甘露寡糖干預采食高脂飼糧羅曼蛋雞的脂肪肝綜合征

趙偉杰，馮曉華，梁競文，莫穎芬，朱燦俊，束 剛，高 萍，王松波，王麗娜，江青艷

(華南農業大學 動物科學學院/廣東省動物營養調控重點實驗室,廣東 廣州 510642)

脂肪肝綜合征是一種代謝性疾病，受到營養、遺傳和環境等多方面因素的影響。在集約化飼養條件下，蛋雞脂肪肝呈高發趨勢，尤其是產蛋高峰期時，脂肪肝綜合征會導致蛋雞死亡、產蛋率下降，給養殖業造成巨大經濟損失[1]。已有研究表明，蛋雞日糧中能量較高而蛋白含量較低是誘發雞脂肪肝綜合征的主要因素之一。由于雞的淋巴系統不夠完善，腸道中的脂肪酸直接通過肝門靜脈進入肝臟，并且雞的肝臟中脂肪合成的速度遠勝于哺乳動物[2]。此外，日糧中蛋白含量較低導致雞載脂蛋白合成不足，過剩的脂質無法運出肝臟，進一步加劇脂肪在肝臟中堆積[3]。

甘露寡糖(Mannan oligosaccharides，MOS)是由幾個甘露糖分子或甘露糖與葡萄糖通過α-1，2、α-1，3 和α-1，6 糖苷鍵組成的寡聚糖，聚合度在2～10 之間，是一類不易消化的低分子碳水化合物。甘露寡糖不能被胰淀粉酶水解，但可以被腸道菌群產生的酶降解。因此，甘露寡糖沒有直接的營養價值，但已被證明能夠對人類和動物的健康產生積極影響[4]。目前，甘露寡糖廣泛用于畜禽養殖。一方面，甘露寡糖可以通過緩解熱應激條件下肉雞的氧化應激來提高其生產性能[5-6]。另一方面，甘露寡糖可以通過改善斷奶仔豬的腸道形態以提高消化吸收功能，并且甘露寡糖可以促進抗原呈遞來增強仔豬的抗病性[7-8]。但關于甘露寡糖是否能夠緩解動物脂肪肝的研究較少，機制尚不明確。

本研究以羅曼粉蛋雞為試驗對象，飼喂高脂日糧以構建蛋雞脂肪肝模型，在日糧中添加不同質量分數的甘露寡糖，通過對蛋雞血清、肝臟和腸道菌群相關指標的檢測，探討甘露寡糖對蛋雞脂肪肝的影響，并確定最適添加劑量。本研究可望為預防或緩解蛋雞脂肪肝提供有效的營養干預策略。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

試驗設置4 組，普通日糧組(CK 組)飼喂普通日糧，高脂低蛋白日糧組(簡稱高脂日糧組，即HFD 組)飼喂高脂日糧，0.1% MOS 組在高脂低蛋白日糧中添加0.1%(w)甘露寡糖，0.5% MOS 組在高脂低蛋白日糧中添加0.5%(w)甘露寡糖。試驗日糧組成見表1。選取80 只230 日齡的羅曼粉蛋雞，將80 只蛋雞稱質量，體質量從低到高排序，按照CK 組、HFD 組、0.1% MOS 組、0.5% MOS 組、0.5% MOS 組、0.1% MOS 組、HFD 組、CK 組的順序依次分入各組，直至每組20 只。每只雞單籠飼養。試驗持續9 周，每周稱取并記錄采食量和體質量，試驗結束時，每組隨機選取8 只蛋雞翅靜脈采血，室溫放置30 min，待血液凝固后3 000 r/min 離心15 min 制備血清，分裝備用。屠宰后采集蛋雞肝臟、腹脂和盲腸內容物，并于-80 ℃保存。

1.2 主要試驗材料

羅曼粉蛋雞由廣東壹號食品股份有限公司惠贈。甘露寡糖購自陜西森弗天然制品有限公司，其中甘露二糖-甘露十糖質量分數為95.2%，甘露二糖-甘露六糖質量分數為61.3%。甘油三酯(A110-1-1)、谷丙轉氨酶(C009-2-1)和谷草轉氨酶(C010-2-1) 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。RNA 提取試劑盒(R4011-02)購自廣州美基生物科技有限公司。RNA 反轉錄試劑盒(A0010CGQ)購自美國EZBioscience 公司。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 血清和肝臟甘油三酯檢測 蛋雞血清和肝臟甘油三酯的檢測參照試劑盒說明書進行。

1.3.2 血清谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的檢測 蛋雞血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的測定參照試劑盒說明書進行。

1.3.3 肝臟切片及染色 取1 cm×1 cm×1 cm 大小的肝臟樣品保存于40 g/L 多聚甲醛溶液中，委托武漢賽維爾生物科技有限公司進行切片，并進行蘇木精-伊紅(HE)和油紅O 染色。

1.3.4 肝臟RNA 的提取和qPCR 檢測 總RNA 提取參照試劑盒說明書進行。然后，按照試劑盒說明書將RNA 反轉錄為cDNA。將cDNA 稀釋5 倍，將0.5 μL 引物、3 μL 稀釋后的cDNA、6.5 μL 無核酸酶水和10 μL SYBR 依次加入定量板中。于熒光定量PCR 儀中進行檢測，最后以β-actin作為內參基因，根據2-ΔCt計算各目的基因mRNA 相對表達水平。引物序列參照文獻[9]。

1.3.5 腸道微生物的測序及分析 使用無菌管收集蛋雞盲腸內容物100 μg 左右，并于-80 ℃保存，隨后送至上海麥特繪譜生物科技有限公司進行16sRNA 測序分析。

1.4 數據處理與統計分析

數據結果均以平均值±標準誤表示，并采用單因素方差分析及Sidak 多重比較進行顯著性分析。數據分析及作圖用GraphPad Prism 8 軟件完成。腸道菌群首先使用韋恩圖分析，在門水平上，統計每個區域相應擴增子序列變異/可操作分類單元(ASV/OTU)的豐度，并使用柱狀圖進行展示。其次使用LEfSe 分析，根據其線性判別分析值制作顯著差異物種分布柱狀圖，用以展示每個組內顯著富集的物種及其重要程度。

2 結果與分析

2.1 日糧添加甘露寡糖對羅曼蛋雞肝臟和腹脂質量的影響

HFD 組的蛋雞體質量、肝臟質量、肝臟指數、腹脂質量和腹脂指數均顯著高于CK 組，分別升高了5.84%、13.01%、15.88%、65.49% 和56.93%(P＜0.05)；與HFD 組相比，0.1% MOS 組蛋雞體質量、肝臟質量、肝臟指數、腹脂質量和腹脂指數分別降低了4.29%、5.76%、7.26%、25.36%和20.00%，差異顯著(P＜0.05)；而0.5% MOS 組蛋雞體質量、肝臟質量、肝臟指數、腹脂質量和腹脂指數分別降低了9.82%、8.33%、2.80%、33.41%和24.18%，減質量效果更顯著(P＜0.05)。綜上所述，高脂日糧能夠顯著提升蛋雞的體質量、肝臟和腹脂的質量，在日糧中加入適量甘露寡糖能夠有效降低蛋雞體質量、肝臟和腹脂的質量，并且添加0.5%(w)甘露寡糖的效果優于0.1%(w)甘露寡糖(表2)。

表2 日糧添加甘露寡糖對蛋雞肝臟和腹脂質量的影響1)Table 2 Effects of dietary supplementation of mannose oligosaccharide on liver weight and abdominal fat weight of hens

2.2 日糧添加甘露寡糖對羅曼蛋雞脂肪肝的影響

經檢測發現，HFD 組蛋雞血清和肝臟中的甘油三酯濃度均高于CK 組，而日糧中添加甘露寡糖顯著降低了蛋雞血清和肝臟中的甘油三酯濃度(圖1A、1B)(P＜0.05)。為了進一步研究甘露寡糖對蛋雞脂肪肝的影響，接下來對蛋雞肝臟進行了切片染色，結果(圖2)顯示，HFD 顯著提高了蛋雞肝臟中脂滴的分布，而甘露寡糖可以顯著降低蛋雞肝臟中脂滴的分布，使其回歸正常水平。為了驗證甘露寡糖是否能夠緩解蛋雞的肝臟損傷，我們進一步檢測了蛋雞血清中的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性。結果(圖1C、1D)顯示，HFD 組蛋雞血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性顯著高于CK 組(P＜0.05)，添加甘露寡糖可以顯著降低蛋雞血清中的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性。以上結果說明，甘露寡糖可以有效減少蛋雞肝臟中脂肪的沉積，緩解了高脂日糧引起的蛋雞肝臟損傷。

圖1 日糧添加甘露寡糖對羅曼蛋雞脂肪肝的影響Fig.1 Effects of mannose oligosaccharide supplementation in diet on fatty liver of Roman hens

圖2 切片染色檢測日糧添加甘露寡糖對羅曼蛋雞肝臟中脂滴分布的影響Fig.2 Slice staining detection of the effects of mannose oligosaccharide supplementation in diet on lipid droplet distribution in the liver of Roman hens

2.3 日糧添加甘露寡糖對羅曼蛋雞肝臟脂代謝相關基因mRNA 表達水平的影響

蛋雞肝臟中脂代謝相關基因的mRNA 表達水平的統計結果見圖3。結果(圖3)顯示，HFD 顯著提升了蛋雞肝臟中脂肪合成相關基因如乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase，FAS)和固醇調節元件結合蛋白1c(Sterol-regulatory element binding proteins-1c，SREBP-1c)的mRNA 表達水平(P＜0.05)，而甘露寡糖能夠顯著降低蛋雞肝臟中以上基因的表達水平(圖3A)(P＜0.05)。對于蛋雞肝臟中脂肪分解相關基因如脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipase，LPL)、肉堿棕櫚酰轉移酶-1(Carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1)和脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triacyl glyceride lipase，ATGL)的mRNA 表達水平的檢測結果顯示，各組間均無顯著差異(圖3B)。此外，蛋雞肝臟中脂肪轉運相關基因如載脂蛋白B(Apolipoprotein B，ApoB)和微粒體甘油三酯轉運蛋白(Microsomal triglyceride transfer protein，MTP)的mRNA 表達水平各組間也無顯著差異(圖3C)。以上結果表明，高脂日糧中添加甘露寡糖后能夠顯著抑制蛋雞肝臟中脂肪合成相關基因的mRNA 表達水平。

圖3 日糧添加甘露寡糖對羅曼蛋雞肝臟脂代謝相關基因mRNA 表達水平的影響Fig.3 Effects of mannose oligosaccharide supplementation in diet on mRNA expression levels of liver lipid metabolism genes in Roman hens

2.4 日糧添加甘露寡糖對羅曼蛋雞腸道菌群的影響

由于甘露寡糖不能夠被直接吸收，主要起到調節腸道菌群的作用，我們對H F D 組和0.5%MOS 組的蛋雞盲腸內容物進行了16sRNA 測序分析。結果(圖4)顯示，在門水平上，甘露寡糖顯著提高了擬桿菌門Bacteroidetes 的相對豐度，顯著降低了厚壁菌門Firmicutes 的相對豐度。通過使用LEfSe 分析以找尋2 組間屬水平的生物標志物，0.5%MOS 組LDA 對數值升高最為明顯的菌群為紅蝽菌綱Coriobacteriia 紅蝽菌目Coriobacteriales和紅蝽菌科Coriobacteriaceae。

圖4 日糧添加甘露寡糖對羅曼蛋雞腸道菌群物種組成的影響Fig.4 Effects of mannose oligosaccharide supplementation in diet on gut microbiome species composition of Roman hens

3 討論與結論

3.1 蛋雞脂肪肝模型的特點

根據脂肪肝的發病機理，研究人員一般采用飼喂特殊日糧、基因編輯和藥物處理等方式誘導動物脂肪肝。日糧誘導模型操作簡單，為最常用誘導動物脂肪肝的方式。針對蛋雞的研究中，研究人員一般使用高脂日糧或高能低蛋白日糧誘發其形成脂肪肝[10]。此外，由于蛋雞產蛋期內雌激素大量分泌，刺激肝臟合成脂肪，導致肝臟脂質沉積增多，也可使用注射外源雌激素的方式誘導蛋雞形成脂肪肝[11]。使用高脂日糧和高能低蛋白日糧飼喂蛋雞后，蛋雞血清和肝臟中脂肪沉積增多，肝臟受損，大量的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶進入血液[12-13]。本研究使用高脂日糧飼喂羅曼蛋雞9 周后，蛋雞體質量、肝臟質量和腹脂質量顯著上升，血清和肝臟中脂肪沉積增多，血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性顯著上升，與上述結果一致，說明本研究使用高脂日糧成功構建了蛋雞脂肪肝模型。

3.2 甘露寡糖對蛋雞脂肪肝的影響及作用機制

脂肪肝綜合征作為現階段蛋雞養殖中主要面臨的問題之一，嚴重影響蛋雞產業發展?；疾〉半u主要出現過度肥胖、肝臟脂肪沉積過多以及肝脂肪變性等癥狀，最終導致蛋雞產蛋率下降，嚴重時可導致死亡，給養殖業帶來嚴重經濟損失[14]。由于現今蛋雞養殖多為集約化養殖，并且對于其生長速度和產蛋量的高需求，使用日糧多為高能日糧，而籠養又限制了蛋雞的活動，導致其體內的脂肪過度沉積，使得蛋雞的脂肪肝發病率進一步提高。因此在蛋雞養殖中通過營養干預的手段預防蛋雞脂肪肝發生至關重要。

甘露寡糖作為益生元添加劑在畜禽生產中發揮重要作用，已有研究表明甘露寡糖能夠顯著提升肉雞的生長和免疫性能，保護其腸道屏障[15-16]。此外甘露寡糖還能夠降低黃玉肉雞種雞的血清甘油三酯水平，提高對日糧中粗脂肪的代謝，并能在一定程度上改善種雞的產蛋性能[17]。這與我們的研究結果一致，甘露寡糖顯著降低了脂肪肝蛋雞血清和肝臟中的甘油三酯濃度。肝臟中脂質堆積過多，進一步導致肝臟損傷，肝臟中大量的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶進入血液。而類似的研究也表明，其他功能性添加劑如女貞子提取物、甜菜堿等可以降低脂肪肝蛋雞肝臟中的的脂肪沉積，血清中谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性顯著降低，從而緩解蛋雞的肝臟損傷[18-19]。本研究結果同樣顯示，甘露寡糖降低了脂肪肝蛋雞肝臟中的脂肪沉積，蛋雞血清中的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性顯著降低，蛋雞肝臟損傷得以緩解。

肝臟是家禽和哺乳動物脂肪代謝的主要場所，其代謝過程也較為相似。ACC 和FAS 作為脂肪合成的關鍵限速酶，在脂肪合成中發揮重要作用。SREBP-1c 是核轉錄因子家族成員之一，通過調節如FAS 等脂肪代謝相關酶來調控體內的脂質合成[20]。已有大量研究表明，不論是家禽還是哺乳動物，通過抑制ACC 和FAS 等酶的活性，可以降低肝臟中脂肪合成[21-22]。此外，還有研究表明，ACC 抑制劑抑制肝臟脂肪生成，減少肝臟脂肪變性，并可以作為非酒精性脂肪肝的潛在治療藥物[23]。在海蘭褐蛋雞日糧中添加共軛亞油酸可以抑制蛋雞肝臟中ACC、FAS 和SREBP-1c 的mRNA 表達水平，從而調節肝臟脂質代謝[24]。這與我們的結果類似，甘露寡糖顯著抑制了蛋雞肝臟中ACC、FAS 和SREBP-1c 的mRNA 表達水平，我們推測這可能是甘露寡糖能夠緩解蛋雞脂肪肝的原因。

擬桿菌門和厚壁菌門是腸道內最多的2 類細菌。在人類和小鼠等哺乳動物的研究中，肥胖或代謝紊亂個體的厚壁菌門/擬桿菌門水平遠高于正常個體[25]。此外γ-氨基丁酸、石斛多酚和桑椹多糖可以改善糖尿病小鼠的糖代謝紊亂和肥胖，厚壁菌門/擬桿菌門的水平也隨之降低[26-28]。本研究也得到了類似的結果，甘露寡糖顯著降低了蛋雞腸道中厚壁菌門的相對豐度，并提高了擬桿菌門的相對豐度。此外還有研究表明，高膽固醇血癥的個體中紅蝽菌綱的腸道菌群豐度顯著降低[29]。同樣與本研究的結果類似，甘露寡糖顯著提升了蛋雞腸道中紅蝽菌綱的相對豐度。因此腸道菌群的變化可能也是甘露寡糖緩解蛋雞脂肪肝的原因之一。

3.3 結論

綜上所述，甘露寡糖通過改善蛋雞腸道菌群，抑制肝臟中脂肪合成相關基因的mRNA 表達水平，抑制蛋雞的脂肪沉積，從而緩解蛋雞脂肪肝。