棉酚對雄性肉仔雞生長性能、血清抗氧化能力及腎臟病理組織形態的影響

李啊詩，劉 盼，張新楠，胡雨露，李玉杰，趙 揚，吳尚澤，賀建忠，張夢迪

（塔里木大學動物科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300）

我國是世界上最大的棉花生產國， 全國大部分地區都有棉花種植， 新疆維吾爾自治區是我國棉花主產區，2022 年產量已經占到全國棉花總產量的87.7%［1］。副產品棉籽經加工可制成粗蛋白含量高達40%～45%的棉籽粕餅，是一種物美價廉的非常規植物蛋白飼料原料［2］， 但棉籽粕中含有游離棉酚（free gossypol，FG）和多種抗營養因子，營養成分不平衡，這使其在肉雞飼料中的應用受到極大的限制［3］。 FG 的過量攝入不僅造成家禽肝臟和腎臟損傷、生產力下降，還導致中毒，嚴重時出現猝死，甚至可通過食物鏈危害人類健康［4］。 《飼料衛生標準》（GB 13078—2017）［5］規定家禽（產蛋禽除外）配合飼料產品中FG 的限量值≤100 mg/kg。 目前關于棉酚對肉仔雞的作用研究大多集中于生理學和形態學方面， 對機體抗氧化能力的影響研究并不全面，致病機理也不清楚。 研究發現氧化應激是導致疾病發生的關鍵因素之一。 當機體抗氧化能力減弱或體內活性氧自由基水平異常增加時，會引起細胞死亡，甚至導致機體各組織臟器的損傷［6-7］。 棉酚已被證明可以誘導多種動物的臟器損傷，降低生產性能，增加死淘率［8-11］。 為了解棉酚的不當添加對肉仔雞在生理學、組織學水平的毒性作用和對實質性器官抗氧化能力的影響，本研究通過給肉仔雞灌服不同濃度棉酚，建立棉酚中毒的病理模型，觀察不同劑量棉酚對不同生長階段肉仔雞生長性能、血清抗氧化能力及腎臟病理組織形態的影響，以期為棉籽粕在肉雞養殖中的合理應用積累基礎試驗數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

48 只同批次1 日齡健康良鳳花雄性肉仔雞，購自新疆維吾爾自治區阿克蘇地區某種雞場。

1.1.2 主要試劑

醋酸棉酚，購自成都康邦生物科技有限公司，純度為98%。根據現配現用原則，用蒸餾水將醋酸棉酚稀釋成20 mg/mL 的棉酚稀釋液，按照相應平均體重給肉仔雞灌胃。 血清過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒，購自索萊寶物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設備

SYNERGY 型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司產品；DM750 型顯微鏡，德國徠卡相機股份公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

采用單因素完全隨機試驗設計， 根據體重相近原則，將48 只肉仔雞分為4 組：對照組（C）、低劑量組（L）、中劑量組（M）、高劑量組（H），每組4個重復， 每個重復3 只。 在飼喂基礎日糧的基礎上，C 組以及L 組、M 組、H 組每天8:00 分別灌胃蒸餾水以及100、150、200 mg/（kg·BW）棉酚1 次，直至20 日齡，共灌胃20 d。 基礎日糧組成及營養水平見表1。

1.2.2 飼養管理

試驗在塔里木大學動物試驗站進行。雞舍、雞籠充分消毒， 試驗肉仔雞在溫度28～35 ℃、 濕度50%～70%和充足光照等條件下， 分別在標有C組、L 組、M 組和H 組標記的雞籠中分籠飼養，每籠12 只雞，自由進食、飲水。每日觀察肉仔雞健康狀況，并做好記錄。 全期不進行免疫。

日糧組成玉米/%豆粕/%玉米蛋白粉/%花生粕/%豆油/%小麥/%魚粉/%石粉/%磷酸氫鈣/%食鹽/%預混料/%合計含量55.00 17.50 6.50 6.00 3.50 5.50 2.00 1.50 1.20 0.30 1.00 100營養水平代謝能/（MJ/kg）粗蛋白/%粗纖維/%蛋氨酸/%賴氨酸/%鈣/%總磷/%含量11.83 19.50 5.00 0.45 1.10 0.60～1.20 0.45

1.2.3 血液及腎臟組織樣品采集

分別于6、11、16 和21 日齡進行樣品采集：采樣前1 天晚上從每組隨機選取3 只體重接近組內平均體重的肉仔雞禁水禁食，采樣當天8：00對肉仔雞空腹稱重并記錄后，頸靜脈采血，血液樣本靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min， 分離血清并置于-20 ℃冰箱保存備用。 采血后對雞只進行安樂死處理，用鑷子摘取腎臟，剪取大小適合（2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm）的腎臟組織，用濾紙吸取表面血液后放入4%多聚甲醛溶液中固定保存。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 生長性能指標

每天8：00 對肉仔雞稱重并記錄后，進行棉酚灌服， 當天23：00 記錄各組雞只的采食量后供應飼料，全天水、料不限量。 計算平均日增重（average daily gain，ADG）和平均日采食量（average daily feed intake，ADFI）， 然后計算料重比（feed to gain ratio，F/G）。 肉仔雞死淘時記錄死淘雞只體重和該欄剩余飼料重，用于校正生長性能數據。

1.2.4.2 血清抗氧化能力指標

將保存的血清進行抗氧化酶GSH-Px 和CAT 的活力測定，所有操作均按照試劑盒說明書步驟進行。

1.2.4.3 腎臟病理組織切片的制備及觀察

將采集的腎臟組織制作HE 染色切片（haematoxylin and eosin，HE）， 觀察腎臟的組織病理學變化。將固定的組織從多聚甲醛中取出，經沖洗、脫水、透明、浸蠟、修整切塊后，再將修整好的組織塊放入石蠟中包埋，然后切片。在切片機上將組織塊切成5～6 μm 厚的切片，然后經過二甲苯和不同梯度的酒精（100%～70%）脫水透明，再用蘇木素-伊紅染色，最后用中性樹膠封片，在三目顯微鏡下觀察。

1.3 數據統計分析

生長性能和血清抗氧化酶活力試驗數據經Excel 2019 軟件初步整理后，采用Graphpad Prism 5 統計學軟件， 先進行One-Way ANOVA 單因素方差分析， 然后采用Tukey′s Multiple Comparison Test 進行組間多重比較。P<0.05 認為差異顯著，P<0.01 認為差異極顯著，P>0.05 認為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 棉酚對雄性肉仔雞生長性能的影響

由圖1 可知，1～20 日齡階段，L 組的料重比呈上升趨勢，H 組的料重比呈波動性變化， 二者的料重比均高于C 組；M 組的料重比在1～15 日齡呈上升趨勢，其間料重比高于C 組，但在16～20 日齡呈負增長。

圖1 1～20 日齡各組肉仔雞料重比的變化趨勢

由圖2A 可知，1～5 日齡階段，L 組、M 組和H組的料重比極顯著（P<0.01）高于C 組，L 組、M 組和H 組之間差異不顯著（P>0.05）；由圖2B 可知，6～10 日齡階段，L 組、M 組和H 組的料重比極顯著 （P<0.01） 高于C 組，M 組和H 組極顯著 （P<0.01）高于L 組，H 組極顯著（P<0.01）高于M 組；由圖2C 可知，11～15 日齡階段，L 組、M 組和H 組的料重比極顯著（P<0.01）高于C 組，M 組極顯著（P<0.01）高于L 組和H 組，H 組顯著（P<0.05）高于L 組；由圖2D 可知，16～20 日齡階段，L 組和H組的料重比極顯著（P<0.01）高于C 組，H 組極顯著（P<0.01）高于L 組，M 組的料重比呈負增長，與C 組，L 組和H 組差異極顯著（P<0.01）。

圖2 不同劑量棉酚對不同生長階段雄性肉仔雞料重比的影響

2.2 棉酚對雄性肉仔雞血清抗氧化能力的影響

2.2.1 棉酚對雄性肉仔雞血清CAT 活力的影響

由圖3 可知，6～21 日齡階段，C 組的血清CAT活力呈上升趨勢，L 組、M 組和H 組的血清CAT活力呈下降趨勢；6 日齡時，L 組、M 組和H 組的血清CAT 活力高于C 組；之后隨著灌胃天數的增加，L 組、M 組和H 組的血清CAT 活力均低于C組；11～21 日齡階段，M 組的血清CAT 活力下降幅度大于L 和H 組。

圖3 6～21 日齡雄性肉仔雞血清CAT 活力的變化趨勢

由圖4A 可知，6 日齡時，L 組、M 組和H 組的血清CAT 活力均高于C 組，H 組的血清CAT 活力最高，顯著（P<0.05）高于C 組；由圖4B 可知，11日齡時，L 組、M 組和H 組的血清CAT 活力均低于C 組，L 組的血清CAT 活力最低，顯著（P<0.05）低于C 組；由圖4C 和4D 可知，16 日齡和21 日齡時，L 組、M 組和H 組的血清CAT 活力均極顯著（P<0.01）低于C 組。6、11、16 和21 日齡時L 組、M組和H 組的血清CAT 活力兩兩相比差異均不顯著（P>0.05）。

圖4 不同劑量棉酚對不同日齡雄性肉仔雞血清CAT 活力的影響

2.2.2 棉酚對雄性肉仔雞血清GSH-Px 活力的影響

由 圖5 可 知，6～21 日 齡 階 段，C 組 的 血 清GSH-Px 活力呈上升趨勢，L 組、M 組和H 組的血清GSH-Px 活力呈下降趨勢；6 日齡時，L 組、M 組和H 組的血清GSH-Px 活力稍高于C 組，但各組差距不明顯； 之后隨著灌胃天數的增加，L 組、M組和H 組的血清GSH-Px 活力均低于C 組，L 組的血清GSH-Px 活力稍高于M 組和H 組，而M 組和H 組的血清GSH-Px 活力差距較小。

圖5 6～21 日齡雄性肉仔雞血清GSH-Px 活力的變化趨勢

由圖6A 可知，6 日齡時，L 組、M 組和H 組的血清GSH-Px 活力均稍高于C 組， 各組差異不顯著（P>0.05）；由圖6B 可知，11 日齡時，L 組的血清GSH-Px 活力顯著（P<0.05） 低于C 組，M 組和H組的血清GSH-Px 活力極顯著 （P<0.01） 低于C組，L 組、M 組和H 組之間兩兩比較差異不顯著（P>0.05）； 由圖6C 可知，16 日齡時，L 組、M 組和H 組的血清GSH-Px 活力均極顯著（P<0.01）低于C 組，L 組、M 組和H 組之間兩兩比較差異不顯著（P>0.05）； 由圖6D 可知，21 日齡時，L 組、M 組和H 組的血清GSH-Px 活力均極顯著（P<0.01）低于C 組，L 組的血清GSH-Px 活力顯著（P<0.05）高于H 組，極顯著（P<0.01）高于M 組。

圖6 不同劑量棉酚對不同日齡雄性肉仔雞血清GSH-Px 活力的影響

2.3 腎臟病理組織學分析

由圖7A 可知，21 日齡時，C 組肉仔雞的腎臟結構完整， 腎小管和腎小球發育良好， 無明顯病變；L 組、M 組和H 組肉仔雞的腎臟存在明顯的病理學變化（見圖7B、圖7C、圖7D）：腎小球腫脹，腎小囊間隙變窄， 腎間質增寬， 有較多淋巴細胞浸潤，腎小管內皮細胞壞死、細胞核結構消失等。 M和H 組的腎小球腫脹與腎小囊間隙狹窄程度較L組明顯，M 組腎小管內皮細胞壞死、細胞核結構消失較H 組嚴重，因此，3 個棉酚灌胃組肉仔雞腎組織受損傷程度為M 組>H 組>L 組。

圖7 21 日齡雄性肉仔雞腎臟病理組織學檢查（HE 染色，10×63）

3 討論

3.1 棉酚對雄性肉仔雞生長性能的影響

料重比可以反映飼料的質量與飼喂效果。 料重比愈低，飼料的質量與飼喂效果愈好，畜禽生長性能越好。 鄒琳等［9］研究表明，棉茬地長期放牧會降低山羊的生產性能。 Zeng 等［12］在肉鴨飼糧中添加含量為152 mg/kg 的棉酚顯著降低了平均日增重和平均日采食量。 Mishra 等［13］研究表明肉雞飼糧中添加15%的棉籽粕顯著降低了體重， 提高了料重比，生長性能呈降低趨勢。 本試驗結果表明，隨著灌胃天數的增加，肉仔雞體內棉酚蓄積，其不僅與蛋白質結合，減少機體對營養成分的吸收，還對消化道造成損傷，影響肉仔雞的消化功能，進而降低日采食量和增重， 最終導致料重比較大幅度的提高，尤其在16～20 日齡階段M 組的料重比呈現負增長，進一步表明灌胃150 mg/（kg·BW）劑量的棉酚可以影響肉仔雞的生長性能， 造成嚴重的生長抑制，這一結果與Robinson 等［14］的研究結果相似。 同時，本試驗結果也表明，M 組的生長抑制效果比L 組和H 組明顯，H 組的生長抑制效果較比L 組明顯， 而H 組的生長抑制效果不及M 組，這可能與棉酚毒性的累積效應和棉酚攝入的量有關。 一方面因為進入組織的棉酚只有8.9%，細胞的吸收作用具有飽和性， 多余的棉酚經血液輸送至腸道、腎臟排出體外［4］；另一方面，棉酚中毒屬于慢性中毒，其在體內具有蓄積作用，幼齡動物對棉酚更加敏感［15-18］。

3.2 棉酚對雄性肉仔雞血清抗氧化能力的影響

機體為了清除過多的氧自由基、過氧化氫、羥自由基，會動用自身的抗自由基活性物質，包括酶系統（GSH-Px、CAT、SOD）和非酶系統（生物抗氧化劑）［19-20］。 GSH-Px 是機體內一種重要的自由基捕獲酶，可以保護細胞膜結構及功能的完整性［21］；CAT 是一種酶類清除劑， 能夠有效避免羥自由基的過度產生［22-23］。 在正常情況下，機體內自由基的產生與清除保持動態平衡，而CAT 和GSH-Px 活性也維持在正常范圍內［24］，使機體抗氧化機能正常運行。當生物體內自由基大量產生，超過了抗氧化物酶所能清除的量時， 自由基通過直接攻擊核酸（DNA）、蛋白質、脂質等，導致組織損傷［25］。侯楠楠［26］也通過體外培養原代蛋雞肝細胞發現棉酚可增加細胞內氧自由基的濃度，造成細胞氧化損傷。線粒體是細胞產生自由基的主要場所， 在正常情況下， 細胞內自由基可作為胞內信號分子參與調控細胞的生長、分化、凋亡和免疫過程［27］。 當組織受到損傷時，線粒體內的自由基水平大增，對線粒體造成損害， 導致線粒體功能甚至細胞各種生命活動異常，進一步使組織受損。Ding 等［28］研究發現接觸棉酚會引起小鼠卵母細胞體外成熟過程中線粒體功能障礙，從而誘導氧化應激。

本試驗結果顯示，5 日齡時3 個棉酚灌胃組的CAT 和GSH-Px 活力高于對照組，11、16 和21日齡時3 個棉酚灌胃組的CAT 和GSH-Px 活力低于對照組， 這可能是因為棉酚在動物體內蓄積到中毒劑量之前有一定的抗氧化作用， 可以使血清中的CAT 和GSH-Px 活力升高，后期隨著灌喂天數的增加，棉酚蓄積到一定劑量，其毒性作用使細胞受損，抗氧化酶的產生隨之減少，進而使抗氧化能力下降［29-30］，自由基和過氧化物堆積，使機體處于氧化應激狀態［31-35］，導致機體抗氧化能力持續下降。 此外，M 組和H 組的CAT 和GSH-Px 活力較L 組低， 而M 組和H 組之間的差別不大，可能是這兩組血清中的抗氧化酶活力低， 不能明顯反映出二者的差異。

3.3 棉酚對雄性肉仔雞腎臟的損傷

腎臟是機體主要的排泄器官， 可調節體內鉀、鈉離子的平衡。 在正常情況下，從腎小球濾出的鉀離子大部分通過近曲小管被重新吸收，以保持體內鉀的平衡；當體內鉀離子過多時，可通過遠曲小管排鉀吸鈉來調節小管內的尿量和尿鉀含量［36］。 研究發現棉酚可導致低血鉀癥等不良反應［37］，棉酚最主要的靶細胞器是線粒體。 余銘清等［38］和蘇樹蕓等［39］研究表明，棉酚可導致腎臟近曲小管的線粒體發生腫脹等異常變化，對腎小管產生損傷作用。 此外，棉酚還可以通過損傷線粒體，干擾與氧化磷酸化有關的其他酶系，進而影響鉀離子的主動轉運［40］。 在本試驗中，與對照組相比，3 個棉酚灌胃組的腎臟細胞均發生了病理學變化：細胞膜溶解、細胞間隙明顯變大，腎小囊腔明顯縮小甚至消失、結構紋理被破壞，淋巴細胞聚集，腎小管結構不完整等；同時，棉酚在腎臟有一定的蓄積過程，進一步導致腎臟損傷。 本試驗得到的結果與祝家東等［10］和王輝等［41］在給予游離棉酚下觀察到的小鼠腎臟病理學變化基本一致。此外，腎臟受損程度為M 組>H 組>L 組，表明灌喂150 mg/（kg·BW） 的棉酚對機體造成較大影響。

4 結論

從1 日齡開始給雄性肉仔雞分別灌服劑量為100、150 和200 mg/（kg·BW）的棉酚，連續灌服20 d，可降低生長性能及血清抗氧化能力，并對腎臟造成損傷； 而隨著灌胃時間的延長，以150 mg/（kg·BW）的劑量影響最為明顯。