凝膠法與動態濁度法檢測維生素B6注射液細菌內毒素

王超之，高新貞，王 麗，劉 枕，趙 銳*

（1.山東理工大學，山東 淄博 255000；2.淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博 255086）

細菌內毒素是現今醫藥生產工業中最常見的外源性熱原[1]，是革蘭陰性菌細胞壁上的脂多糖結構，細菌增殖、死亡或溶解后內毒素從細胞壁表面釋放，臨床上可能導致嚴重的發炎和感染[2]。

維生素B6是人體內一些輔酶的組成成分，是維持人體健康所必須的營養物質，參與人體代謝過程和免疫調節，具有抗炎、抗癌等作用[3]。維生素B6注射液為無色或淡黃色的澄明液體，可用于預防和治療小兒驚厥[4]；也能減輕妊娠嘔吐或癌癥治療引起的惡心、嘔吐等[5]，還可治療長期或大量服用異煙肼導致的失眠、不安及周圍神經炎[6]。其在酸性溶液中穩定，堿性溶液中易被破壞[7]。其現行標準收載于《中國藥典》2020年版二部，細菌內毒素的限度為每1 mg維生素B6中含內毒素的量應小于0.30 EU[8]。國內文獻多用凝膠限度法進行細菌內毒素檢測[6,9-13]，未發現動態濁度法用于維生素B6注射液內毒素檢測的文獻。本研究根據《中國藥典》2020年版四部通則1143和指導原則9251[14]，選擇9個廠家共41批維生素B6注射液，分別用凝膠法和動態濁度法檢測內毒素，并對比兩種方法的結果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ZH-2型旋渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；TAL-40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；PKF32細菌內毒素檢測儀（美國ACC）。

1.2 試藥

細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-202191，規格：90 EU/支）；動態濁度法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號：2112290，可測內毒素范圍：0.01～10 EU/ml，規格：每支1.25 ml）；鱟試劑（0.25 EU/ml，批號：2208053，湛江博康海洋生物有限公司；0.125 EU/ml，批號：2208023，湛江安度斯生物有限公司；0.125 EU/ml，批號：2204112，湛江博康海洋生物有限公司）；細菌內毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號：2205171，規格：每支50 ml）；維生素B6注射液（華潤雙鶴利民藥業，共7批，批號：21100320，22060205，22050319，22060204，21120307，21120305，21120306；瑞陽制藥，共6批，批號：21060511，22030811，22030712，22030812，21101811，21101711；方明藥業，共10批，批號：21091341，22021243，21091144，22051943，22052043，22051843，21090744，21091543，21091444，20091744；華魯制藥，共3批，批號：XA21I10，XA21I09，XA21I08；新華制藥，共8批，批號：2204154，2204157，2204160，2009144，2201030，2112034，2201006，2112023；晉新雙鶴藥業，共2批，批號：220109221，220108221；太原藥業，共2批，批號：211209，211214；歐意藥業，共1批，批號：073210410；美大康華康藥業，共2批，批號：22011317，22021627）。

2 方法與結果

2.1 凝膠法

2.1.1 干擾預試驗 根據公式MVD=CL/λ（MVD：最大有效稀釋倍數；C：供試品溶液的濃度；L：細菌內毒素的限值；λ：鱟試劑的標示靈敏度），不同靈敏度鱟試劑對應的樣品MVD和最大不干擾濃度見表1。

表1 不同靈敏度鱟試劑MVD和最大不干擾濃度

取4個廠家各1批檢品，用BET水溶解并稀釋成0.883，0.417，0.208 mg/ml 3個濃度，作為供試品溶液（NPC）；另取相同批號檢品，同樣稀釋為上述3個濃度，但稀釋過程中加入內毒素標準品，使其含濃度為2λ（0.5 EU/ml）的細菌內毒素，作為供試品陽性對照溶液（PPC）。用λ為0.25 EU/ml的鱟試劑分別與上述溶液反應，每組做2個平行，同時設置陽性對照組（PC）和陰性對照組（NC），結果見表2。

表2 干擾預試驗結果

由表2可知，當各廠家注射液稀釋120倍及以上時可消除干擾。即應使用λ=0.125 EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑進行凝膠法細菌內毒素檢查。

2.1.2 干擾試驗 取表2的4批樣品，根據中國藥典2020年版四部通則1143進行干擾試驗[4]，鱟試劑靈敏度λ=0.125 EU/ml，稀釋劑為0.417 mg/ml樣品溶液和BET水。結果見表3。結果表明，鱟試劑靈敏度的測定值（λc）在0.5λ和2λ之間，符合藥典要求。

表4 標準曲線可靠性分析

2.1.3 供試品細菌內毒素限度檢查 取9個廠家共41批檢品，用靈敏度為0.125 EU/ml的鱟試劑依法進行檢查，結果樣品均符合規定。

2.2 動態濁度法

2.2.1 標準曲線的建立及可靠性分析 取1支細菌內毒素標準品，用BET水稀釋，制成最終細菌內毒素濃度分別為1.25，0.25，0.05，0.01 EU/ml的標準溶液，精密量取上述標準溶液及BET水各 0.1 ml，分別加入預先加有0.1 ml動態濁度法鱟試劑的試管中，混勻，插入預熱到37 ℃的PKF32細菌內毒素檢測儀內進行自動檢測，其中標準溶液重復3個平行，BET水重復2個平行。檢測波長為660 nm。以平均反應時間的對數（lgT）為縱坐標，內毒素濃度的對數（lgC）為橫坐標，繪制標準曲線。標準曲線回歸方程為lgT=-0.3114lgC+2.794（r=-0.9966，絕對值大于0.980），平行管之間的RSD均小于10 %，陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，細菌內毒素標準曲線成立。

2.2.2 干擾試驗 供試品的最大稀釋倍數MVD=CL/λ=50×0.3/0.01=1500倍。根據標準曲線內毒素濃度范圍的設置，選擇0.25 EU/ml作為靠近標準曲線中點的內毒素濃度（λm）。取3個廠家的各1批樣品，用BET水將供試品分別稀釋100，200，500倍，作為供試品溶液（NPC），同時另行制備含0.25 EU/ml內毒素的上述供試品溶液，作為供試品陽性對照溶液（PPC）；以BET 水作為陰性對照溶液（NC）。上述溶液均做2支平行管，并計算該試驗條件下的回收率，結果見表5。由結果可知，樣品稀釋200倍回收率合格但偏低，稀釋500倍回收率合格且更接近100 %，因此動態濁度法樣品均稀釋500倍進行檢查。

表5 動態濁度法干擾試驗結果

2.2.3 供試品細菌內毒素定量檢查 用λ=0.01～10 EU/ml的鱟試劑進行試驗，標曲范圍為0.01～0.125 EU/ml，樣品稀釋倍數為500倍，結果41批檢品細菌內毒素均小于0.01 EU/ml，符合標準規定。

3 討論

3.1 鱟試劑靈敏度的選擇

對于凝膠法檢查維生素B6注射液細菌內毒素，以往研究者選擇的鱟試劑靈敏度不盡相同，有的用0.06 EU/ml的鱟試劑[6,9,13]，有的用0.25 EU/ml的鱟試劑[10-12]，分析原因一是選擇的供試品廠家不同，本研究也發現有的廠家用0.25 EU/ml的鱟試劑也能通過干擾試驗；二是供試品生產年份不同，可能不同廠家、不同年份的產品存在工藝上的差別，導致干擾因素和干擾水平有差異。鱟試劑靈敏度太低可能無法消除試驗干擾，靈敏度太高則增加了檢驗成本。本研究用0.125 EU/ml的鱟試劑即可通過干擾試驗，也可節約試驗成本。

3.2 稀釋倍數的差別

進行內毒素檢查時，供試品和鱟試劑混合后的溶液pH為6.0～8.0較為合適[14]。根據標準規定，維生素B6注射液pH應為2.5～4.0[8]，對內毒素檢查造成干擾。本試驗采用稀釋的方法來消除pH的干擾作用。干擾試驗表明，凝膠法稀釋到120倍可去除干擾，動態濁度法稀釋200倍回收率合格但偏低，稀釋500倍回收率較好，與最大稀釋倍數1500倍相比，稀釋步驟較少。兩種方法稀釋倍數不同，文獻中也常見這種情況，如丹紅注射液凝膠法稀釋倍數大[15]，痰熱清注射液動態濁度法稀釋倍數大[16]，因此，并不能完全參考凝膠法的稀釋倍數直接進行動態濁度法試驗。原因可能是由于兩種方法的結果判定方式不同，凝膠法需要形成堅實、不變形的凝膠，動態濁度法則是檢測反應混合物的吸光度達到設定值所需的時間[15]。

3.3 兩種方法的比較

兩種方法均可用于維生素B6注射液細菌內毒素檢查。凝膠法操作簡單，成本較低，是內毒素檢查的經典方法和處理爭議的仲裁方法，本試驗中此方法稀釋倍數比動態濁度法少，只能做限度檢查。動態濁度法可獲得更大的稀釋倍數，靈敏度更高，能在一定濃度范圍內定量檢測細菌內毒素含量；建立標準曲線能更好地減輕內毒素標準品對試驗準確性的影響，樣品的受干擾程度可通過量化的回收率數值直觀地表現出來，所用儀器設備能記錄更多試驗信息，數據完整性和可追溯性更好[17-18]。相關人員可根據需求選擇合適的方法。