減量化修復地塊土壤微生物群落多樣性及影響因子初探

張書源

（1.上海市地礦工程勘察（集團）有限公司，上海 200072；2.中國地質學會城市地質災害防控技術創新基地，上海 200072）

上?！笆奈濉币巹澖ㄗh，崇明堅持生態優先，綠色發展，持續推進世界級生態島建設。為貫徹相關規定，政府計劃對崇明目前存在的不符合用地要求的土地進行減量化處理，通過工程技術手段將其恢復成可供生態或農業使用的地塊[1]。然而，環境效益較差的建設用地在減量化修復后，仍存在土壤質量低和種植效益差等問題[2]，因此對修復后土壤的生態功能恢復情況值得深入探究。

對于減量化修復的地塊，往往側重于土壤肥力與土壤污染風險評價的研究，容易忽視土壤生態功能，而微生物作為土壤物質循環與污染物降解的主要參與者，是土壤生態功能的重要指標[3-4]。土壤受到污染后，環境因子會有直接變化，從而間接影響土壤生態系統，導致土壤肥力下降，微生物多樣性降低等現象[5]。受到土壤污染的影響，微生物群落的多樣性和結構也會隨之改變[6]。近年來，隨著高通量測序技術的發展，國內外學者陸續對土壤微生物群落展開研究，如：研究表明土壤環境因子如有機質、重金屬等對土壤微生物多樣性和群落組成影響較大[7]；選取有機碳、全氮、酶活、微生物數量作為生態肥力評價指標，發現有機物料能提高土壤酶活和微生物數量，從而提高土壤質量[8]；土壤中的微生物可以通過一系列生長代謝來降解有機污染物或轉化重金屬，以此來改善土壤環境，提高土壤質量[9-10]。綜上，對于土壤微生物群落的研究已有一定基礎，但對于減量化修復地塊的物生物群落組成和結構的研究鮮有報道。

本論文選取崇明區向化鎮某鋼廠的減量化地塊為研究對象，采用高通量測序技術研究減量化地塊修復前后土壤微生物群落多樣性和群落結構影響，探討土壤減量化修復后理化性質的變化與微生物群落的相關性，旨在為減量化修復地塊整治復墾和土壤健康管理提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 研究區概況及采樣點選取

研究區位于上海市崇明區向化鎮，位于崇明島東部，地勢平坦，地處亞熱帶，年平均氣溫大約為15.1 ℃，年平均降雨量約1020 mm，氣候溫和濕潤，日照充足，四季分明，全鎮總面積53.78 km2，耕地面積4.12 萬畝（約27.47 km2）。向化鎮南北緊鄰長江，屬島嶼水網地區，水源豐富。本研究選取崇明向化鎮某鋼廠減量化地塊進行土壤監測樣點布設，均勻選取三個監測點：一個位于典型污染區（CM1）監測點，兩個普通污染區（CM2、CM3）監測點，并選取距離污染修復區500 m 以外的自然林地土壤作為對照點（CK），具體見圖1。

圖1 土壤采樣點位圖Fig.1 Soil sampling point map

1.2 采樣方法與指標檢測

（1）采樣方法

2021 年7 月，選取典型污染區監測點（CM1）和兩個普通污染區（CM2、CM3）監測點，污染修復區500 m以外的自然林地土壤作為對照點（CK），每個監測點區域采取三個土壤樣本，每個樣本用五點取樣法采取0～20 cm 耕作層土壤放入盆中混合，去除表層雜物、石塊等裝入無菌密封袋中，于4 ℃低溫保存，及時送至實驗室進行土壤理化性質、酶活及微生物檢測。

（2）指標檢測

除常規指標SOM、水溶性鹽總量、TN、AP、AK 指標外，考慮到該地塊減量化修復后會進行后續整理復墾工作，選取Fe、錳（Mn）、鋅（Zn）三個重金屬指標來反映該鋼廠減量化后對照區和污染區土壤重金屬含量變化，選取脲酶（UE）、蔗糖酶（SC）、過氧化氫酶（CAT）、中性磷酸酶（NP）來表征土壤質量變化，以便于研究土壤減量化修復后理化性質的變化與微生物群落的相關性。

土壤理化指標：SOM、水溶性鹽總量、TN、AP、AK、Fe、Mn、Zn，SOM 測定方法采用重鉻酸鉀氧化法；TN 測定方法采用半微量凱氏法；AP 測定方法采用鉬銻抗比色法；水溶性鹽總量測定方法采用重量法；AK 采用火焰光度法測定；Fe、Mn、Zn 測定方法為電感耦合等離子體發射光譜法。

土壤酶活指標：選取UE、SC、CAT、NP 四種酶，測定方法參照《土壤酶及其研究法》[11]。

土壤微生物指標：首先用DNA 試劑盒對土壤樣品中微生物DNA 進行提取，再使用NanoDrop ND-1000分光光度計測定提取的DNA 濃度和質量，使用微生物16SrRNA 基因V3～V4 區的引物進行PCR 擴增，通過QIIME 平臺進行分析，將序列拼接后進行質控、冗余分析和測序，操作分類單元（OTU）抽平后分析使用[12-13]。

1.3 數據處理方法

原始數據處理采用EXCEL2020 計算分析，理化性質和酶活的標準差及顯著性差異計算用SPSS 軟件分析完成，用R 軟件進行主成分分析和差異分析。

2 結果與討論

2.1 減量化修復對土壤理化性質的影響

崇明減量化修復地塊與對照地塊土壤理化性質如表1所示，CK 組的土壤SOM 含量顯著高于CM1 組、CM2 組、CM3 組（P＜0.05），分別高出2.08 倍、2.99 倍、1.51 倍；CK 組土壤TN 含量顯著高于CM1 組、CM2 組（P＜0.05），分別高出2.86 倍、1.74 倍；CK 組土壤AP 含量顯著高于CM1 組、CM2 組、CM3 組（P＜0.05），分別高出17.14 倍、14.80 倍、9.05 倍；CM1 組土壤中的含鹽量顯著高于其他點位（P＜0.05），高達8.33g/kg，分別是CK 組、CM2 組、CM3 組的22.51、20.83、19.37 倍。該修復場地之前為冷軋鋼廠，金屬類物質含量較多，而金屬類物質對土壤微生物、土壤中根際養分的轉化吸收、植物作物具有多重影響，可直接或間接影響土壤的生態環境[14]。CM1 組的土壤Fe 含量顯著高于CK 組和CM3（P＜0.05），分別高出1.13倍和1.10倍，Mn和Zn無顯著性差異（P＞0.05），但CK 組Zn 含量高于CM1 組、CM2 組、CM3 組，說明典型污染區土壤重金屬含量較高，但減量化修復也有一定成效。整體來看，CK 組土壤SOM、TN、AP 含量高，間接體現出未被污染地塊土壤肥力保持能力較高。

表1 不同地塊土壤理化性質Table 1 Soil physicochemical properties of different plots

2.2 減量化修復對土壤酶活性的影響

土壤酶活是土壤生態系統的重要組成部分，是土壤生態健康和質量的重要生物指標[15]，UE 在土壤中廣泛存在，土壤氮循環密切相關[16-17]；SC 和CAT 與土壤SOM 與微生物活性相關，可以表征土壤肥力與土壤質量[18]，磷酸酶可以促進土壤中磷素循環，也可以間接反映土壤生態健康[19]。崇明減量化修復地塊與對照地塊土壤酶活性如表2 所示，CK 組UE 活性高達742.12 μg/d/g，顯著高于CM1、CM2、CM3三組2.43倍、2.17倍、1.98倍（P＜0.05），污染修復區不同點位之間（CM1 組和CM3 組）也呈現顯著性差異（P＜0.05）；CK 組SC 活性高達33.25 mg/d/g，顯著高于CM1、CM2、CM3 三組16.79 倍、7.15 倍、3.03 倍，研究表明，SC 活性越高，土壤質量越高[20]，說明對照組土壤質量好于污染修復地塊；CK 組NP 顯著高于CM1、CM2、CM3 三組13.07 倍、9.63 倍、5.55 倍，土壤CAT活性四組無顯著性差異（P＞0.05）。整體來看，未被污染地塊酶活性較強，污染修復地塊經修復后酶活性仍較低。有研究表明土壤酶活性受到土壤環境的影響較大[21-22]。

表2 不同地塊土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activities of different plots

2.3 減量化修復對土壤微生物多樣性和群落的影響

（1）土壤微生物多樣性分析

崇明減量化修復地塊與對照地塊土壤微生物多樣性可以通過多樣性指數表示，來反映土壤生態系統的穩定性，Shannon 指數表示微生物群落多樣性，Ace 指數表示微生物群落豐富度，Coverage 指數表示微生物群落覆蓋度。如表3 所示，CM1 組的Shannon 指數和Ace 指數均顯著低于其他三組（P＜0.05），CM1 組Shannon 指數顯著低于CK 組、CM2 組、CM3 組7.95%、9.54%、4.61%，CM1 組Ace 指數顯著低于CK 組、CM2 組、CM3 組9.70%、33.68%、22.70%，說明該地塊微生物多樣性和豐富度最差。結合土壤理化性質和酶活性來看，CM1 酶活性較低，土壤質量較差，說明污染物濃度高的地塊會抑制土壤酶活性，從而抑制微生物的生長代謝[23]。Coverage 指數均在95%以上，表明樣本測序深度合理，滿足后續數據分析需求。

表3 不同地塊土壤微生物多樣性指數Table 3 Soil microbial diversity index of different plots

（2）土壤微生物群落PCoA 分析

選用主成分分析法來估算各樣本點序列間的距離，以此來分析污染修復點位和對照點微生物群落結構的差異。如圖2 所示，兩個主坐標的解釋度分別為50.87%和26.99%，橫軸解釋度較高。CK 組和CM1 組分布在PC1軸的正負兩側，且與CM2 組，CM3 組未交集，說明CK 組、CM1 組與CM2 組、CM3 組群落結構差異較大，CM2 組和CM3 組樣本點有重合，說明微生物群落結構較為相似。整體來看，對照組與污染修復區點位差異明顯，可能是由于土壤污染物濃度不同對微生物群落結構有所影響。土壤污染會一定程度上改變土壤結構與性質，會影響土壤中營養物質的分布[24]，修復后的土壤微生物生活環境發生變化，但減量化對土壤的修復程度是有限的。

圖2 不同點位土壤微生物群落PCoA 圖Fig.2 PCoA map of soil microbial community at different sites

（3）土壤微生物群落結構組成分析

將OTU 進行物種分類學注釋后，共檢測到50 個門，不同點位土壤微生物的門水平相對豐度如圖3 所示，豐度最高的菌門為綠彎菌門（Chloroflexi）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）和厚壁菌門（Firmicutes）等，分別土壤細菌的16.62%～28.21%、15.50%～21.94%、10.10%～19.66%、6.51%～19.33%和4.12%～8.41%。藍細菌門（Cyanobacteria）在CM1 中占比高達15.81%，但在對照組僅占0.40%，說明污染修復后可能有利于個別菌群相對豐度增加。污染修復地塊綠彎菌門（Chloroflexi）高于對照地塊，隨著污染程度加深，酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對豐度逐漸降低，與有關研究結果[25]一致。

圖3 不同點位土壤中微生物的相對豐度（門水平）Fig.3 Relative abundance of microorganisms at phylum level in different soil samples

共檢測到1057 個屬，不同點位土壤微生物的屬水平相對豐度如圖4 所示，CM1 優勢菌屬為norank_f_A4b、Microcoleus_Es-Yyy1400、Bacillus、unclassified_o__Cyanobacteriales等，分別占細菌總數的7.17%、4.52%、3.40%、2.78%；CM2 優 勢 菌 屬 為norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96、norank_f_A4b、Gaiella、norank_f__norank_o__Chloroplast等，分別占細菌總數的4.82%、3.35%、3.05%、2.90%；CM3 優 勢 菌 屬 為norank_f__norank_o__SBR1031、Bacillus、Enterobacter、norank_f__norank_o__Chloroplast等，分別占細菌總數的4.02%、3.43%、3.42%、2.68%；CM4 優勢菌屬為norank_f__Vicinamibacteraceae、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales、norank_f__norank_o__norank_c__KD4-96、norank_f__Gemmatimonadaceae等，分別占細菌總數的6.65%、4.89%、3.42%、2.75%。

圖4 不同點位土壤中微生物的相對豐度（屬水平）Fig.4 Relative abundance of microorganisms at genes level in different soil samples

（4）環境因子對微生物群落結構的影響

本研究采用12 種環境因子來分析環境因子對微生物群落結構的影響如圖5 所示，主要影響微生物群落結構的環境因子為水溶性鹽總量、Fe、AK、AP、SC等。水溶性鹽總量對藍細菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和變形菌門（Proteobacteria）有正相關作用，與放線菌門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）有負相關作用；SOM、NP 與變形菌門（Proteobacteria）、放 線 菌 門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）有正相關作用，與綠彎菌門（Chloroflexi）和藍細菌門（Cyanobacteria）有負相關作用；AK、Fe、Mn 與變形菌門（Proteobacteria）、和藍細菌門（Cyanobacteria）有正相關作用，與綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）有負相關作用。

圖5 環境因子與微生物門水平相關性RDA 圖Fig.5 RDA diagram of correlation between environmental factors and microorganisms in phylum level

細菌作為土壤中最為豐富的微生物，對保持土壤生態健康至關重要。馮慧琳等[15]研究表明，土壤酶的產生主要來源于植物根系和土壤微生物，且土壤酶的主要來源之一是土壤微生物中的細菌，可以看出土壤酶與微生物存在密切關聯。本研究發現，放線菌門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對豐度與土壤酶存在正相關關系，藍細菌門（Cyanobacteria）與土壤酶存在負相關關系，說明不同門類細菌的作用方式有差異性。且污染修復土壤與對照組土壤污染物濃度不同，理化性質也會有所不同，進而影響土壤微生物群落結構[26]。

土壤環境因子與微生物群落相關性分析如圖6 所示，Heatmap 圖顯示了環境因子對研究區域土壤微生物的影響程度。酸桿菌門（Acidobacteriota）、Latescibacterota、Myxococcota、NB1-j 與AP、UE、SC 和NP 呈顯著正相關（P＜0.05），浮霉菌門（Planctomycetota）、酸桿菌 門（Acidobacteriota）和Latescibacterota 與 水 溶 性 鹽總量、Fe 和Mn 呈顯著負相關（P＜0.05），藍細菌門（Cyanobacteria）與TN、AP、UE、SC 和NP 呈顯著負相關（P＜0.05），與水溶性鹽總量呈顯著正相關（P＜0.05），擬桿菌門（Bacteroidota）與Fe 和AK 呈顯著正相關（P＜0.05），放線菌門（Actinobacteriota）與AK 呈顯著負相關（P＜0.05）。相關研究表明重金屬與細菌多樣性具有一定的相關性[27]，與本研究研究結果一致。

圖6 環境因子與微生物門水平相關性Heatmap 圖Fig.6 Heatmap diagram of correlation between environmental factors and microorganism in phylum level

AP、UE、SC、NP、水溶性鹽總量和Fe 與土壤微生物群落存在較強的相關性，表明環境因子的改變影響某些微生物的生長，進而影響微生物多樣性和群落結構，而微生物群落結構的改變也會反過來作用于土壤環境因子，二者具有一定的關聯性。

3 結論

本研究選取崇明某減量化修復地塊采集土壤樣品，采用Illumina Miseq 高通量測序技術，分析土壤理化性質與酶活性對污染修復地塊微生物群落組成的影響，主要結論如下：

（1）CK 組SOM、TN 和AP 含量顯著高于污染區（CM1組、CM2 組、CM3 組）（P＜0.05），CM1 組重金屬含量較高，說明未被污染地塊土壤肥力保持能力較高。CK組UE、SC、NP 均顯著高于CM1 組、CM2 組、CM3 組（P＜0.05），說明未被污染地塊酶活較強，土壤酶活性受環境因子影響較大。

（2）CM1 組的Shannon 指數和Ace 指數均顯著低于其他三組（P＜0.05），說明該地塊微生物多樣性和豐富度最差，污染物濃度高的地塊會抑制土壤酶活性，從而抑制微生物的生長代謝。

（3）豐度最高的菌門為綠彎菌門（Chloroflexi），占比為16.62%～28.21%，CK 組與CM1 組土壤微生物群落結構差異較大，說明環境因子會影響微生物群落結構，且放線菌門（Actinobacteriota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）的相對豐度與土壤酶活存在正相關關系，藍細菌門（Cyanobacteria）與土壤酶存在負相關關系，說明不同門類細菌的作用方式也具有差異性，土壤理化性質與微生物群落結構具有一定的關聯性。主要影響微生物群落結構的環境因子為水溶性鹽總量、Fe、AK、AP、SC 等。減量化修復對改善土壤理化性質、酶活性及物生物群落有一定的影響，在提升土壤生態環境質量有重要意義，但對于后續復墾及農業種植需要設計更加完備的實驗進行研究。