基于PI3K/Akt信號通路探討川芎嗪對鼻咽癌CNE-2細胞增殖和遷移的影響

李艷麗,文怡靜,陳文鋒,何良,凌博,葉廣彬

(1. 右江民族醫學院基礎醫學院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫學院護理學院,廣西 百色 533000;3. 右江民族醫學院醫學影像學院,廣西 百色 533000)

鼻咽癌是耳鼻咽喉頭頸外科中常見的惡性腫瘤之一,通常起源于鼻咽黏膜上皮,具有易轉移、高發病率和致死率等臨床特點[1-2]。針對鼻咽癌的臨床治療方案通常以放化療、分子靶向藥物治療和免疫治療為主,但療效仍存在不足之處,如5年生存率低、易產生耐藥性和不良反應等[3]。中藥在防治鼻咽癌中具有療效確切、低毒副作用和改善放化療不良反應等作用[4]。因此,中西醫結合的療法可能成為有效解決上述難題的策略之一。

川芎是現代中西醫結合抗癌中的常用藥物之一,以川芎作為核心組分的中成藥(如川芎茶調散、鼻竇炎合劑),在鼻咽癌的防治中起到了降低化療副作用、降低淋巴結腫大和增效等作用[5-7]。然而川芎抗鼻咽癌的物質基礎和藥效機制不明,制約其臨床開發和應用。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是中藥川芎的有效成分,已被證明對多種惡性上皮腫瘤具有抑制作用[8-9]。因此,川芎嗪是否具有抗惡性上皮起源的鼻咽癌的作用值得進一步研究。本研究通過體外細胞實驗探究川芎嗪對鼻咽癌CNE-2細胞惡性生物學行為的作用及其機制,為開發抗腫瘤藥物提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料 川芎嗪和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司;鼻咽癌CNE-2細胞購自中國科學院上海細胞庫;CCK-8購自Biosharp公司;PI3K和磷酸化PI3K(p-PI3K),Akt和磷酸化Akt(p-Akt)等抗體購自Abcam公司;BCA檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)和辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG(H+L)、ECL化學發光試劑均采購于上海碧云天生物技術有限公司;10%PAGE凝膠快速制備試劑盒和三色預染蛋白Marker購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司。

1.2細胞培養和藥物制備 鼻咽癌CNE-2細胞培養使用RPMI 1640培養基,含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素,置于37 ℃,5% CO2培養箱中培養。用DMSO溶解TMP粉末,配制成1 mg/mL的儲存液,避光儲存于-20 ℃冰箱中,用RPMI 1640完全培養基稀釋成不同濃度的TMP工作液(0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL)。

1.3CCK-8檢測 取對數生長期的CNE-2細胞制成細胞懸液,計數并接種于96孔板,每孔接種100 μL(5×103個細胞),設置6個復孔。待細胞長滿后,更換含0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL TMP的完全培養基,對照孔中添加完全培養基和DMSO溶液,分別在培養24 h、48 h和72 h時采用CCK-8法檢測細胞增殖能力,具體操作方法參考試劑盒說明書。最后使用多功能酶標儀在450 nm波長下檢測各孔在波長450 nm處的吸光值,并按照公式計算細胞增殖抑制率并繪制曲線。

1.4流式細胞術 取對數生長期的CNE-2細胞以1×104個/孔接種于96孔細胞培養板中,培養過夜,加入終濃度為400 μg/mL TMP,對照組中加入DMSO溶液,培養24 h后,加入胰蛋白酶消化,用PBS調整細胞密度為1×107cells/mL。取1 mL的細胞懸液,1 000 r/min離心10 min,棄上清,用預冷的PBS重懸細胞,1 000 r/min、4 ℃離心10 min,吸除上清液,加結合緩沖液2 mL混合后,再加入5 μL碘化丙啶PI溶液和10 μL膜聯蛋白V-FITC溶液,放在避光環境中孵育15 min,加入300 μL的緩沖液,流式細胞儀上機檢測CNE-2細胞凋亡的情況。

1.5劃痕實驗 取對數生長期的CNE-2細胞計數并調整細胞密度為5×105cells/mL,接種于6孔細胞培養板中,每孔1 mL,待細胞長滿后,用20 μL槍頭在孔內豎線劃痕,并加入終濃度為400 μg/mL TMP的無血清培養基培養CNE-2細胞。然后分別在0 h和24 h用顯微鏡進行觀察孔內細胞的愈合情況,拍照記錄。

1.6Western Blot實驗 使用終濃度為400 μg/mL TMP干預CNE-2細胞后,取細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉膜。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗滌3遍,添加一抗(一抗稀釋液1∶2 000稀釋)后,4 ℃靜置過夜。TBST洗滌3遍,二抗(5%脫脂奶粉1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h。取出PVDF膜,TBST洗滌3遍,滴加ECL顯影液,在凝膠成像系統下顯影成像。

2 結果

2.1川芎嗪抑制鼻咽癌CNE-2細胞增殖 研究川芎嗪對鼻咽癌CNE-2細胞增殖能力的影響。采用濃度0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL的川芎嗪分別作用CNE-2細胞24 h、48 h和72 h,從而確定時效和量效。結果表明(見圖1),與對照組(0 μg/mL)相比,不同濃度的川芎嗪對CNE-2細胞增殖均有抑制作用,且呈現出濃度和時間依賴性(P<0.05)。

圖1 不同濃度的川芎嗪對鼻咽癌CNE-2細胞增殖的影響

2.2川芎嗪促進鼻咽癌CNE-2細胞凋亡 流式細胞術檢測川芎嗪對鼻咽癌CNE-2細胞凋亡的影響。結果表明(見圖2),采用400 μg/mL川芎嗪處理鼻咽癌CNE-2細胞24 h后,實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.01),這提示川芎嗪可以誘導促進CNE-2細胞凋亡。

注:**P<0.01。圖2 川芎嗪對鼻咽癌CNE-2細胞凋亡的影響

2.3川芎嗪抑制鼻咽癌CNE-2細胞遷移 細胞劃痕實驗結果顯示(見圖3),采用400 μg/mL川芎嗪處理CNE-2細胞24 h后,實驗組中CNE-2細胞的遷移距離明顯短于對照組(P<0.01),結果提示川芎嗪可以抑制鼻咽癌CNE-2細胞的遷移。

注:**P<0.05。圖3 川芎嗪對鼻咽癌CNE-2細胞遷移的影響

2.4川芎嗪對CNE-2細胞遷移相關蛋白的表達影響 采用400 μg/mL川芎嗪處理鼻咽癌CNE-2細胞24 h后,與對照組(0 μg/mL)相比,如圖4所示,細胞遷移相關蛋白N-cadherin、Snail和Vimentin表達均明顯降低,而E-cadherin則表達明顯升高(P<0.01)。這一結果提示川芎嗪可以抑制CNE-2細胞的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),從而達到抑制CNE-2細胞遷移的作用。

注:**P<0.01。圖4 川芎嗪對CNE-2細胞侵襲遷移相關蛋白的表達影響

2.5川芎嗪對PI3K/Akt信號通路蛋白的表達影響 采用400 μg/mL川芎嗪處理鼻咽癌CNE-2細胞24 h后,與對照組(0 μg/mL)相比,如圖5所示,川芎嗪能夠提高促凋亡蛋白Bax表達,而降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(P<0.01)。此外,川芎嗪能夠有效降低p-PI3K和p-Akt的表達水平(P<0.01),抑制PI3K/Akt的磷酸化水平,從而抑制PI3K/Akt信號通路的激活。這些結果提示川芎嗪可以通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活,繼而促進CNE-2細胞凋亡。

注:**P<0.01。圖5 川芎嗪對CNE-2細胞的PI3K/Akt信號通路蛋白的表達影響

3 討論

在鼻咽癌的臨床治療里,中西醫結合的方法是治療主流趨勢之一,在發揮西醫(放化療、手術和分子靶向藥物等)將腫瘤殺滅的同時,兼具中藥降低毒副作用和不良反應的功能,從而整體提升患者的臨床治療效果[10]。因而,篩選抗鼻咽癌的中藥成為重要的研究工作之一。

川芎是我國重要的中藥之一,通常具備活血行氣和祛風止痛的作用。然而川芎的現代應用中,抗腫瘤活性是其開發的重要方向,其中川芎抗腫瘤的核心活性成分為川芎嗪[11]。川芎嗪抗腫瘤為其進一步的中西醫聯合防治腫瘤起到了關鍵推進作用,如紫杉醇聯合川芎嗪在肝癌治療中的開發潛力[12]。與此同時,川芎在鼻咽癌的防治中也得到了一定程度的應用,其中以川芎茶調散最具代表性[13]。為了進一步挖掘川芎抗鼻咽癌的具體有效成分和藥理作用,本研究以鼻咽癌CNE-2細胞為研究對象,以不同濃度的川芎嗪干預CNE-2細胞發現,川芎嗪可以促進CNE-2細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和遷移。由此可以得出,川芎嗪是川芎的潛在性抗鼻咽癌活性成分之一。

PI3K/Akt信號通路是細胞內維持增殖活性和降低凋亡水平的經典信號通路[14]。在腫瘤細胞中PI3K/Akt信號軸在發生蛋白磷酸化活化后形成p-PI3K和p-Akt調控下游Bax和Bcl-2等增殖凋亡相關蛋白的表達平衡,從而維持腫瘤細胞的高增殖和低凋亡效率[15]。郭利培等[16]研究發現吳茱萸堿可以通過抑制PI3K/Akt信號通路活性,下調增殖及凋亡相關蛋白的表達水平,從而抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖和誘導細胞凋亡。尹倩等[17]研究發現辣椒素可以通過調節PI3K/Akt信號通路抑制鼻咽癌細胞增殖和侵襲能力,以及誘導細胞凋亡,從而提高患者生存時間。此外,李本珊[18]研究發現羥喜樹堿可以通過TGF-β誘導的PI3K/Akt信號通路抑制鼻咽癌HK1和C666-1細胞增殖,導致細胞周期的阻滯,以及抑制鼻咽癌細胞的侵襲和轉移。因而,PI3K/Akt信號通路普遍認為是評價藥物作用腫瘤細胞增殖和凋亡的有效靶點之一。本研究中對不同濃度的川芎嗪作用鼻咽癌細胞進行蛋白檢測發現,CNE-2細胞經川芎嗪藥物處理后,PI3K/Akt信號通路明顯被抑制,而細胞凋亡相關蛋白Bcl-2/Bax比值下降。這預示著川芎嗪可以通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活,從而促進鼻咽癌CNE-2細胞凋亡。

在腫瘤細胞的轉移過程中EMT化是起始步驟,也是抗轉移類藥物開發的重要方向[19]。腫瘤細胞EMT化過程中鈣黏連蛋白發揮著重要的作用,其中上皮樣標志物E-cadherin動態下降、間充質標志物N-cadherin和Vimentin表達水平提升,降低腫瘤細胞間的黏附能力,為其EMT化提供重要的動力[20-21]。腫瘤細胞EMT化中Vimentin蛋白負責細胞骨架的功能,從而確保EMT化中偽足的形成[22]。劉曉燕等[23]研究利用蒲公英多糖(200 μg/mL、400 μg/mL)處理三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞后,Western Blot檢測發現MDA-MB-231細胞中E-cadherin表達水平上調,而N-cadherin和Vimentin表達水平下調,結果表明蒲公英多糖能夠有效抑制MDA-MB-231細胞遷移、侵襲和EMT化,其機制可能與抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號通路激活有關。朱軍輝等[24]利用RNA干擾技術敲低鈣網蛋白表達后,發現鼻咽癌CNE-2細胞中E-cadherin表達顯著增高,Vimentin、TGF-β以及MMP-9蛋白表達降低,結果表明鈣網蛋白可以誘導CNE-2細胞發生EMT,從而促進鼻咽癌的遷移和侵襲。由此可見E-cadherin、N-cadherin和Vimentin是腫瘤細胞發生EMT化和轉移的核心靶標。本研究中發現川芎嗪可顯著抑制CNE-2細胞中N-cadherin和Vimentin蛋白的表達,提升E-cadherin蛋白的表達,推測川芎嗪可以抑制CNE-2細胞的轉移能力,與其對E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的調控作用關系密切。

綜上所述,川芎嗪是川芎的可能性抗鼻咽癌活性成分之一,其中川芎嗪可以促進鼻咽癌CNE-2細胞凋亡、抑制CNE-2細胞增殖和遷移,核心機制與其對PI3K/Akt通路,以及E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達的調控關系密切。