熱休克蛋白70結合蛋白1誘導星形膠質細胞內源性突變亨廷頓蛋白積聚

彭希，覃禹森，嚴麗，靜亮

亨廷頓?。℉untington’s disease，HD）中，選擇性神經元丟失首先發生于紋狀體的棘狀神經元，然后隨疾病的進展波及其他腦區[1]。棘狀神經元受皮質神經元的谷氨酸能軸突支配，因此易受到谷氨酸介導興奮性毒性影響[2]。神經系統的大多數細胞是支持神經元生存的膠質細胞，其中星形膠質細胞是神經膠質細胞的主要類型[3]。星形膠質細胞能夠表達谷氨酸轉運體，主動攝取細胞外和突觸間隙的谷氨酸以防止其神經毒性[4,5]。生理狀態下，星形膠質細胞能夠從神經內分泌角度維持正常的神經元功能。HD 中，突變亨廷頓蛋白（mutant Huntingtin，mHTT）過表達于神經元并產生年齡依賴的神經病理性損傷[6]。以上現象引出一個關鍵問題，即星形膠質細胞內源性表達mHTT 是否產生病理性損傷。

當前HD 小鼠模型在研究星形膠質細胞內源性mHTT作用方面存在局限性，多為mHTT選擇性在神經元中過表達，或在神經系統中廣泛表達[7]。我們在前期研究中構建了星形膠質細胞中特異性表達mHTT N’端片段的轉基因小鼠膠質纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）-HD[8]。盡管該小鼠mHTT的表達水平較低，但依然可以表現出年齡依賴的HD病理特點。本研究選用該模型探討星形膠質細胞在HD病理性進展中的作用。

我們的前期研究發現，熱休克蛋白70結合蛋白1（heat shock protein 70 binding protein 1，HspBP1）通過抑制神經元泛素化功能誘導mHTT 積聚。同時，HspBP1 在神經元和神經膠質細胞中存在差異性表達[9]。該發現引出新的假設，即星形膠質細胞中HspBP1的低水平表達能否解釋其較少出現mHTT 積聚和功能障礙。因此，我們利用腺相關病毒（Adeno associated virus，AAV）轉導技術在4 月齡GFAP-HD 小鼠紋狀體星形膠質細胞中過表達HspBP1，結果顯示星形膠質細胞短期內即出現mHTT 積聚以及年齡依賴的運動功能障礙。因此HspBP1誘導星形膠質細胞中mHTT增加可能是HD病理性損傷的關鍵因素。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 主要試劑 小鼠抗亨廷頓蛋白抗體（mEM48）由本實驗室制備并保存。兔抗NeuN（ABN78）、兔抗GFAP（AB5804）購于Millipore 公司，兔抗HspBP1（HPA071444）、小鼠抗 Vinculin（V9131）購于Sigma-Aldrich公司；HRP和AlexaFluor 488/594標記的抗鼠、抗兔IgG 購于Jackson 實驗室；DAPI、DAB 試劑盒（D4418）購于Sigma-Aldrich公司；

1.1.2 質粒、病毒 我們在pAAV-GFAP104-mCherry載體（Addgene）的EcoRI 和XbaI 克隆位點中插入HspBP1 cDNA 以獲得pAAV-GFAP-HspBP1 質粒。同時利用相同的方法插入GFP cDNA 以獲得對照組pAAV-GFAP-GFP 質粒。以上2 種AAV 克隆均通過AAV9 包裝載體制備，并由Emory 大學病毒載體中心（Virus Vector Core）制備和擴增。AAV-GFAP-HspBP1和AAV-GFAP-GFP的滴度分別為8.8×1013vg/mL、2.8×1014vg/mL。

1.1.3 實驗動物 GFAP-HD 轉基因小鼠在星形膠質細胞內特異性表達mHTT。C57BL/6J（野生型）小鼠由本實驗室保存。實驗小鼠均保存于Emory大學無菌級動物實驗中心，并根據Emory 大學動物管理委員會指南飼養和維護。本研究中全部動物實驗均由Emory大學動物資源部批準。

1.2 方法

1.2.1 立體定位注射 實驗用小鼠經2.5%異氟醚麻醉后，將頭部固定在Kopf立體定位框架（1900型）中，該框架配有數字機械手、UMP3-1型注射泵和10-μL漢密爾頓微量注射器，使用33 G針頭進行注射。手術過程中給予美洛昔康（5 mg/kg）鎮痛。以前囟設置為坐標0點；選取以下坐標定位胼胝體：X=±1.5 mm、Y=－0.55 mm、Z=－1.0 mm；紋狀體：X=±2.0 mm、Y=－0.55 mm、Z=－3.5 mm。注射前使用PBS 將病毒滴度校正為1.0×1014vg/mL，病毒溶液的注射速度為0.2 μL/min，每次注射后留針5 min 以減少提針后病毒溶液沿針道擴散。手術結束后，將小鼠轉移到37 ℃溫控加熱墊上，每隔15 分鐘監測1 次，直到完全蘇醒。注射完畢后每日檢測小鼠狀態，必要時給予美洛昔康（5 mg/kg/d）鎮痛。注射4周后，腹腔注射戊巴比妥（200 mg/kg）處死小鼠，分離腦組織進行后續實驗。

1.2.2 免疫組織化學和免疫熒光染色 取小鼠新鮮腦組織，4%多聚甲醛4 ℃固定過夜后，使用30%蔗糖4 ℃脫水48 h。－20 ℃將腦組織切片成20 μm。漂片法使用0.3%Triton X-100 在37 ℃破膜15 min，用0.01 M 的檸檬酸鈉在95 ℃孵育15 min行抗原修復。4%胎牛血清37 ℃封閉抗原1 h，PBS 振蕩洗滌3 次后，4 ℃孵育一抗過夜。37 ℃孵育二抗1 h。免疫組織化學染色通過DAB 試劑盒顯色。免疫熒光染色37 ℃DAPI 染色10 min。以上結果均使用Zeiss Axiovert 200 MOT顯微鏡進行觀察。

1.2.3 Western Blot 取新鮮小鼠腦組織，RIPA 裂解30 min。期間超聲處理3 次，30 s/次。經BCA 法滴定蛋白質含量。將等量蛋白質電泳和轉膜后，4 ℃一抗孵育過夜。PBS洗滌3次后，二抗37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次后，用ECL溶液（KwikQuant）顯色。以上圖像使用KwikQuant軟件采集。

1.2.4 行為學實驗 隨機選擇2 月齡的野生型和GFAP-HD 小鼠，每種基因型使用12 只小鼠（雌雄各半）。每種基因型小鼠隨機分為AAV-GFAP-GFP 和AAV-GFAP-HspBP1 組后分別于雙側紋狀體立體定位注射AAV-GFAP-GFP 或AAV-GFAP-HspBP1。注射2周后開始行為學實驗準備。實驗動物連續訓練3天后開始正式測試。每次測試均重復3 次，取平均值進行統計學分析。分別進行旋轉桿、平衡木和握力實驗檢測小鼠運動功能。旋轉桿實驗中，小鼠連續3 天在旋轉棒（Rotamex 4/8，Columbus Instruments International）上以5 rpm 的速度進行預訓練，10 min/次。實驗小鼠訓練3 d 后開始正式測試：將旋轉桿的速度設置為5 rpm，以0.1 rpm/s 的速度遞增，記錄3 次小鼠落地時間。平衡木測試中，平衡木為長1 m，寬6 mm的木條，置于距離桌面上方50 cm 處的2 根木桿上。平衡木的一側放置黑盒用作測量終點。如前所述，3 次預訓練后，正式實驗中通過計時器測量小鼠穿過平衡木中點所需的時間[10]。握力測試通過握力測量儀（Ametek Chatillon）直接測量。每次行為學實驗前測量小鼠體質量。每隔1月進行1次上述檢測。所有行為學實驗均按照美國國立衛生研究院的指南進行，并得到Emory大學動物管理委員會批準。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism7 軟件處理數據。符合正態分布以及方差齊性的計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本均數t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GFAP-HD小鼠星形膠質細胞中表達mHTT

前期研究發現，mHTT在HD小鼠星形膠質細胞中表達時較少出現神經元特異性積聚現象[11,12]。GFAP-HD 轉基因小鼠模型為本實驗室前期構建的特異性在GFAP 啟動子控制下表達mHTT 的動物模型。GFAP啟動子是一種星形膠質細胞特異性啟動子，能夠驅動星形膠質細胞表達各種基因[13,14]。本模型中使用的mHTT基因為編碼N’端208個氨基酸且攜帶160個谷氨酰胺（Q）的cDNA片段，該片段已被證實具有較強毒性[15]。為驗證轉基因mHTT-160Q 在星形膠質細胞中的表達，我們采用4月齡GFAP-HD小鼠進行立體定位注射，注射4周后紋狀體區腦片進行免疫組化染色，結果提示GFAP-HD 轉基因小鼠的紋狀體中mHTT 表達水平極低，且未見到mHTT 的積聚，見圖1。該結果反映了mHTT在星形膠質細胞中的表達和積聚受到限制。

圖1 HspBP1增加紋狀體星形膠質細胞中mHTT表達和積聚

2.2 GFAP-HD小鼠星形膠質細胞中過表達HspBP1誘導mHTT積聚

為了檢測HspBP1 過表達的體內效應，我們在GFAP-HD小鼠的右側紋狀體進行AAV-GFAP-HspBP1的立體定位注射。作為對照，AAV-GFAP-GFP被注射到左側紋狀體（圖2A）。Western blotting顯示AAV病毒能有效地轉導HspBP1（圖2B）。免疫組化染色顯示注射的腦區（皮質、胼胝體和紋狀體）均顯示出明顯的HspBP1抗體染色（圖2A）。更重要的是，免疫熒光染色顯示AAV-GFAP-HspBP1 感染后，紋狀體星形膠質細胞中mHTT的表達明顯增加并且出現核內積聚（圖1）。前期研究中，我們從GFAP-HD小鼠腦組織中分離星形膠質細胞進行原代培養，感染AAV-GFAP-HspBP1后，GFAP和mHTT的免疫熒光共染色證實mHTT在星形膠質細胞中的積聚[16]。以上現象在皮質和胼胝體內得到證實（圖3）。同時，GFAP-HD 小鼠在AAV-GFAP-HspBP1注射后沒有出現NeuN 及GFAP 的變化（圖2C）。該結果提示，神經元內不表達mHTT時，僅增加mHTT在星形膠質細胞中的積聚并不會產生嚴重的星形膠質細胞活化和神經元損傷。

圖2 星形膠質細胞中過表達HspBP1

圖3 HspBP1增加皮質和胼胝體星形膠質細胞中mHTT表達和積聚

2.3 GFAP-HD小鼠星形膠質細胞中過表達HspBP1誘導神經病理性改變

前期研究表明，GFAP-HD 小鼠在沒有神經元內mHTT積聚的情況下依然能夠出現年齡依賴性運動功能障礙，但該現象在小鼠13 個月大之前并不明顯[8]。因此，GFAP-HD小鼠的運動障礙表型可能是由星形膠質細胞內mHTT積聚引起的。為了探討增加星形膠質細胞中HspBP1 表達能否加速GFAP-HD 小鼠表型，我們將AAV-GFAP-HspBP1注入2月齡GFAP-HD和野生型小鼠的雙側紋狀體后監測其運動功能，對照組為AAV-GFAP-GFP 注射的GFAP-HD 和野生型小鼠。紋狀體對于運動協調功能非常重要，改變mHTT 在紋狀體中的表達可以影響HD 小鼠的運動功能[17]。我們觀察到與注射AAV-GFAP-GFP 的對照組相比，注射AAV-GFAP-HspBP1的GFAP-HD小鼠出現更早（5-6月齡）的轉桿和平衡木以及握力下降。同時，注射AAVGFAP-HspBP1 的GFAP-HD 和野生型小鼠之間無明顯差異。不同小鼠組間體質量未見明顯差異，見圖4。

圖4 HspBP1誘導星形膠質細胞神經病理性損傷，導致運動功能障礙

3 討論

早期研究表明，星形膠質細胞攝取谷氨酸的能力對于防治谷氨酸興奮性神經毒性起重要作用。HD 中星形膠質細胞過表達mHTT 可以影響多種細胞功能，如基因轉錄、神經遞質重攝取、膜通道活性和神經營養因子釋放[18,19]，進而誘導嚴重的病理性損傷[20,21]。我們早期的研究表明，mHTT 可以影響星形膠質細胞對谷氨酸的攝取。然而，星形膠質細胞內源性mHTT 過表達能否直接誘導神經病理性表型目前仍有待研究。這對于驗證星形膠質細胞在HD 中的致病作用尤為重要。

前期研究發現，mHTT在HD小鼠星形膠質細胞中較少出現過表達或積聚[7,11]。GFAP-HD 轉基因小鼠能夠在星形膠質細胞中特異性表達mHTT，但mHTT 陽性細胞數目較少提示mHTT在星形膠質細胞中的表達受到限制。前期研究中我們同時比較了不同年齡階段GFAP-HD小鼠星形膠質細胞mHTT表達水平，結果顯示隨年齡增加，mHTT 在星形膠質細胞的細胞質和細胞核中分布并形成聚集體，該現象在野生型小鼠星形膠質細胞中未見。因此，我們推測調控HD 星形膠質細胞過表達mHTT可能加速病理性損傷。

HspBP1 在星形膠質細胞表達水平遠低于神經元，使其可能成為星形膠質細胞清除mHTT 的關鍵因素[9,22]。本研究的結果證實了以上假設。GFAP-HD 星形膠質細胞中HspBP1 的過表達加速了mHTT 的積聚。GFAP-HD 小鼠的年齡依賴性神經表型為體重減輕、運動功能障礙和駝背外觀[8]。一旦GFAP-HD 小鼠表現出明顯的運動缺陷，它們的行為表型就會逐漸惡化，并通常在出現嚴重癥狀后1～2 周死亡。我們在2月齡時將AAV-GFAP-HspBP1 或AAV-GFAP-GFP 病毒注入野生型和GFAP-HD 小鼠的兩側紋狀體后監測其運動功能。結果顯示過表達GFAP-HspBP1 的GFAP-HD 小鼠出現更早的運動協調能力（轉桿、平衡木和握力）下降，但是并未觀察到體重減輕。同時免疫染色未見明顯的神經元損傷或星形膠質細胞活化。該結果提示過表達HspBP1 能夠誘導星形膠質細胞mHTT 積聚加速年齡依賴性運動功能障礙；但mHTT在神經元和星形膠質細胞中共同表達是神經元顯著變性的必需條件。

本研究首次證實HspBP1 能夠通過促進星形膠質細胞內源性mHTT積聚介導HD 病理性損傷。該結果提示維持星形膠質細胞正常功能對于治療HD具有重要意義。

致謝：本文部分工作在美國Emory大學李曉江教授實驗室完成。