閆順華 馬 君 蘇比努爾
(新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院,烏魯木齊 830054)
β-受體激動劑是一組苯乙醇胺化合物,常被用作支氣管擴張劑和抗宮縮劑[1,2],大劑量用在飼料中可以提高動物的生長速度,減少動物體內的脂肪比例,提高瘦肉率[3,4]。β-受體激動劑會在動物肌肉和內臟中殘留,消費者長期食用,會造成肌肉抽搐、心臟病、中樞神經疾病甚至誘發惡性腫瘤[5-7]。由于其嚴重的危害性,歐盟和中國已經禁止在飼料中添加這類化合物[8-10]。
目前現行有效的檢測食品中β-受體激動劑的國家標準主要有GB 31658.22-2022《食品安全國家標準 動物性食品中β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》[11]、SN/T 1924-2011《 進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》[12]和農業部1025號公告-18-2008《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法》[13],在這3個標準中,β-受體激動劑的檢測都需要酶解步驟,均采用37℃酶解16h的方式把與蛋白結合的目標化合物釋放出來[12,13]。由于酶解時間長、前處理方法繁瑣,費時費力,難以滿足大批量樣品快速且準確的分析需求。
本研究對樣品前處理方法進行了改進,用乙腈飽和的正己烷除去樣品中的脂肪,用1%乙酸-乙腈溶液作為提取液對豬肉樣品進行超聲提取,將提取液氮吹至近干,用0.1%甲酸水復溶后進行測定,方法回收率在70%以上。該樣品前處理方法操作簡單,樣品提取效率高,既縮短了檢驗時間、又節約了成本(β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶價格昂貴)、大大提高了工作效率。
高效液相色譜-質譜聯用儀:I-Class/Xevo TQS, 美國Waters公司;電子天平:百分之一,Mettler Toledo公司;組織絞碎機:B-400型,瑞士步琦公司;離心機:SIGMA 1-14型,德國 Sigma 公司;多用途恒溫超聲儀:BASIC550型,德國Elma公司;氮吹儀:Eva50a型,北京普立泰科儀器有限公司。
β-受體激動劑混合標準溶液:100 μg/mL,批號-S084895,FirstStandard;克倫特羅-D9:100 μg/mL,批號-S074679,FirstStandard;沙丁胺醇-D3:100 μg/mL,批號-S074701,FirstStandard;鹽酸萊克多巴胺-D3:100 μg/mL,批號-S070751,FirstStandard;
乙腈和甲酸:色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;正己烷:色譜純,TEDIA COMPANY,INC;乙酸和乙腈:分析純,天津市致遠化學試劑有限公司。
豬肉粉中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林分析質控樣品:北京美正檢測技術有限公司。
2.2.1 樣品預處理
取樣品適量,切成小塊,置組織絞碎機中絞成肉糜,分裝至200mL的樣本袋中,貼樣品狀態標簽,密封后冷凍保存。
2.2.2 樣品制備
稱取2克樣品,置于50mL塑料離心管中,加入1000ng/mL的沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D3、克倫特羅-D9 3種內標混合溶液10μL,混勻,加入10mL1%乙酸-乙腈溶液,加入5~10mL經乙腈飽和的正己烷,渦旋混勻,超聲提取15min,渦旋混勻,8000r/min離心5min,準確移取10mL乙腈層在40℃氮吹濃縮至近干,加入2.0mL0.1%甲酸水溶液,渦旋混勻,過0.22μm水系濾膜,上機待測。
其中沙丁胺醇-D3作為沙丁胺醇、特布他林的內標物、萊克多巴胺-D3作為萊克多巴胺的內標物[16]、克倫特羅-D9作為其余β-受體激動劑的內標物,
2.2.3 方法檢出限、定量限制備
稱取2份陰性樣品2g(精確至0.01g)置于兩個三角燒瓶中,分別精密加入10ng/mL外標混合溶液40μL、100μL,同時各加入1000ng/mL內標混合溶液10μL,混勻,按樣品制備方法同法處理。
2.2.4 加標樣品制備
稱取陰性樣品2g(精確至0.01g)各置于三角燒瓶中,分別精密加入100ng/mL的9種β-受體激動劑外標混合溶液10μL、50μL、1000ng/mL外標混合溶液40μL,同時各加入1000ng/mL內標混合溶液10μL,混勻,按樣品制備方法同法處理。
2.2.5 質控樣品處理
稱取2g質控樣品(精確至0.01g),加入1000ng/mL內標混合溶液10μL,按樣品制備方法同法處理。
2.3.1 標準儲備液配制
精密量取0.1mLβ-受體激動劑混合標準溶液至1 0 mL容量瓶,用甲醇定容至刻度,得到濃度為1000ng/mL的標準儲備液。
分別精密量取3種內標標準溶液各0.10mL至同一10mL容量瓶,用甲醇定容至刻度,得到濃度為1000ng/mL的混合內標儲備液。
2.3.2 標準中間液配制
精密量取1000ng/mL的外標混合溶液0.20mL至10mL容量瓶,用甲醇定容至刻度,得到濃度為20ng/mL的外標混合標準中間液。
2.3.3 混合標準工作液系列配制
分別精密量取不同體積的外標混合標準中間液至6個10mL容量瓶,再分別精密加入1000ng/mL內標混合溶液0.05mL,然后再用甲醇定容至刻度,得到外標濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL和內標濃度均為5.0ng/mL的標準工作液系列。
色譜柱:ACQUITY UPLC? BEH C18,(2.1×100mm,1.7μm) ;流動相: 0.1%甲酸/水(A相)+0.1%甲酸/乙腈(B相),梯度洗脫條件見表1;流速:0.3mL/min;電離模式:ESI;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:MRM ,質譜條件見表2;進樣量:5.0μL 。
表1 梯度洗脫條件
表2 9種-受體激動劑質譜條件
圖1 9種-受體激動劑總離子流圖
用LC-MS/MS對2.3.3項下的混合標準工作液系列進行測定,每個濃度重復測定2次。以相對應的響應值為縱坐標(y),以標準工作液的濃度為橫坐標(x),繪制標準曲線,計算回歸方程。
對2.2.3項下方法檢出限樣品進行測定,9種β-受體激動劑的信噪比均大于3,則9種β-受體激動劑的檢出限為:=0.2ng/g=0.2μg/kg。對2.2.3項下方法定量限樣品進行測定,9種β-受體激動劑的信噪比均大于10,則9種β-受體激動劑的定最限為:種β-受體激動劑的標準曲線方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量限的測定結果見表3。
表3 9種β-受體激動劑的標曲方程、相關系數、檢出限和定量限
從表3可以看出,9種β-受體激動劑在一定范圍內呈良好的線性關系,相關系數均大于0.996,檢出限均為0.2μg/kg,定量限均為0.5μg/kg。本研究中的方法檢出限和定量限與國家標準GB 31658.22-2022是一致的,說明本研究建立的方法能夠滿足國標GB 31658.22-2022的要求。
實驗中發現個別β-受體激動劑比較容易殘留,因此標準曲線最高點的濃度不易配制過大,且應注意走完標準曲線后應多進幾針空白以降低或消除殘留。
對2.2.4項下低、中、高加標樣品進行測定,回收率結果如表4所示。
表4 9種β-受體激動劑加標回收率(n=6)
按照GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[14]中的質量控制要求,當被測組分含量小于0.1μg/mL(即小于100ng/mL)時,回收率應在60%~120%的范圍內。表4中9種β-受體激動劑低、中、高的回收率在70.3%~100.1%之間,符合要求。本方法在樣品前處理時,在樣品中加入經乙腈飽和的正己烷是為了除脂,并顯著減少脂質和脂肪酸引起的離子抑制效應[15]。
按照GB 31658.22-2022的方法制備樣品,由于樣品前處理較復雜且受到所使用的MCX陽離交換柱的柱效影響,目標組分損失較大,造成加標樣品的回收率略低于本研究的回收率。
從2022年的抽檢樣品中隨機抽取10批次豬肉樣品,按本研究制定的樣品前處理方法制備后進行留樣再測,經LC-MS/MS分析,結果表明10批次樣品中9種β-受體激動劑均未檢出,與按國家標準GB 31658.22-2022進行檢測的結果一致。
對2.2.5項下的質控樣品進行測定,帶入標曲方程計算,測定結果如表5所示。
表5 4種β-受體激動劑質控樣測定結果
按照GB 31658.22-2022的方法處理質控樣品,4種β-受體激動劑的測定結果均在滿意值范圍內;用本研究制定的方法對質控樣處理后上機測定,4種β-受體激動劑的測定結果也均在滿意值范圍內,證明了該樣品前處理方法的適用性。在參加中國檢科院《豬肉中鹽酸克倫特羅的測定》能力驗證活動中,實驗人員采用本研究制定的方法處理樣品后測定,取得了滿意結果。
本研究建立了一種液質聯用儀測定豬肉中9種β-受體激動劑的樣品前處理方法,該方法的檢出限、定量限和加標回收率均滿足相關國家標準要求,質控樣的測定值均在滿意值范圍之內,說明建立的樣品前處理方法是可行的。該方法不用酶解,省時省力,大大降低了檢測成本,為動物源性食品中β-受體激動劑的檢測提供了參考和借鑒。