了至關重要的作用[31]。

本研究根據獲得的9 個失巢凋亡相關基因建立了風險預后模型, 將這些預后基因同腫瘤微環境相聯系，發現腫瘤微環境對腫瘤細胞的發生、發展、轉移和治療反應有巨大的影響。本研究分析了不同風險組中22 種免疫細胞的比例，高風險組中巨噬細胞（M0 和M2）和肥大細胞的比例較高，低風險組中CD8+T 細胞的比例較高。免疫細胞浸潤影響膀胱癌患者的OS，以往的研究發現，巨噬細胞是實體瘤免疫浸潤的重要組成部分，伴隨著惡化潛能，往往帶來不良預后[33]。另外，也有證據表明，高CD8+T細胞浸潤往往有更好的OS[34]。Li 等[35]證明，膀胱癌患者中CD8+T 細胞高表達和M0 巨噬細胞低表達與良好的臨床預后相關。與本研究得到的結果一致。此外，構建預后模型的9 個失巢凋亡相關基因中，PDGFRA與巨噬細胞和肥大細胞呈正相關，表明PDGFRA可能在巨噬細胞相關的途徑下促進腫瘤細胞的增殖。

研究證實，F10 基因不僅在葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌中呈陽性表達，且在多種腺癌中表達陽性，包括卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等[36-37]。A549 肺癌細胞系中F10 可通過上調BCL-2 的表達增強腫瘤細胞在裸鼠體內的成瘤能力[38]，膠質瘤中F10 啟動子的高甲基化可增加腫瘤的侵襲性[39]。本研究中F10 在膀胱癌細胞中表達下調，過表達F10 的膀胱癌細胞的增殖及侵襲能力顯著受到抑制，提示F10 可能對膀胱癌的發生、發展起重要作用。

綜上所述，本研究在膀胱癌患者中發現了新的失巢凋亡靶點。這些靶點可以作為治療靶點，改善患者的生存結果。構建預后風險模型，將風險評分與腫瘤微環境結合起來，可評估膀胱癌患者的免疫狀態和免疫治療反應，有助于了解失巢凋亡相關基因的潛在病理機制，為膀胱癌患者的治療方案帶來新的選擇。