SAP患者外周血PINK1/Parkin的表達及與凋亡因子的相關性研究

岑蘭英,黃秀權,王語陽,蘇拾香,覃宗帥,甘慧芳,覃月秋

(1. 右江民族醫學院附屬醫院消化內科,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫學院研究生學院,廣西 百色 533000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床常見的急癥,近年來隨著人們生活方式及飲食習慣的改變,我國AP的發病率呈上升趨勢。AP起病急,進展迅速,部分患者可發展成重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP),因其治療難度大,病死率可高達13%～35%[1]。研究表明,細胞凋亡與SAP的發生發展密切相關[2]。PINK1/Parkin是介導線粒體自噬的重要因子,當疾病引起細胞發生線粒體功能障礙時PINK1/Parkin表達增加,介導的線粒體自噬,發揮抗細胞凋亡作用,但當PINK1/Parkin的表達下降或缺陷時,線粒體自噬障礙,造成線粒體功能失調最終導致細胞結構和功能異常,促進細胞凋亡的發生[3]。細胞色素C(Cyt-C)是線粒體凋亡機制中的關鍵物質,當線粒體發生損傷時,Cyt-C可大量進入細胞質中,引起細胞凋亡[4-6]。Caspase-3是細胞質內凋亡信號傳導途徑的關鍵效應分子,Caspase-3水平升高提示凋亡系統的異常激活[7]。目前PINK1/Parkin在SAP患者外周血中的表達情況尚不清楚,其對SAP患者細胞凋亡的作用尚不明確,本研究通過檢測SAP患者外周血PINK1/Parkin mRNA的表達,與正常對照組、MAP組、MSAP組對比,并分析SAP患者外周血PINK1/Parkin對細胞凋亡因子Cyt-C、Caspase-3表達的影響,為闡明SAP細胞凋亡機制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2022年10月至2023年9月右江民族醫學院附屬醫院住院治療的64例AP患者資料,其中22例輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP)、20例中度重癥急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis, MSAP)、22例重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP),同時選取本院同期健康體檢者24例作為健康對照組,4組的一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05),AP診斷及嚴重程度分級標準符合《中國急性胰腺炎診治指南(2021)》,器官功能障礙的診斷標準基于改良Marshall評分系統。入選病例均排除惡性腫瘤、腦部疾病、心血管疾病、肝腎疾病、自身免疫性疾病、血液系統疾病、感染類疾病、妊娠期、哺乳期等,本研究經醫院醫學倫理委員會批準,受試者簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器 人Cyt-C(CSB-E08530h-96T)、Caspase-3(CSB-E08856h-96T)、ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司,TRIzol Reagent購于美國invitrogen 公司,三代逆轉錄預混液(含dsDNase)(MR05101M)購于莫納(武漢)生物科技有限公司,qPCR SYBR○RGreen Master Mix(NoRox)(11201

ES08)購于上海翊圣生物科技有限公司。儀器使用普通PCR儀、熒光定量PCR儀、全自動酶標儀 (Thermofis,美國)。

1.3方法

1.3.1收集樣本 收集患者的一般資料(年齡、性別)。所有AP患者外周血于入院后24 h內收集,5 mL抗凝外周血常溫下離心15 min(3 000 r/min),收集最下層血細胞轉接到1.5 mL無菌離心管。將所收集最下層血細胞于離心機離心15 min(4 ℃,12 000 r/min),吸除上層澄清液,將所得血細胞以每管500 μL分別裝于無菌離心管中,置于-80 ℃保存,用于檢測PINK1、Parkin mRNA表達。5 mL促凝外周血用離心機離心10 min(常溫,4 000 r/min),收集上清液,分裝置于-80 ℃保存,用于檢測血清Cyt-C、Caspase-3蛋白水平,待收集完畢后統一檢測。

1.3.2外周血細胞qPCR檢測 采用RT-q PCR檢測各組外周血細胞中PINK1、Parkin mRNA相對表達量。按照RNA試劑盒說明書對各組外周血細胞提取總RNA,用紫外分光光度計測量RNA濃度、OD260、OD280,使用反轉錄試劑盒按說明書方法反轉錄得到cDNA,使用2 μL cDNA配置20 μL的反應體系,應用SYBR Green Master Mix擴增上述cDNA,使用LightCycler○RR96qPCR儀進行檢測。選取GAPDH為內參,引物由南寧捷尼斯生物科技有限公司提供,引物序列為,H-PINK1-F:5′-GCCTACATTGCCCCAGAACC-3′,H-PINK1-R:5′-TGGAGGAACCTGCCGAGAT-3′;H-Parkin-F:5′-TTTTCCTAACTGCCTAAGATAACCC-3′,H-Parkin-R:5′-TGTCACAGGTCTGTTGTCACCGT-3′;H-GAPDH-F:5′-GGTGAAGCAGGCGTCGGA-3′,H-GAPDH-R:5′-GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。所有樣品均設3個復孔,采用2-△△Ct法計算PINK1、Parkin mRNA相對表達量。

1.3.3ELISA檢測 采用ELISA法檢測樣本血清Cyt-C、Caspase-3含量,ELISA檢測的具體步驟嚴格按說明書進行,采用全自動酶標儀 (Thermofis,美國) 進行結果判定。

2 結果

2.1一般資料分析 各組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05),見表1。各組器官功能障礙情況及改良Marshall評分,見表2。

表1 各組性別、年齡一般資料分析結果

表2 各組器官功能障礙情況及改良Marshall評分

2.2各組PINK1 mRNA、Parkin mRNA相對表達水平 與正常對照組、MAP組、MSAP組比較,SAP組外周血細胞PINK1 mRNA、Parkin mRNA 表達明顯下降(P<0.05),正常對照組、MAP組、MSAP組組間兩兩比較,PINK1 mRNA及Parkin mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、圖1。

注:與正常對照組比較,*P<0.05;與MAP組比較,#P<0.05;與MSAP組比較,△P<0.05。圖1 AP患者外周血PINK1 mRNA、Parkin mRNA相對表達量

2.3各組血清Cyt-C、Caspase-3水平比較 與對照組比較,MAP、MSAP、SAP組血清Cyt-C、Caspase-3水平升高(P<0.05),與MAP組比較,MSAP、SAP組血清Cyt-C、Caspase-3水平升高(P<0.05),與MSAP組比較,SAP組血清Cyt-C水平升高(P<0.05),Caspase-3水平升高,但差異無統計學意義。見表4、圖2。

注:A.血清Cyt-C水平及組間比較;B.血清Caspase-3水平及組間比較。與正常對照組比較,*P<0.05;與MAP組比較,#P<0.05;與MSAP組比較,△P<0.05。圖2 各組血清Cyt-C、Caspase-3水平

表4 各組血清Cyt-C、Caspase-3水平

2.4SAP組PINK1 mRNA、Parkin mRNA表達與血清Cyt-C、Caspase-3水平的相關性 SAP組PINK1 mRNA與血清Cyt-C、Caspase-3呈負相關(rs=-0.909,P<0.001;rs=-0.905,P<0.001);Parkin mRNA與血清Cyt-C、Caspase-3呈負相關(rs=-0.618,P<0.05;rs=-0.664,P<0.001)。見圖3。

2.5SAP組血清Cyt-C與Caspase-3水平的相關性 SAP組血清Cyt-C與Caspase-3水平呈正相關(rs=0.916,P<0.001)。見圖4。

圖4 SAP組血清Cyt-C與Caspase-3水平的相關性

3 討論

SAP是AP病情發展嚴重的階段,病死率可高達13%～35%[1]。研究發現,細胞凋亡與SAP發生發展密切相關[2]。目前認為參與SAP細胞凋亡的機制主要包括:①Fas/FasL與死亡受體凋亡通路;②Bcl-2家族與線粒體通路;③鈣離子與內質網凋亡通路;④其他參與細胞凋亡的調控因子,如轉錄因子NF-КB、外源性過氧化氫、外源性HMGB1等[2]。其中線粒體通路是調控SAP細胞凋亡的重要途徑,活性氧(reactive oxygen species,ROS)的釋放、Ca2+超載引起線粒體跨膜電位改變,發生線粒體去極化,隨后引起的Cyt-C的釋放是細胞凋亡的中心環節[8]。在這過程中,ROS的釋放、Ca2+超載等刺激引起的線粒體損傷可誘導線粒體自噬激活,發揮細胞穩態調節功能。

PINK1/Parkin是介導線粒體自噬的重要因子,當細胞發生線粒體功能障礙時PINK1/Parkin表達增加,介導線粒體自噬,抑制細胞凋亡,修復線粒體功能;但當PINK1/Parkin的表達下降或缺陷時,線粒體自噬障礙,造成線粒體功能失調,促進細胞凋亡的發生。目前研究表明,AP中腺泡細胞、外周血單個核細胞、血小板均存在線粒體功能障礙[9-11]。研究發現,SAP中PINK1/Parkin介導的通路參與胰腺細胞的線粒體自噬,且隨著嚴重程度增加,PINK1/Parkin介導的線粒體自噬受到抑制[12]。而SAP患者外周血中PINK1/Parkin的表達及作用分析少有報道,本研究發現與正常對照組、MAP組、MSAP組比較,SAP組外周血細胞PINK1 mRNA、Parkin mRNA 表達明顯下降,提示SAP患者外周血的線粒體自噬可能受到抑制。而正常對照組、MAP組、MSAP組兩兩比較,PINK1及Parkin mRNA表達差異無統計學意義。在AP發生的第一階段,炎癥介質引起的線粒體損傷可通過線粒體自噬進行線粒體穩態調節,但隨著病情的加重,炎癥介質的大量釋放,線粒體損傷加重,線粒體自噬出現異常,線粒體自噬受到抑制,損傷線粒體出現堆積,并釋放出大量ROS、Cyt-C,進而加重細胞損傷,促進細胞凋亡。

Cyt-C 是線粒體呼吸鏈上的重要組成成分,當線粒體膜結構發生損傷時,Cyt-C從線粒體內釋放到胞質中,并作為重要的促凋亡因子,激活Caspase-9,然后進一步激活下游的Caspase-3,啟動Caspases的級聯反應,最終導致細胞凋亡的發生[13]。細胞凋亡過程發生的核心過程是Caspase酶原的活化。其中Caspase-3作為凋亡執行者其作用尤為重要,它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志[7]。朱紹華等[14]的研究表明血清Caspase-3水平在AP患者中升高,且與病情嚴重程度呈正相關。本研究發現,與正常對照組比較,MAP、MSAP、SAP組血清Cyt-C、Caspase-3水平升高,提示AP患者外周血中存在線粒體損傷相關性凋亡;與MAP組比較,MSAP、SAP組血清Cyt-C、Caspase-3水平升高,提示隨著嚴重程度的增加,其凋亡的程度增加,本研究結果與朱紹華等[14]的研究結果一致。在SAP患者中,持續存在的器官功能障礙及感染誘導細胞凋亡,導致凋亡相關因子持續消耗,可能是Caspase-3在MSAP組、SAP組中差異不明顯的原因。

研究發現SAP中PINK1/Parkin參與介導胰腺細胞的線粒體自噬,隨著嚴重程度的增加,SAP的線粒體自噬受到抑制,在PINK1和PARK2基因敲除模型中,發現線粒體途徑的凋亡細胞顯著增加[12]。另有研究證實抑制PINK1-Parkin線粒體自噬導致創傷性腦損傷小鼠皮層神經細胞線粒體凋亡信號顯著增加,PINK1-Parkin表達降低可導致Caspase-3等凋亡相關因子表達升高[15]。為了解SAP患者外周血線粒體自噬因子PINK1/Parkin與細胞凋亡因子表達的相互關系,本研究進行了相關性分析,結果顯示PINK1 mRNA、Parkin mRNA與血清Cyt-C、Caspase-3均呈負相關。提示在SAP患者外周血中,線粒體自噬因子PINK1/Parkin表達越低,Cyt-C、Caspase-3表達越高,線粒體損傷相關性凋亡發生的程度越高,PINK1/Parkin可能通過負向調控Cyt-C、Caspase-3表達調節SAP細胞凋亡,本研究結果與前人研究結果一致。

為了進一步了解SAP線粒體損傷與細胞凋亡的關系,本研究還進行Cyt-C與Caspase-3相關性分析,結果提示Cyt-C與Caspase-3呈正相關,且相關性較強,說明Cyt-C對Caspase-3的激活產生了一定的作用。細胞凋亡是細胞的主動死亡過程,當胰腺炎發生時,炎癥反應及代謝紊亂使細胞內的線粒體、內質網等細胞器發生功能障礙,各類細胞器首先進行融合、自噬等發揮細胞保護作用,但當細胞器穩態調節出現異常,細胞將通過凋亡的方式進行自我保護,以阻止病情進一步發展。因此當SAP中PINK1/Parkin表達下降,線粒體自噬受到抑制時,機體將通過增加細胞凋亡的方式進行自我保護。

綜上所述,SAP患者外周血PINK1、Parkin表達降低且與凋亡因子表達水平升高有關,可能是SAP患者細胞凋亡增加的原因,為SAP的診治靶點提供新的理論依據。