超聲凍融-復合酶解制備小麥多孔淀粉及其吸附特性

李彩妮，安鳳平，2，石 娟，孫帥豪，宋洪波，2

（1.福建農林大學 食品科學學院，福州 350002；2.福建省特種淀粉品質科學與加工技術重點實驗室，福州 350002）

0 引言

多孔淀粉是一種新型的改性淀粉［1］，具有較高的吸附性能和良好的釋放性能，在食品、藥品等領域有著應用潛力［2］。復合酶（α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶）是制備多孔淀粉的常用方法，該法制得的多孔淀粉比表面積和孔隙率較大［3］。有研究表明，超聲的空化作用導致淀粉內部產生孔隙［4］，酶解前對淀粉進行超聲預處理，增加了淀粉微孔的數量和比例［5］。經過微波超聲波輔助復合酶解得到的木薯多孔淀粉，其吸附性能較單純酶解制得多孔淀粉更好［6］。凍融可使淀粉顆粒產生小孔從而增加淀粉對酶水解的敏感性，因此凍融技術結合酶解有利于制備吸附性能更好的多孔淀粉［7］。

小麥是我國的主要農作物之一［8］。國內外對小麥多孔淀粉的研究較少，且制備方法較單一，制備的多孔淀粉吸附性能較差［9］。因此，本文以小麥淀粉為原料，對比研究超聲凍融、復合酶處理以及超聲凍融-復合酶解淀粉的理化性質和吸附性能，為超聲凍融-復合酶解制備小麥多孔淀粉的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥淀粉、α-淀粉酶（2×104U/mL）、糖化酶（105U/mL），上海源葉生物有限公司；花生油，食品級，青島嘉里花生油有限公司；亞甲基藍（分析純）、色譜級溴化鉀，國藥集團化學試劑有限公司；直鏈淀粉含量檢測試劑盒（BC4260-50T/48S），索萊寶試劑公司。

1.2 主要儀器與設備

KQ2200DV 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16 型高速離心機（四川蜀克儀器有限公司）；UV-1700 型紫外可見分光光度計［島津儀器（蘇州）有限公司］；Nova Nano SEM230 型場發射掃描電子顯微鏡（捷克FEI CZECH REPUBLICS.R.O 公司）；VERTEX70 型傅里葉變換紅外光譜儀［布魯克（北京）科技有限公司］；Ultima IV 型X-射線衍射儀（日本Rigaku公司）；asap2460 型比表面積及孔隙度分析儀（美國麥克公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲凍融小麥淀粉的制備

參考KEERATIBURANA 等［10］的方法并稍作修改。將小麥淀粉（NS）與蒸餾水按質量比1：2混合攪拌3 h，-25 ℃冷凍6 h；以頻率為40 kHz、功率為500 W 于室溫超聲處理1 h；干燥后粉碎并過100 目篩得到超聲凍融淀粉（US-IR）。

1.3.2 小麥多孔淀粉的制備

參考ZHAO 等［11］的方法并在預試驗基礎上有所改動。分別將NS，US-IR 與乙酸緩沖溶液（0.5 mol/L，pH=4.6）按料液比1：3 混合均勻形成淀粉乳，55 ℃恒溫水浴15 min；加入復合物酶溶液（α-淀粉酶和糖化酶比為1：4，U：U），55 ℃恒溫水浴振蕩24 h；加入NaOH 調節pH 值至11 結束水解反應；加入2 倍無水乙醇使酶失活，用無水乙醇和蒸餾水反復洗滌3 次，抽濾后55 ℃烘干12 h；粉碎并過100 目篩，分別得到復合酶解多孔淀粉（ES）和超聲凍融-復合酶解多孔淀粉（CS）。

1.3.3 顆粒形態分析

取適量樣品均勻灑在導電膠表面，用洗耳球吹去多余淀粉并在真空條件下噴金，采用掃描電鏡以6 kV 加速電壓觀察樣品形貌。

1.3.4 低溫氮吸附測定

稱取200 mg 樣品，置于比表面積及孔隙度分析儀中于45 ℃脫氣24 h，在77.35 K 的液氮溫度下測定淀粉樣品的氮氣吸附-脫附等溫線。采用儀器自帶分析軟件，分別以BET（Brunauer-Emmett-Teller） 和BJH（Barrett-Joyner-Halenda）法計算淀粉樣品的比表面積和總孔體積。

1.3.5 直鏈淀粉含量測定

采用試劑盒測定直鏈淀粉含量，操作步驟和計算公式參照試劑盒說明書。

1.3.6 X 射線衍射分析

采用X 射線衍射儀測定樣品的晶體結構。測定條件：40 mA，40 kV，Cu-Kα 射線，掃描速率為2（°）/min，衍射角（2 θ）范圍為5～35°。使用MDI Jade 6.0 軟件計算淀粉的相對結晶度［12］。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析

參考蔡文琪等［13］的方法并稍作修改。將樣品和溴化鉀研磨10 min，放入壓模中，抽真空壓片。儀器測定參數：掃描波數范圍在400～4 000 cm-1，分辨率為0.8 cm-1，掃描次數為32 次。

1.3.8 溶解度和膨脹力測定

參考趙安琪［14］的方法并稍作修改。將干燥的離心管和培養皿稱重，分別記為A1（g）和B1（g）；將0.4 g 樣品和20 mL 蒸餾水于離心管中混合均勻，80 ℃恒溫水浴振蕩30 min，5 500 r/min離心作用15 min；取上清液倒入培養皿中，稱得離心管與沉淀物的質量為A2（g），將裝有上清液的培養皿105 ℃干燥至恒重，記為B2（g）。淀粉樣品的溶解度（SOL）和膨脹力（SP）分別按下式計算：

1.3.9 吸附性測定

（1）亞甲基藍吸附量的測定

取0.5 g 淀粉樣品和30 mL 亞甲基藍溶液（0.5 g/L）混合，25 ℃水浴振蕩器吸附2 h，倒入離心管中，以5 500 r/min 離心作用10 min，計算上層亞甲基藍溶液的體積；取1 mL 稀釋100 倍后的溶液于紫外可見分光光度計665 nm 波長處測定吸光值，根據預先繪制的亞甲基藍標準曲線計算游離亞甲基藍濃度。亞甲基藍吸附量（Qe）按下式計算：

式中 C0，C1—— 亞甲基藍初濃度和游離亞甲基藍濃度，mg/L；

V0，V1—— 加入的甲基藍體積和上層亞甲基藍溶液的體積，L；

m——淀粉質量，g。

（2）吸油率和吸水率的測定

將0.5 g 樣品和5 mL 蒸餾水或花生油于已知質量W0（g）的離心管中渦旋5 min，室溫靜置30 min；以5 500 r/min 離心作用10 min，除去淀粉表面水（或油）后得到沉淀物，稱重記為W1（g）。則淀粉樣品的吸油率/吸水率（AC）計算如下：

1.4 數據分析

試驗重復3 次，采用Microsoft Excel 2003 和DPS 18.10 對數據進行處理和方差分析，結果以平均值±標準偏差表示；采用Duncan 法進行檢驗，p＜0.05 為顯著水平；使用Origin 2018 繪圖。

2 結果與分析

2.1 顆粒形態分析

如圖1 所示，圖A 表明NS為球狀或橢狀的顆粒，表面較光滑。圖B 所示的US-IR 表面出現侵蝕和凹陷，說明經超聲凍融處理的淀粉表面受到一定程度破壞，但顆粒完整性未被破壞，這是由于淀粉顆粒中的水分經冷凍形成冰晶過程中產生的膨脹作用，以及超聲波強烈的振蕩和空穴效應等對淀粉顆粒表面產生了一定侵蝕作用［15］。圖C 所示的ES 表面侵蝕明顯，沿赤道方向形成孔洞并產生一些破碎淀粉，此結果與YAIZA 等［16］采用糖化酶處理小麥淀粉的現象相似。圖D 顯示CS 呈現出空心狀結構，表面分布著明顯的孔，說明超聲凍融處理造成淀粉表面被侵蝕，成為復合酶水解的薄弱點，促進復合酶水解，因此形成了多孔淀粉。

圖1 不同淀粉的掃描電子顯微鏡圖（×2 000 和×10 000）Fig.1 Scanning electron micrographs of different starch samples（×2 000 and ×10 000）

2.2 低溫氮吸附分析

不同淀粉樣品的氮氣吸附-脫附等溫線如圖2 所示。

圖2 不同淀粉樣品的氮氣吸附-脫附等溫線Fig.2 Nitrogen adsorption-desorption isotherms of different starch samples

根據國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC）分類方法可知，4 個樣品的氮氣吸附等溫線為Ⅱ型，吸附和脫附等溫線均不重合，滯后環為H3型，這是多層吸附的介孔材料的典型特征［17］。US-IR 的吸附等溫線在NS 上方，說明超聲凍融提高淀粉對氮氣的吸附量。與NS 和US-IR 相比，ES 和CS 在相對壓力接近1 時急劇升高，是因為發生毛細凝聚現象［18］。

各樣品的比表面積及總孔體積如圖3 所示。NS，US-IR，ES 和CS 的比表面積和總孔體積均依次顯著增大（p＜0.05）。特別是CS 的比表面積和總孔體積值均最大，這是因為超聲凍融處理使淀粉表面積增大，增加復合酶與淀粉的接觸面積，促進復合酶對淀粉的水解。這與圖1 所示的各樣品的外觀形貌特征具有一致性。

圖3 不同淀粉樣品的比表面積和總孔體積Fig.3 Specific surface area and total pore volume of different starch samples

2.3 直鏈淀粉含量和X 射線衍射分析

淀粉樣品的X 射線衍射圖譜見圖4。

圖4 不同淀粉樣品的X 射線衍射圖Fig.4 XRD of different starch samples

NS 在15，17，18，23°（2 θ）處出現尖峰衍射特征峰，這是A 型晶型的典型特征，與ZHANG 等和CHI 等的報道一致［19-20］。4 種淀粉呈現相似的X 射線衍射圖譜，說明超聲凍融、復合酶解和超聲凍融-復合酶解均未改變小麥淀粉的晶型。與NS 和US-IR 相比，ES 和CS 在大約20°（2 θ）處的衍射峰更尖銳，是因為復合酶解增加了直鏈淀粉的相對含量，從而促進直鏈淀粉與脂質發生反應形成直鏈淀粉-脂質復合物所致［21-22］。

淀粉樣品的直鏈淀粉含量以及相對結晶度如表1 所示。與NS 的直鏈淀粉含量為23.25%相比，US-IR 的含量顯著降低（p＜0.05），一方面可能是由于超聲波對淀粉的無定形區部分降解；另一方面是冷凍過程中冰晶生長導致直鏈淀粉從無定形區部分滲出造成。相反，ES 中的直鏈淀粉含量明顯增加（p＜0.05），可能是由于支鏈淀粉的非還原性末端更多，有助于酶水解成更多的直鏈淀粉。CS 的直鏈淀粉含量為21.73%，明顯低于ES（p＜0.05），可能是超聲凍融促進復合酶對淀粉無定形區的水解，并在洗脫過程中除去了部分直鏈淀粉。

表1 不同淀粉樣品的直鏈淀粉含量和相對結晶度Tab.1 Amylose content and relative crystallinity of different starch samples %

US-IR 較NS 的相對結晶度顯著降低（p＜0.05），可能是因為冷凍過程中冰晶生長的膨脹作用以及超聲波的振蕩作用，一定程度破壞了淀粉顆粒結晶結構的有序性。ES 的相對結晶度進一步顯著降低，是因為酶解先作用于淀粉顆粒的無定形區，再作用于亞結晶區和結晶區。NS 的支鏈淀粉與直鏈淀粉相比，具有更多的非還原性末端［23］。CS 的相對結晶度高于ES，是因為超聲凍融增加了酶對淀粉無定形區域的可及性，復合酶優先在US-IR 的無定形區域進行水解。

2.4 傅里葉紅外光譜分析

淀粉短程有序又被稱為雙螺旋有序，與淀粉的相對結晶度相關［24］。1 047 cm-1處的吸光度是淀粉結晶區的結構特征，1 022 cm-1處的吸光度與無定形區有關。一般來說，淀粉的紅外光譜圖在1 047 cm-1和1 022 cm-1處吸光度的比值，一定程度上表示淀粉的相對結晶度［25］。995 cm-1處的吸收峰與C-6 處羥基的氫鍵有關［26］，1 022/955 cm-1的比值與晶體內部雙螺旋結構有關［27］，該比值越小，淀粉的雙螺旋分子越有序。

根據4 個樣品的紅外光譜圖，可得1 047/1 022 cm-1和1 022/995 cm-1比值，列于表2 中。其中，NS，US-IR，CS 的1 047/1 022 cm-1比值分別為0.88，0.87，0.86，說明淀粉經過超聲凍融或復合酶解后，雙螺旋有序結構遭到破壞，相對結晶度降低。CS 的1 047/1 022 cm-1比值顯著大于ES（p＜0.05），是因為經超聲凍融處理后，復合酶可以進一步水解淀粉的無定形區域，從而導致結晶區與無定形區的比值增大，這與X 衍射結果的變化趨勢一致。NS，US-IR，ES，CS 的1 022/995 cm-1比值依次增加（p＜0.05），說明超聲凍融和復合酶解均降低淀粉雙螺旋結構分子的有序性，其中超聲凍融結合復合酶水解的作用最明顯。

表2 不同淀粉樣品的紅外特征比值Tab.2 Infrared characteristic ratios of different starch samples

2.5 溶解度和膨脹力分析

從表3 可以看出，US-IR 的溶解度和膨脹力較NS 顯著增大（p＜0.05），是因為淀粉經超聲凍融處理，分子有序結構被破壞和游離羥基的短鏈含量增加所導致［28］。SUJKA 等［29］認為，淀粉晶體結構的破壞、水分子與直鏈淀粉或支鏈淀粉的游離羥基結合均可造成淀粉的溶脹性增加。NS和US-IR 經復合酶水解后，所制備ES 和CS 的溶解度和膨脹力均顯著增加（p＜0.05），特別是CS的溶解度和膨脹力顯著大于ES，是因為超聲凍融增加了酶對淀粉無定形區域的可及性，有助于水分子進入淀粉的無定形區。此外，CS 的比表面積和總孔體積大于ES，因此CS 具有更好的溶脹性。

表3 不同淀粉樣品的溶解度和膨脹力Tab.3 Solubility and swelling power of different starch samples

2.6 吸附性

不同淀粉的亞甲基藍吸附量、吸油率和吸水率如圖5 所示。與NS 相比，US-IR 的亞甲基藍吸附量和吸水率顯著增大（p＜0.05），是由于超聲波處理對淀粉表層侵蝕，且使淀粉顆粒結構變得松散，暴露更多的親水基團［30］。然而，US-IR 的吸油率反而顯著降低（p＜0.05），是因為超聲凍融處理減少淀粉中直鏈淀粉的含量所致。王玫玫［28］認為，直鏈淀粉分子與極性脂肪物質可以形成螺旋結構，直鏈淀粉的減少降低淀粉對油的結合能力。ES 和CS 的亞甲基藍吸附量、吸油率和吸水率較NS 和US-IR 有明顯的提高（p＜0.05），特別是CS 達到最大值，這得益于超聲凍融處理結合復合酶水解形成豐富的孔，提高溶脹能力，以及降低雙螺旋結構的有序性。

圖5 不同淀粉樣品的吸附性Fig.5 Adsorption capacities of different starch samples

3 結語

對比研究超聲凍融、復合酶（α-淀粉酶和糖化酶）處理以及超聲凍融-復合酶水解小麥淀粉的理化性質和吸附性能。小麥淀粉為A 型淀粉，超聲凍融、復合酶解和超聲凍融-復合酶解均未改變小麥淀粉的晶型；經超聲凍融處理，淀粉表面被侵蝕且分子有序性降低，復合酶水解則可形成少量孔洞的多孔淀粉，因此超聲凍融結合復合酶水解制得的多孔淀粉的比表面積和總孔體積最大，淀粉的相對結晶度較低、雙螺旋分子結構的有序性最低，使得溶脹性和吸附性顯著增大。