Maresin1通過抑制JAK2/STAT3信號通路減輕糖尿病大鼠視網膜神經炎癥反應

張博，李鳳君，劉學政，左中夫

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）主要由血管系統改變和炎癥引起[1]。炎癥的重要過程之一是細胞的快速遷移[2]。Müller 細胞是視網膜內主要的膠質細胞，其在糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）病理生理過程中能被激活[3]。Müller細胞在DR中被激活的最顯著跡象之一是膠質纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）表達的增加[4]。Müller 細胞激活能促進炎性因子分泌，引發強烈的內源性炎癥級聯反應，引起DR的發生和發展[5]。

JAK/STAT 通路參與調節多種生物學效應[6]。JAK/STAT 通路激活能促進炎癥，誘導多種反應[7]。研究表明，JAK/STAT 通路在DM 中被激活，其中JAK2/STAT3 亞型是目前研究最廣泛和深入的一種[8]。但JAK2/STAT3通路對DR的影響尚不清楚。

Maresin1（MaR1）是從omega-3脂肪酸中提取的一種生物活性分子[9]，是一種在炎癥緩解過程中活躍的脂質介質，在多種疾病中有抗炎效果。MaR1已被證明可通過對抗淀粉樣β蛋白介導的炎癥沉積，減緩慢性退行性疾病阿爾茨海默病的進展[10]。但MaR1是否參與DR炎癥反應有待探討。本實驗擬探討MaR1 及JAK2/STAT3通路是否參與DR的形成發展及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，購自錦州醫科大學實驗動物中心[SCXK(遼)2019-003]，體質量180～200 g。將大鼠置于溫度22～24 ℃、濕度50%～60%、12 h光/12 h暗循環的環境中，自由食水。實驗遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.1.2 主要試劑與儀器 Maresin1購于Cayman公司；鏈脲佐菌素（STZ）購于Sigma 公司；JAK2/STAT3 通路激活劑colivelin 購于吉爾生化公司；JAK2、STAT3、p-JAK2、白細胞介素（interleukin，IL）-1 β 抗體購于Abcam 公司；p-STAT3、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α抗體購于Affinity公司；HE染色試劑盒和Western blot 二抗購于Solarbio 公司；SP、DAB 試劑盒購于中杉金橋公司；ELISA 試劑盒購于MLBIO公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購于Beyotime公司；倒置顯微鏡購于Olympus公司；石蠟切片機購于SLEE公司；水平電泳儀購于BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 DM大鼠模型建立及分組給藥 大鼠適應性飼養數天，禁食水12 h，采用腹腔注射STZ（50 mg/kg）制備DM 大鼠模型[11]。3 d 后血糖≥16.7 mmol/L 的大鼠為造模成功，納入后續研究。入組大鼠隨機分為4組，每組10 只：對照組（Con 組）、糖尿病組（DM 組）、Maresin1預處理組（MaR1組）和Maresin1+colivelin組（colivelin 組）。DM 成模后，給與MaR1 組大鼠MaR1（4 ng/g）腹腔注射，2 次/周；Con 組和DM 組給予等量PBS注射[12]；colivelin組大鼠在MaR1組給藥的基礎上，將大鼠麻醉后用微量進樣器向玻璃體內一次性注射colivelin 5 μL（10－4μmoL/L）[13]。12周后取材。

1.2.2 標本收集 采用戊巴比妥鈉（10 g/L）腹腔注射麻醉大鼠。一部分大鼠用4%多聚甲醛灌流1.5～2 h，取眼球放至固定液中，置于－4 ℃冰箱48 h，將組織轉移到蔗糖溶液中脫水后，石蠟包埋，備于HE 和免疫組化染色；一部分大鼠取新鮮視網膜組織進行ELISA 檢測和Western blotting檢測。

1.2.3 視網膜組織病理形態學檢測 采用HE 檢測視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell，RGC）數量。眼球石蠟切片脫水后蘇木素溶液染色5 min，鹽酸乙醇分化30 s，伊紅染色2 min，流水沖洗5 min，酒精和二甲苯溶液脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組織化學檢測視網膜GFAP蛋白表達 眼球石蠟切片經二甲苯脫蠟、乙醇水合?？乖迯痛謴褪覝?，3%H2O2避光反應10 min。PBS 清洗3 次。滴加山羊血清工作液30 min。用抗GFAP 抗體（1∶300）4 ℃孵育過夜（＞18 h）。次日復溫1 h，二抗孵育1 h，PBS 清洗，鏈霉素親和素孵育1 h。DAB 顯色，蘇木素復染。酒精和二甲苯溶液脫水透明。中性樹膠封片。

1.2.5 ELISA 法測定視網膜組織IL-6、IL-1β和TNF-α含量 向新鮮視網膜中加入RIPA 裂解液，收集上清，于4 ℃、12000 rpm 離心20 min。按照說明書加液后37 ℃水浴60 min。棄去液體，每孔加入A 液B 液混勻后反應15 min。加入終止液，以450 nm波長測OD值。

1.2.6 Western blot檢測視網膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α、p-JAK2、JAK2、p-STAT3 和STAT3 蛋白表達水平收集上清同ELISA法。BCA試劑盒測定蛋白濃度。電泳、轉膜?？笽L-6抗體（1∶1000）、抗IL-1β抗體（1∶2000）、抗TNF-α抗體（1∶1000）、抗p-JAK2抗體（1∶4000）、抗JAK2抗體（1∶5000）、抗p-STAT3 抗體（1∶4000）、抗STAT3 抗體（1∶5000）以及β-actin和GAPDH內參（1∶4000）在4 ℃孵育過夜（＞18 h）。次日用TBST洗膜，二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，ECL顯影。用ImageJ軟件分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 25.0 軟件處理數據。符合正態分布以及方差齊性的計量資料以（±s）表示，多組比較方法采用單因素方差分析；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MaR1改善了糖尿病大鼠視網膜形態

HE染色顯示，Con組視網膜平整，RGC密集。DM組RGC 數量明顯減少。與DM 組相比，MaR1 組RGC數量增多。colivelin 組較MaR1 組RGC 數量明顯減少，見圖1。

圖1 大鼠視網膜HE染色

2.2 MaR1抑制了糖尿病大鼠視網膜GFAP的表達

免疫組織化學和Western blot 結果顯示，DM 組大鼠的視網膜中，Müller 細胞大量被激活，GFAP 表達增多（P＜0.01）；MaR1 組大鼠視網膜GFAP 表達明顯減少（P＜0.01）；Colivelin 組較MaR1 組GFAP 表達增多（P＜0.01），見圖2、圖3。

圖2 免疫組化檢測大鼠視網膜GFAP表達

2.3 MaR1 抑制了糖尿病視大鼠網膜炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達

ELISA和Western blot結果顯示DM組IL-6、IL-1β、TNF-α的水平增高（P＜0.01）；MaR1 組IL-6、IL-1β、TNF-α的表達水平顯著下降（P＜0.01）；與MaR1 組相比，colivelin組IL-6、IL-1β、TNF-α的表達水平上升（P＜0.01），見圖4、圖5。

圖4 ELISA檢測大鼠視網膜組織中IL-6、IL-1β、TNF-α因子的表達

圖5 Western blot檢測大鼠視網膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α的表達水平

2.4 MaR1 抑制了糖尿病大鼠視網膜JAK2/STAT3 通路蛋白表達水平

Western blot 結果顯示DM 組JAK2 和STAT3 磷酸化增加，p-JAK2 和p-STAT3 表達上調（P＜0.01）。MaR1 治療12 周后，p-JAK2 和p-STAT3 表達下調（P＜0.01）。在MaR1 組基礎上給予JAK2/STAT3 通路激活劑colivelin 后，MaR1 的保護作用被逆轉（P＜0.01）。4組的JAK2、STAT3 總表達無改變。提示DM 大鼠的JAK2/STAT3 通路被激活，磷酸化增加，而MaR1 能有效抑制JAK2和STAT3磷酸化，見圖6。

圖6 Western blot檢測大鼠視網膜組織p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3的表達水平

3 討論

近年來研究發現Müller 細胞參與了DR 的發病機制，被認為是神經血管功能障礙的一種形式[14,15]。炎癥激活Müller 細胞并破壞組織穩態。在DR 的持續過程中，Müller 細胞中炎性細胞因子的產生和消除之間的微妙平衡被破壞，導致細胞損傷和疾病惡化[16]。在DR中，RGC 數量減少，同時GFAP 上調，視網膜神經膠質反應性增強，促進炎癥細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的產生。MaR1 在DM 大鼠模型中抑制Müller 細胞炎癥反應。因此，控制炎癥反應可能對DM 患者預防或減輕視網膜損傷起到重要作用。

MaR1 是由巨噬細胞通過人12-脂氧合酶從二十二碳六烯酸中產生，具有強大的促分解和組織穩態作用[17]。文獻報道促分解介質可以減輕DM 的疾病變化，包括炎癥[18]。研究表明，MaR1 具有強大的抗炎和促解毒活性，包括抑制Müller 細胞的活化[19]。視網膜神經膠質細胞的激活與缺血、神經損傷、炎性因子等視網膜疾病引起的神經元損傷有關。此外，我們的研究發現MaR1 顯著改善節細胞排列紊亂，抑制STZ 誘導的Müller細胞激活和炎癥反應，并有助于DR的治療。

炎癥是Müller細胞激活和膠質細胞增生的首要反應，釋放的大量因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等，引起炎癥反應[3]。在DR 中，我們發現MaR1 可以降低GFAP的上調。但是MaR1 和JAK2/STAT3 通路激活劑colivelin 聯合用藥后，與MaR1 組相比，神經膠質細胞GFAP升高。免疫組化發現MaR1組較DM組的GFAP表達降低，而colivelin組較MaR1 組的GFAP 表達水平增加，所以MaR1可能是通過降低DR的Müller細胞激活減輕炎癥。Müller 細胞是IL-1β產生的關鍵來源。神經膠質細胞對IL-1β極其敏感，并在這種促炎細胞因子的作用下迅速發展為細胞死亡。除了IL-1β，Müller細胞還產生其他促炎細胞因子如TNF-α和IL-6[20]。本研究以MaR1 處理DR 大鼠，降低了視網膜組織中IL-6、IL-1 β 和TNF-α 蛋白表達。然而，以MaR1 和JAK2/STAT3 通路激活劑colivelin 聯合處理DR 大鼠，可增強IL-6、IL-1β和TNF-α炎癥因子的釋放，表明MaR1 抑制DR 大鼠炎癥反應，是下調JAK2/STAT3 通路的因素。

JAK2/STAT3 信號通路的激活作為炎癥中的一個重要信號，可促進神經膠質細胞的活化，在嚙齒動物DR模型的進展中發揮關鍵作用[21]。但目前MaR1通過JAK2/STAT3 信號通路對DR 保護作用的影響尚未報道。本實驗表明，DR 中p-JAK2 和p-STAT3 表達上調。在MaR1 治療后，p-JAK2 和p-STAT3 表達下調。MaR1 和通路激活劑colivelin 聯合干預后，p-JAK2 和p-STAT3蛋白表達較MaR1組明顯下調，說明MaR1可能通過抑制JAK2 和STAT3 的磷酸化，下調JAK2/STAT3通路活性。

綜上所述，本研究證實MaR1可抑制JAK2/STAT3信號通路的激活，減少GFAP和促炎因子的表達，有助于減輕DM 大鼠的視網膜損傷。MaR1 可能有助于減輕DM炎癥的進展，是緩解DR的一種潛在新方法。