基于TCGA數據分析KIF4A基因在惡性胸膜間皮瘤中的表達及預后意義

李錦松,李彬,李漢偉,劉如愛,普元倩,自加吉,余敏,熊偉

(1. 大理大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室,云南 大理 671000;2. 云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室,云南 大理 671000;3. 云南省高校臨床生物化學檢驗重點實驗室,云南 大理 671000;4. 云南省大理白族自治州第一人民醫院,云南 大理 671000;5. 云南大學生命科學學院生物化學與分子生物學實驗室,云南 昆明 650091)

惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma,MPM)是一種起源于胸膜、極具侵襲性的罕見惡性腫瘤,80%的病例與職業性或環境石棉暴露相關[1]。石棉是一組包含6種不同物化性質的石棉樣礦物纖維,主要包括溫石棉、青石棉和鐵石棉。石棉的吸入可以使機體產生細胞因子和活性氧物質,引起局部炎癥反應并最終導致腫瘤的發生[2]。由于20世紀石棉無節制的使用,自1986年首例與石棉相關的惡性間皮瘤在美國被報道以來,間皮瘤的發病率和死亡率一直在上升[3]。間皮瘤是所有癌癥類型中生存率最差的癌種之一,5年生存率<10%,中位生存時間<1年。由于間皮瘤有長達40年潛伏期,絕大數間皮瘤患者確診時已是晚期,且缺乏行之有效的治療方案,因此迫切需要用于臨床早期診斷間皮瘤的篩查方案[4]。

驅動蛋白超家族(kinesin superfamily proteins,KIFs)作為細胞內轉運系統的一大組成部分,分為14個亞家族,其中驅動蛋白超家族4(kinesin superfamily protein 4,KIF4)在哺乳動物中樞神經細胞中首次被發現[5]。通過原位雜交發現KIF4有兩種亞型,分別為KIF4A和KIF4B,其中KIF4A基因位于10號染色體長臂3區1帶,含有31個外顯子,編碼含有1 232個氨基酸140 kDa大小的KIF4A蛋白。KIF4A蛋白在N-端頭部有一個催化結構域,C-端是一個富含半胱氨酸基序的載體結合結構域,N-端和C-端之間則是氨基酸卷曲結構。KIF4A的染色體凝聚、DNA修復和復制功能依賴于其亮氨酸拉鏈結構和半胱氨酸基序,其維持了基因的穩定性;KIF4A可通過依賴ATP的水解作用沿著微管轉運細胞器、蛋白質復合體和mRNA到特定位置;除此之外,KIF4A還參與染色體聚合和解聚、紡錘體組裝進而調控細胞有絲分裂和減數分裂[6]。為了探究KIF4A基因表達水平與MPM發生發展的相關性,本研究基于TCGA數據庫進行KIF4A基因表達水平與MPM臨床病理參數和預后相關性的分析以及在MPM中KIF4A基因與免疫細胞浸潤和生存曲線的分析,還通過基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GESA)探討了KIF4A基因相關通路,對于深入了解KIF4A基因在MPM中的作用和機制具有重要意義[7]。

1 資料與方法

1.1在TCGA數據庫中下載MPM數據集 在R4.2.3軟件中使用cgdsr函數包從TCGA(https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga)數據庫下載MPM數據集,包括KIF4A基因mRNA表達量數據(meso_tcga_pan_can_atlas_2018_rna_seq_v2_mrna)和其患者對應的病理資料(meso_tcga) ,通過TCGA病例ID將對應的兩組數據進行合并。將轉錄組測序數據轉換為TPM(transcripts per million mapped reads)格式,進行log2轉化數據用于后續分析。

1.2KIF4基因 mRNA表達量與MPM患者臨床病理特征相關性分析 通過對TCGA數據庫中的87例MPM樣本的mRNA二代測序結果進行分析,MPM組織樣本中KIF4A基因的表達量為11.53～1485.38,中位數為305.81,以基因表達量中位數為臨界值,高于臨界值的MPM樣本,定義為KIF4A高表達,反之則定義為KIF4A低表達。在MPM數據集中,共含有43例KIF4A基因高表達,44例KIF4A基因低表達。在R4.2.3軟件epicalc函數包分析KIF4A基因表達量與臨床病理特征之間的相關性。

1.3KIF4A基因在MPM中的臨床病理參數可視化 進入UALCAN官網(https://ualcan.path.uab.edu/index.html),選擇TCGA模塊,輸入KIF4A基因,選擇Mesothelioma TCGA數據集,并選擇expression進行explore,得到KIF4A基因表達水平與不同MPM臨床分組關系的箱型圖。

1.4KIF4A基因表達水平與MPM患者預后相關性分析 在GEIPA官網(http://gepia.cancer-pku.cn/)內點擊survival analysis,在gene欄輸入KIF4A,method選擇總生存率(overall survival,OS)或無疾病進展生存率(disease free survival,DFS),保持95%置信區間(95% confidence interval,95%CI),最后選擇MESO數據庫,點擊plot作圖。

1.5KIF4A基因與MPM免疫浸潤相關性分析 通過TIMER官網(http://timer.cistrome.org/),訪問TIMER 2.0數據庫;分別利用immune association中的gene和outcome功能,設置gene expression為KIF4A,勾選純度調整,腫瘤類型為MESO,篩選有統計學意義的免疫細胞類型并輸出為可視化圖表保存。

1.6基因集富集分析 把TCGA數據庫MPM樣本按照KIF4A基因mRNA表達量的中位數分為高表達組和低表達組,并對兩個分組差異分析,根據處理后基因的logFC值從大到小排序,序列上部是上調的差異基因,序列下部是下調的差異基因,進行GSEA分析。計算基因集的富集分數(enrichment score,ES),對基因集的 ES 值顯著性檢驗,估計ES的顯著性。最后進行多重假設檢驗,根據基因集的大小對ES標準化得到標準化后富集分數(normalized enrichment score,NES),隨后用 NES 計算假陽性率,從而得到顯著富集的基因集。

1.7統計學方法 使用Kaplan-Meier模型和Log-rank檢驗進行生存分析。從TCGA數據庫下載MPM患者的臨床病理數據集,并對MPM患者的臨床病理資料預處理。運用χ2檢驗及Fisher精確概率法分析MPM患者臨床病理參數。建立COX回歸模型對MPM患者臨床病理參數進行單因素和多因素分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MPM患者KIF4A基因mRNA表達水平與臨床病理參數的相關性 TCGA數據庫中MPM數據集的分析結果表明,KIF4A基因mRNA表達水平與MPM患者年齡、性別、腫瘤分期等無關(P>0.05),而與MPM患者腫瘤類型有關(P<0.05)。見表1。

表1 MPM患者KIF4A基因mRNA表達水平與臨床病理參數的關系

2.2KIF4A基因在MPM中的表達模式 UALCAN數據庫分析結果表明,KIF4A基因表達量與MPM的腫瘤分期、淋巴結轉移狀態、TP53基因突變狀態等無關;而KIF4A基因表達量與MPM的組織學分型有關,其中KIF4A基因表達量在上皮型MPM中的表達量低于雙相型MPM中的表達量(P=0.006)。見圖1。

注:A.KIF4A基因在不同間皮瘤分期中的表達情況;B.KIF4A基因在不同間皮瘤亞型中的表達情況;C.KIF4A基因在不同間皮瘤淋巴結轉移狀態的表達情況;D.KIF4A基因在不同間皮瘤TP53突變狀態的表達情況;**P<0.01,ns: no significance。圖1 KIF4A基因在MPM組織中的表達情況

2.3KIF4A高表達與患者預后不良有關 總體生存率(OS)分析結果顯示,與KIF4A低表達組相比,KIF4A高表達患者生存率隨著時間延長呈現下降顯著(Log-rankP<0.001)。無疾病進展生存率(DFS)分析結果顯示,與KIF4A低表達組相比,KIF4A高表達組生存率也隨著時間延長而下降(Log-rankP<0.05)。由此可知,KIF4A基因高表達提示MPM患者預后不良。見圖2。

注:A.KIF4A表達量與MPM總體生存率的關系;B.KIF4A表達量與MPM無疾病生存率的關系。圖2 KIF4A基因表達量對MPM患者預后的影響

2.4影響MPM患者預后的單因素和多因素分析 對87例MPM患者構建COX臨床病理參數回歸模型。單因素分析結果顯示,KIF4A基因表達量、腫瘤類型與MPM患者預后有關(P<0.05);將KIF4A基因表達量和腫瘤類型納入多因素回歸分析發現:KIF4A基因表達水平與腫瘤類型均是影響MPM患者預后的獨立因素(P<0.05),與肉瘤型MPM患者相比,上皮樣型的MPM患者預后較好(HR<1.0)。見表2。

表2 影響MPM患者預后的臨床病理參數單因素和多因素分析

2.5免疫細胞浸潤分析和免疫細胞生存分析 在TIMER 2.0數據庫中對87例MPM樣本進行KIF4A基因表達量與免疫細胞浸潤相關性分析和免疫細胞生存分析。分析結果表明,B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、髓樣樹突狀細胞與MPM樣本中的KIF4A基因表達量呈正相關。見圖3。而CD4+輔助型T細胞、CD4+效應記憶T細胞、血漿B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞對MPM患者生存時間具有顯著影響。見圖4。

注:A.B淋巴細胞;B.單核細胞;C.巨噬細胞;D.髓樣樹突狀細胞。圖3 KIF4A基因的表達與MPM患者免疫細胞浸潤的相關性

2.6基因集富集分析 為探究預后模型中基因的潛在生物學功能,進一步使用GSEA分析來探索預后模型中基因表達相關的富集通路。依據KIF4A基因在TCGA數據集MPM患者中表達量的中位值將樣本劃分為高表達組和低表達組,使用R軟件進行富集分析。結果發現, KIF4A高表達組顯著富集于細胞周期、DNA的復制、蛋白酶體、同源重組、真核生物核糖體生物合成、剪接體、mRNA監測途徑,核質轉運、范可尼貧血通路等通路,提示KIF4A基因的高表達在惡性胸膜間皮瘤中可能起的生物學功能。見圖5。

圖5 MPM患者中KIF4A基因富集結果

3 討論

MPM是一種罕見但具有侵襲性的癌癥,主要影響受石棉職業暴露的老年人。由于發展中國家癌癥登記處覆蓋不全,MPM的全球發病率和死亡率尚未可知[8]。暴露于石棉纖維的胸膜間皮細胞容易誘導氧自由基的產生,導致慢性炎癥的發展,并在活化巨噬細胞的影響下存活增殖,積累基因突變,最終發生惡性變[9]。雖然MPM是一種主要由職業或環境暴露石棉引起的癌癥,但是僅有5%的石棉暴露者會發生MPM。因此,除了石棉暴露這一因素,MPM還與9(9p21)、3(3p21)、22q等染色體重排有關,由此導致一些腫瘤抑制基因如CDKN2A、CDKN2B和NF2基因突變失活[10]。另外,BRCA相關蛋白1(BAP1)基因的種系雜合突變,給予MPM更高的易感性[2]。MPM對于傳統的手術切除和放射性治療反應有限,預后極差,是一種致死性疾病。在晚期不可切除治療中,培美曲塞和順鉑聯合治療仍是當前唯一許可的一線化療方案[11]。因此,迫切需要針對MPM的早期診斷和晚期治療靶點。

KIF4A作為KIF家族蛋白重要一員,在以微管為中心的轉運系統中發揮細胞存活、運動、分裂、維持細胞形態等生物學功能。KIF4A在許多癌癥中異常表達,在肝細胞癌[12]、肺癌[13]等癌癥患者中表達上調;而在胃癌中,KIF4A低表達與腫瘤細胞的不良分化具有顯著關系,過表達的KIF4A可抑制體外細胞生長和體內腫瘤形成[14]。由此說明, KIF4A對于不同類型的腫瘤有著截然不同的作用機制。KIF4A可轉錄抑制Rac1/Cdc42,誘導細胞骨架的重構從而驅動膠質瘤細胞生長[15]。KIF4A在細胞有絲分裂和減數分裂過程中,可誘導細胞非整倍體的出現,進而導致染色體重組或遺傳物質異常表達,可導致腫瘤的發生發展[16]。KIF4A還參與腫瘤細胞中的信號通路,其可活化Hedgehog信號通路,抑制結直腸癌細胞的自噬[17];在食管鱗狀細胞癌中,KIF4A通過影響Hippo信號通路的磷酸化水平,增強食管鱗狀細胞癌的增殖和遷移[18]。除此之外,KIF4A還參與DNA損傷修復、免疫細胞活化、病毒蛋白細胞內交聯等腫瘤發生相關活動[12]。研究表明,KIF4A在肺癌[19]、食管鱗狀細胞癌[20]、膽管癌[21]、前列腺癌[22]、宮頸癌[23]等多種腫瘤中可作為疾病預測、預后和治療的靶點。然而,KIF4A在MPM中卻少有報道,本文基于TCGA數據庫分析KIF4A基因在MPM的表達并作臨床病理參數分析和COX單因素和多因素分析,結果提示,KIF4A是影響MPM預后的危險因素,而且影響MPM的組織分型。由此進一步作了KIF4A在MPM中的免疫細胞浸潤和免疫細胞生存分析,發現CD4+輔助型T細胞、CD4+效應記憶T細胞、血漿B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞等免疫細胞浸潤水平影響MPM患者的生存狀態;此外,通過對KIF4A基因富集分析得出,KIF4A基因參與DNA的復制、同源重組、蛋白酶體、細胞周期、真核生物核糖體生物合成、剪接體、mRNA監測途徑,核質轉運等通路的生物學功能。HOU G J等[24]在肝癌組織中的GSEA分析結果也同樣表明,KIF4A與細胞周期、DNA復制、同源重組通路有關,這與本研究結果一致。另外,p53信號通路在肝癌組織中的KIF4A高表達組顯著富集[24]。以上結果提示,KIF4A在MPM中具有潛在的應用價值,其有望作為診斷、治療或預后靶點改善MPM患者的生存時間和生存狀況。