短時減壓處理對冷藏及貨架期藍莓品質的影響

張 琳，徐 帆，呂靜祎，2，葛永紅，2，米紅波，2，陳敬鑫，2

（1.渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧錦州 121013；2.生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州 121013）

0 引言

藍莓具有較高的營養和經濟價值，被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一，被譽為“漿果之王”［1］。采后藍莓易出現果實失重、硬度降低、呼吸強度增加和營養成分減少等品質劣變現象［2］。目前，藍莓果實的保鮮技術主要有低溫保鮮、涂膜和氣調貯藏等，均可有效保持藍莓果實的品質和營養價值。然而，藍莓低溫貯藏時易發生冷害；涂膜技術操作復雜，均一性差；氣調貯藏時氣體濃度不易控制，易誘發生理性病害［3-5］。由此，基于當前產業需求，藍莓果實采后保鮮技術亟需更新。

近年來，減壓技術引起了果蔬采后研究工作者的關注。研究表明，對比氣調貯藏，減壓貯藏可使果蔬貯藏期延長10%～30%，較低溫貯藏延長30%～50%［6］。減壓貯藏旨在營造“低壓、低溫、高濕、換氣”環境，可有效抑制呼吸，減緩果蔬新陳代謝，抑制病原菌生長［7］。此外，采后藍莓果實具有較高的呼吸強度和蒸騰速率，因此其貨架期較短［8］。經過低壓貯藏的果蔬離開貯藏環境之后，恢復常態和后熟的過程比較緩慢，可有效延長果蔬的貨架期［9］。與長期減壓貯藏相比，減壓處理時間短，可有效提高減壓設備利用率，節約運行成本，其后續效應亦可抑制冷藏過程中品質劣變和冷害的發生，延長冷藏保鮮期。

藍莓果實為營養價值和商品價值較高的漿果代表，且其體積小，易于分裝，適用減壓貯藏或短時減壓處理技術。本文以‘北陸’藍莓為試驗對象，研究2 kPa 減壓處理對后續貯藏及貨架期間果實品質、香氣成分生成及相關抗性酶活性的影響，以期為采后藍莓果實低壓處理的進一步生產應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘北陸’藍莓果實采購于錦州市娘娘宮藍莓采摘園，果實均為九成熟，采收后1 h 內運回實驗室，挑選無機械損傷、無病蟲害、質地優良、顏色相近、大小均一的果實，置于室溫條件［（20±2）℃，濕度45%～47%］待用。

濃鹽酸、甲醇，天津致誠化學制品有限公司；氯化鈉，2-辛醇（色譜純，≥99.8%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水醋酸鈉、聚乙二醇6000、聚乙烯吡絡烷酮、Triton X-100、過氧化氫、二硫蘇糖醇、L-蛋氨酸、氮藍四唑、核黃素硼酸、L-苯丙氨酸，北京沃凱生物科技有限公司。以上溶劑均為分析純（＞99.5%）。

1.2 儀器與設備

H1650R 型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；PC-3 型真空干燥器（藤原工具有限公司）；JA5003 型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；PAL-1 型數顯糖度計（廣州市愛宕科學儀器有限公司）；FE28型pH 計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV-2550 型紫外分光光度計（島津儀器（蘇州）有限公司）；PBI Dansensor 型便攜頂空分析儀（丹圣（上海）貿易有限公司）；7890N/5975 型氣相色譜-質譜聯用儀（安捷倫科技（中國）有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓果實處理

將挑選好的藍莓分裝成盒，約125 g/盒，放入聚乙烯袋中，并選取等距4 個點打孔，孔徑約為1 cm，以保持85%～95%相對濕度。將藍莓果實分成3 組：常壓（101 kPa）冷藏組（以下簡稱CK）；12 h 減壓預處理組，將藍莓果實于（2±0.5）kPa 減壓處理12 h 后，取出置于常壓下冷藏（以下簡稱LP12h）；24 h 減壓預處理組，將藍莓果實于（2±0.5）kPa 減壓處理24 h 后，取出置于常壓下冷藏（以下簡稱LP24h）。預處理溫度均為4 ℃。隨后進行4 ℃冷藏，分別于第0，7，14，21，28 d 進行取樣。同時，模擬貨架期2 d，即將冷藏后果實在20 ℃下放置2 d，分別記錄為（0+2），（7+2），（14+2），（21+2），（28+2）d。在取樣當天測定失重率、呼吸強度和可溶性固形物含量（Soluble Solids Content，SSC）等指標。同時，將樣品經液氮冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中，以用于后續試驗。每個指標均做3 次以上生物學重復。

1.3.2 腐爛率和失重率

腐爛率測定采用計數法［10］。隨機取3 盒藍莓果實，以表面有霉菌、破裂和流水等現象記為腐爛，計算公式如下：

式中 W——腐爛率；

Nx——腐爛果數量；

N0——總果數量。

失重率測定采用稱量法。隨機取3 盒藍莓果實，計算公式如下：

式中 X——失重率；

m0——樣品的初始質量，g；

mx——貯藏第x 天時樣品的質量，g。

1.3.3 呼吸強度

參照SILVA 等［11］的方法并做部分修改。隨機選取30 個果實，隨機分為3 組，分別置于容量為250 mL 玻璃燒杯內密封，于20 ℃條件下放置2 h 后，用50 mL 注射器將燒杯內氣體勻速抽送5次，使杯內氣體混合均勻。用頂空分析儀測定每個燒杯內的CO2含量。計算公式如下：

式中 H——呼吸強度，mg CO2/（kg·h）；

φ—— 密閉空間中CO2的體積分數，%；

V——玻璃燒杯中密閉空間體積，mL；

1.96—— CO2的摩爾質量與摩爾體積之比（44/22.4，按標準狀況下計算）；

m——藍莓質量，kg；

t——放置時間，h。

1.3.4 可溶性固形物含量

取20 個藍莓果實，在研缽中研磨成勻漿，于4 000 r/min 條件下離心作用10 min，取上清液用數顯糖度計測定，以質量分數（%）表示。

1.3.5 總酚和類黃酮含量

參照曹建康等［12］方法，略有改動。稱取2.00 g果肉，加入少許1% HCl-甲醇溶液研磨成勻漿后，轉移至20 mL 刻度試管定容。于4 ℃條件下避光提取20 min，加活性炭；再于4 ℃，12 000 r/min 離心作用至脫色，收集上清液。以1% HCl-甲醇溶液作為對照，用紫外分光光度計分別在波長280，325 nm 處測定樣品的吸光度。以沒食子酸和蘆丁制作標準曲線，分別以其當量計算總酚和類黃酮含量，單位為mg/g。

1.3.6 香氣成分

參考LI 等［13］的方法并做部分修改。將冷凍的藍莓果實研磨至均勻粉末狀。稱取3.00 g 粉末狀樣品置于20 mL 樣品瓶中，加入3 mL 飽和氯化鈉溶液，再加入1 μL 2-辛醇水溶液（0.812 g/L）作為內標，迅速蓋上蓋子并用封口膜密封。每個樣品進行3 次重復試驗。

果實香氣物質的收集采用固相微萃取法。使用前，將萃取頭（50/30 μm，PDMS/CAR/DVB，Supelco）進行250 ℃老化30 min。將樣品瓶置于磁力攪拌器上，于50 ℃，600 r/min 轉速條件下平衡15 min；然后將萃取頭插進樣品瓶的頂空部位，推出石英纖維距液面1～2 cm 處，萃取30 min。萃取結束后，迅速插入到氣相色譜-質譜聯用儀進行分析。

藍莓果實揮發性成分分析的氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；氦氣作為載氣，流速為1.0 mL/min，不分流模式進樣；進樣口溫度250 ℃，解析5 min。升溫條件參照LI 等［13］的方法并進行優化，初始柱溫為40 ℃，保持3 min；以3 ℃/min 的速率上升至120 ℃并保持2 min；最后以8 ℃/min 的速率上升至230 ℃并維持4 min，總運行時間為49.4 min。

質譜條件參考張強等［14］的方法。界面溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，質譜檢測器為EI 模式，電壓為70 eV，四極桿溫度為150 ℃，質譜檢測范圍為m/z 30～550 amu。采集到的質譜圖通過檢索NIST11 標準質譜庫（NIST Chemistry WebBook.）與標準圖譜比對，根據得到的檢索信息以及匹配度評分確定香氣物質。

1.3.7 抗性酶活性分析

（1）超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定參照GE 等［15］的方法并修改。稱取1.00 g 藍莓果肉，加入10 mL 0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH=7.8），在冰浴條件迅速研磨成勻漿，于4 ℃條件下12 000 r/min 離心作用30 min，取上清液待測定。酶活性測定：合并上清液（0.3 mL）、磷酸緩沖液（1.5 mL，50 mmol/L）、乙二胺四乙酸二鈉（0.3 mL，0.1 mmol/L）、氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）（0.3 mL，0.75 mmol/L）、甲硫氨酸（0.3 mL，130 mmol/L）和核黃素（0.3 mL，20 μmol/L），混勻后于4 000 lux 日光燈下反應15 min，放置暗處反應 15 min，于560 nm 處測定吸光度（OD）值。SOD 的一個活性單位（U）定義為每分鐘每克鮮重組織的反應體系對NBT 光化還原50%的抑制。

（2）過氧化氫酶

過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測定參照LI等［16］的方法。稱取1.00 g 藍莓果肉，加入10 mL的提取緩沖液（含有5.0 mmol/L 二硫蘇糖醇和2.0%交聯聚乙烯吡咯烷酮），在冰浴下研磨成勻漿，于4 ℃，12 000 r/min 離心作用30 min，收集上清液，低溫保存備用。

向2.9 mL 20 mmol/L H2O2溶液中加入100 μL酶液，每隔30 s 于240 nm 處測定OD 值，持續2 min，以蒸餾水為參比調零。以每分鐘吸光值變化0.01 為一個酶活力單位（U），CAT 活性以U/g表示。

（3）多酚氧化酶

多酚氧化酶（polyphenol oxidas，PPO）活性測定采用比色法，參照曹建康等［12］的方法。稱取1.00 g 藍莓果肉，加入10 mL 的提取緩沖液（含有1 mmol 聚乙二醇單甲基醚、4%交聯聚乙烯吡咯烷酮和1%曲拉通X-100），在冰浴中研磨成勻漿，于4 ℃，12 000 r/min 離心作用30 min，收集上清液，低溫保存備用。

取1 只試管，加入2.5 mL 50 mmol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和1.0 mL 50 mmol/L 鄰苯二酚溶液，最后加入100 μL 酶液開始反應，測定其在2 min 內在420 nm 處吸光度的變化值，以蒸餾水為參比調零。以每分鐘吸光值變化0.01 為一個酶活力單位（U），PPO 活性以U/g 表示。

（4）過氧化物酶

過氧化物酶（peroxide，POD）活性測定采用愈創木酚法。稱取1.00 g 藍莓果肉，加入10 mL的提取緩沖液（含有1 mmol 聚乙二醇、4%交聯聚乙烯吡咯烷酮和1%曲拉通X-100），在冰浴中研磨成勻漿，于4 ℃，12 000 r/min 離心作用30 min，收集上清液，低溫保存備用。

取1 支試管加入0.3 mL 酶液、3 mL 25 mmol/L愈創木酚溶液（使用pH=5.5，濃度為50 mmol/L的乙酸緩沖液配制），再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液后開始反應。測定其在2 min 內在470 nm處吸光度的變化值，以蒸餾水為參比調零。以每分鐘吸光值變化0.01 為一個酶活力單位（U），POD 活性以U/g 表示。

（5）苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活性測定參照MARINA 等［17］的方法。稱取1.00 g 藍莓果肉，加入10 mL 的提取緩沖液（含有40 g/L 聚乙烯吡咯烷酮、2 mmol/L 乙二胺四乙酸和5 mmol/L β-巰基乙醇），在冰浴中研磨成勻漿，將勻漿液全部轉入離心管中，于4 ℃ 12 000 r/min離心作用30 min，收集上清液，低溫保存備用。

取2 支試管，分別加入3 mL 50 mmol/L，pH=8.8 硼酸緩沖液和0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液。向其中一支試管中加入0.5 mL 酶提取液，另一支試管中加入0.5 mL 經煮沸5 min 的失活酶液作為對照；然后將2 支試管置于37 ℃保溫60 min。保溫結束時，立即向2 支反應管中各加入0.1 mL 6 mol/L 鹽酸溶液以終止反應。以蒸餾水為參比空白調零，分別測定樣品和對照反應管中溶液在波長290 nm 處的吸光度值（OD1 和OD0）。以每小時吸光值變化0.01 為一個酶活力單位（U），PAL 活性以U/g 表示。

1.3.8 數據分析

試驗所有結果均進行3 次以上生物學重復試驗。用 Excel 2007 軟件處理數據和計算標準偏差；利用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析，P ＜0.05 表示各處理組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 對腐爛率、失重率的影響

減壓處理對腐爛率和失重率的影響如圖1所示。

圖1 減壓處理對腐爛率和失重率的影響Fig.1 Effect of hypobaric treatments on the decay rate and weight loss rate

在整個冷藏期間，藍莓的腐爛率隨貯藏時間的延長而不斷上升，如圖1（a）所示。21 d 時，藍莓果實的腐敗率顯著增加，此時CK，LP12h，LP24h 的腐爛率分別為22.78%，17.77%，6.98%。（28+2）d 時，LP12h 和LP24h 處理的果實腐敗率分別為44.84%，26.76%，分別比CK 組低24.37%，42.45%?？梢?，適當的減壓處理可有效抑制貯藏期間藍莓果實受病原菌的侵害，并延遲其腐爛的發生時間［18］。

采后果實的失重主要由于呼吸作用及水分蒸騰，反映水分的蒸發和營養物質的消耗［19-20］。由圖1（b）可知，在貯藏過程中，藍莓果實的失重率呈上升趨勢，但減壓處理組果實的失重率始終顯著低于CK 組（P＜0.05）。（28+2）d 時，經減壓處理藍莓果實的失重率均保持在較低水平，果實質地良好。由此可見，減壓預處理有利于提高藍莓果實的貯藏性。

2.2 對呼吸強度和可溶性固形物的影響

由圖2（a）可知，在貯藏期間各組藍莓果實呼吸均呈上升趨勢。7 d 時，LP24h 組果實的呼吸強度顯著低于CK 組（P＜0.05），一方面可能與減壓處理所產生的低氧環境有關；另一方面減壓也有利于果實內乙烯、乙醛、乙醇和O2等成分向外擴散。在（21+2）d 和（28+2）d 時，果實的呼吸強度均低于其對應的貯藏期果實，這可能與貯藏后期果實的衰老有關。貨架期間，相對于CK 組，LP24h 組果實的呼吸強度仍處于較低水平，表明短時減壓處理對于果實呼吸強度的抑制作用具有一定的后續效應。

圖2 減壓處理對呼吸強度和可溶性固形物含量的影響Fig.2 Effect of hypobaric treatments on the respiratory intensity and soluble solids content

由圖2（b）可知，貯藏過程中藍莓果實的SSC呈上升趨勢，但LP12h 和LP24h 組果實的SSC 顯著低于CK 組（P＜0.05）。（7+2）d 時，CK 組的SSC顯著高于LP12h 和LP24h 組（P＜0.05）；（14+12）d時，各組SSC 無顯著差異（P＞0.05）；而（28+2）d時，減壓處理后的藍莓果實的SSC 均高于CK 組（P＜0.05）。

SSC 組成成分主要有水溶性糖、酸、維生素及礦物質［21］。一般情況下，在果實貯藏初期，隨著果實的成熟，果實內有機物質可轉化為可溶性糖、氨基酸和維生素；在貯藏后期，果實開始衰老，有機物無法充足供應，呼吸作用消耗SSC，進而導致SSC 下降［22］。短時減壓可抑制果實的呼吸作用，導致有機物轉化成可溶性糖等物質的速率降低［23］。盡管2 kPa 低壓與CK 組藍莓果實的SSC含量均呈先升高后下降的趨勢，但是低壓處理延緩了果實SSC 水平的升高，且在貯藏后期維持較高的SSC 水平。

2.3 對香氣成分含量的影響

酯類香氣化合物具有特殊的甜香，是藍莓果實中重要的芳香物質［24］。如圖3（a）所示，藍莓果實的總酯含量總體呈先上升后下降的趨勢。所有處理組藍莓果實的總酯含量均在21 d 達到最大，此時CK 組為266.85 μg/kg，分別為LP12h 和LP24h 處理組的1.5，1.3 倍。這說明減壓處理抑制了藍莓果實酯類的積累，且處理時間越長，抑制效果越強。

圖3 減壓處理對總酯、總醛、總醇和總萜烯類含量的影響Fig.3 Effects of hypobaric treatments on the contents of total esters, total aldehydes, total alcohols and total terpenes

如圖3（b）所示，對于醛類物質來說，整個貯藏和貨架期間藍莓果實中的醛類含量為1 910.94～4 355.65 μg/kg，占總揮發性化合物的56%以上。第7 d 時，醛類含量最高，可占總揮發性成分的90%。在貯藏過程中，果實中總醛含量先上升后下降?？梢?，減壓處理促進醛類的積累，且其后續效應在貨架期間仍較明顯。

如圖3（c）所示，隨著貯藏時間的延長，藍莓的醇類物質含量呈下降趨勢；14 d 后，其醇類含量趨于穩定。表明減壓處理有利于抑制藍莓醇類物質的合成。然而，貯藏后期及貨架期間三者總醇含量無顯著差異（P ＞ 0.05）。

如圖3（d）所示，CK 組藍莓果實的萜烯含量峰值出現在第14 d，為723.68 μg/kg，而LP12h 和LP24h 組的峰值分別出現在第7，14 d，且兩峰值均小于CK 組。

萜類是小漿果類與其他果實香氣成分的最主要區別［25］。對大多數藍莓品種而言，其揮發性成分主要由醛類、醇類、萜類和烯類組成，且果實中萜類物質的種類較多，與其較高的抗氧化能力有關［26］。在整個貯藏過程中，2 kPa 低壓預處理抑制了酯類和醇類，但有助于貯藏后期萜烯類物質的積累。減壓處理也有利于維持貯藏后期藍莓香氣成分種類的多樣化。

2.4 對總酚和類黃酮含量的影響

酚類物質對植物的抗逆境生理具有重要作用，主要是通過清除或控制由逆境產生的氧自由基，從而保護植物體免受損傷［27］。如圖4（a）所示，在貯藏期間，CK 組果實的總酚含量于第7 d 時達到峰值，為3.18 mg/g，隨后呈下降趨勢。LP12h 和LP24h 組果實的總酚含量均在第14 d達到峰值，分別為6.40，9.58 mg/g。貨架期間經減壓處理的藍莓果實的總酚含量高于CK 組，尤其是LP24h 組。這表明減壓預處理有助于提高冷藏過程中藍莓果實的總酚含量，使其抗氧化活性維持在相對較高水平。

圖4 減壓處理對總酚和類黃酮含量的影響Fig.4 Effect of hypobaric treatments on the contents of total phenols and flavonoids

由圖4（b）可見，短時減壓處理組和CK 組的類黃酮含量的變化趨勢與總酚一致。減壓處理可顯著提高貯藏時藍莓果實的類黃酮含量，且24 h 減壓處理強于12 h 減壓處理。對于貨架期間，減壓處理藍莓果實的總酚和類黃酮含量均在減壓后迅速升高，并在隨后的貯藏和貨架期間也一直處于較高水平。說明短時減壓可以有效提高果實采后抗氧化能力，且類黃酮物質在減壓處理應激響應過程中可能起到較為重要的作用。

2.5 對抗性酶活性的影響

如圖5（a）所示，在貯藏過程中，藍莓果實中CAT 含量呈先上升后下降的趨勢，峰值出現在第21 d。LP24h，LP12h 和CK 組的峰值量分別為485.00，306.67，218.33 U/g。由此可見，短時減壓可以誘導CAT 活性的增加，且24 h 減壓處理的效果更好。

圖5 減壓處理對CAT，POD，PPO 和PAL 活性的影響Fig.5 Effect of hypobaric treatments on the activities of CAT、POD、PPO and PAL

由圖5（b）可知，在貯藏期間，所有處理組藍莓果實的POD 活性均呈先上升后下降趨勢，且均在第7 d 達到峰值，分別為275.00，305.00，471.90 U/g。減壓處理24 h 可有效提高果實在冷藏期間POD 活性，并延緩其常溫貨架期間POD 活性的下降，從而維持果實內的氧化還原平衡。

由圖5（c）可知，在貯藏前期（7 d），減壓處理組的PPO 活性與CK 組無顯著差異（P ＞0.05）；在貯藏后期（21 d 和28 d），減壓處理組的PPO活性顯著高于CK 組（P ＜ 0.05）。在貨架期間，除第14 d 外，減壓處理組藍莓果實的PPO 活性均顯著大于CK 組（P ＜ 0.05）。

從圖5（d）可見，在貯藏期間，3 組果實PAL呈先上升后下降的趨勢。減壓處理組果實的PAL活性上升較快，在第21 d 時達到最大值，LP12h和LP24h 組分別為22.82，27.90 U/g，且顯著高于CK 組（P ＜ 0.05）。前人研究表明，50 kPa 減壓處理12 h 后，草莓果實的PAL 活性也呈現類似趨勢［28］。在貨架期間，LP24h 組藍莓果實的PAL活性始終保持顯著高于CK 組（P ＜ 0.05）。

果實中PAL，POD，PPO 等防御酶可通過誘導組織中酚類物質、木質素等次生代謝產物合成，間接提高果實抗性［29］。短時減壓處理可迅速提高藍莓果實中SOD，CAT，PPO，POD，PAL 等抗性酶的活性，且貯藏及貨架期間SOD，CAT，PAL 酶活性維持在相對較高水平。這可能是減壓處理后藍莓腐敗率較低的可能原因之一。因為減壓環境對于果實本身是一種逆境，刺激果實產生抗性，導致其相關抗性酶活性的增加，從而防止過氧化損傷，有利于保持細胞的正常結構，保護果實正常代謝機能，有助于藍莓果實更好地抵御外界微生物的入侵，并最終延緩果實貯藏期衰老和腐爛。HASHMI 等［29］的研究結果與本文一致。

3 結語

經短時減壓處理可抑制藍莓果實的呼吸強度，減少其營養物質損耗；抑制香氣成分中酯類、醇類物質的產生，但保持貯藏后期萜烯類物質的積累水平；提高果實的總酚和類黃酮的含量，增強果實中抗性酶活性，進而強化其抗氧化能力。因此，2 kPa 低壓預處理有助于維持藍莓果實的貯藏品質。在今后的研究中，可探究如何將減壓預處理與其他現有技術（如植物精油熏蒸）有效結合，以提高藍莓果實的耐貯藏能力并延長其貨架期，以進一步推進低壓技術在果蔬保鮮領域的實際應用。