蛋白質二硫鍵異構酶結構與相關疾病研究進展

葛璟燕,檀 維,洪大偉,張 蓓

(浙江工業大學 生物工程學院,浙江 杭州 310014)

蛋白質是生命活動的物質基礎,其合成過程須經過多肽鏈的正確折疊,形成三維構象,從而具備生理活性。蛋白質的正確折疊對其在生物體內發揮作用至關重要[1]。其中,蛋白質在內質網折疊過程中,兩個半胱氨酸殘基間形成的二硫鍵是獲得蛋白質正確構象的重要步驟之一。在真核細胞中,近三分之一蛋白的結構中,至少含有一個二硫鍵[2]。在這個過程中,蛋白質二硫鍵異構酶(Protein disulfide isomerase,PDI)發揮了不可忽視的作用。PDI作為一種氧化還原酶,負責蛋白折疊過程中二硫鍵的裂解、形成和重排[3-4]。此外,PDI也通過催化天然蛋白二硫鍵的異構化,調節相應的蛋白質折疊,發揮蛋白伴侶的功能并維持細胞穩態[5]。研究表明在多種疾病中PDI表現出過表達或失活狀態。筆者將從PDI家族的結構、種類、活性檢測方法和相關疾病等方面進行綜述,以期為PDI及其病理研究提供新思路。

1 PDI結構

到目前為止,已發現了21個PDI家族成員,由于其他PDI家族成員的結構和機制特征與典型的PDI(PH4B,PDIA1)類似,故以PDI為例簡單闡述其家族的結構[6-8]。PDI結構域如圖1所示,其含有4個Trx結構域(a,b,b′,a′)、一個鏈接子X和C末端延伸區,其中C末端包含內質網駐留信號肽序列KDEL。這4個域使得PDI呈現U型結構,U型轉折裂縫含有疏水表面,使酶能夠特異性地結合展開的底物,識別結合折疊的蛋白[9-10]。a和a′結構域均含一個由CXXC序列(X是任意一天然氨基酸)組成的活性催化位點,獨特的4個半胱氨酸側鏈巰基參與底物二硫鍵的交換反應。a結構域起催化作用,a′結構域起非催化作用,影響著PDI催化的活性[9]。CXXC序列中的兩個半胱氨酸殘基的側鏈既可以是自由巰基,也可以形成一對二硫鍵,與新合成的蛋白質的巰基發生反應,并且氧化還原能力受中間兩個氨基酸的影響。任意一個半胱氨酸活性位點的缺失可導致酶催化能力減弱一半[11],兩個位點同時受到抑制則會導致酶催化功能的喪失[12]。

在內質網中,約50% PDI的a和a′結構域活性中心處于還原狀態,另外15% PDI的a′結構活性中心處于氧化態[13]。N末端的活性半胱氨酸一般裸露在蛋白質表面,pKa值為4.5～5.6;而C末端的半胱氨酸在內部疏水區,pKa值為12.8[14-15],因此PDI蛋白的活性呈現pH依賴性。PDI活性中心的氧化-還原狀態與其發揮的功能息息相關。當PDI的活性中心處于氧化態時,底物的二硫鍵得以形成,PDI則形成還原狀態;相反,當PDI的活性中心處于還原態時,底物會被氧化或異構化。當PDI活性中心氧化還原狀態發生紊亂時,未折疊或錯誤折疊蛋白開始積累,引起內質網應激(ER stress),細胞會通過未折疊蛋白反應UPR(Unfolded protein response)來維持內質網穩態。如果內質網應激過強或持續時間過長,則會導致細胞啟動凋亡程序[16-17]。消除紊亂的蛋白則需要建立一個平衡機制來應對UPR,以防止因病理蛋白導致的疾病的發生。

b和b′結構域主要負責參與底物的識別結合,序列相似度(16.5%)比a和a′結構域(33.6%)小,bb′非催化結構域與aa′催化域相比表現出更多的結構多樣性,且不含CGHC序列,因此沒有氧化還原活性[6]。

Denisov等[18]利用核磁共振滴定實驗發現未折疊核糖核酸酶、胡蜂蜂毒肽及生長抑素與b′結構域的疏水表面結合。相較于b和其他結構域,b′結構域展現出更大的序列多樣性,其主導底物結合的特異性。另外,X鏈接子也起到一定的調節作用。X鏈接子大約由20個氨基酸組成,位于a′與b′結構域之間。通過b′X晶體結構的測定及模擬,發現X鏈接子可穩定底物與b′結構域的N端部分(7個氨基酸)垂直進入b′結合域β5折疊股,而C端部分折回并靠近b′結合域α1和α2螺旋疏水表面。當去除X鏈接子時,b′結合域的穩定性下降[19]。X鏈接子仿佛起到橋梁的作用,使各部分緊密相連,更好地發揮彼此的功能。

2 PDI家族的作用

PDI家族成員有21個,具體如表1所示。PDI家族成員的共性很多,其主要功能是催化新生肽鏈的氧化折疊,發揮蛋白氧化還原、異構和分子伴侶等的作用,然而PDI家族成員的生物功能不盡相同,尤其酶活性、催化底物都有很大的差別。目前針對PDI家族的體外研究較多,由于體內環境復雜,參與的底物豐富,并且與底物形成的復合物壽命較短,使得針對PDI家族的體內研究較少,其功能仍有待開發。PDI家族成員之間的功能有一定重疊,當缺少某一種時,其他的成員相應回補挽救,因此對單一成員的研究有一定難度。下面將簡單介紹以下3種了解較透徹的PDI成員。

表1 人類PDI家族蛋白概覽

2.1 PDI(PDIA1,PH4B)

PDI在內質網腔中的含量最高,含有KDEL序列,主要在內質網中駐留,可達到毫摩爾每升的水平,其通過催化蛋白底物的氧化折疊改變底物狀態而發揮不同生理作用[10]。研究發現:當PDI活性位點被抑制,細胞PDI基因被敲除后,會影響細胞的生長和分化[20],而非活性位點的突變也會影響其活性[21]。同時PDI家族的其他成員不能完全代替并挽救PDI的生物功能。PDI的底物具有多樣性:CHO細胞被病毒感染,兩種病毒膜糖蛋白可與PDI形成瞬時的合二硫代物[22];在成纖維細胞中,PDI與其底物前膠原I和前膠原Ⅲ之間存在密切聯系[23];在分泌二聚體蛋白甲狀腺球蛋白的甲狀腺細胞中,甲狀腺球蛋白的瞬時折疊中間體可與PDI形成二硫鍵[24]。PDI催化蛋白折疊過程中二硫鍵的氧化還原,其構象處于一個動態的過程,從而維護內質網穩態[25]。

2.2 ERp57(PDIA3)

ERp57是PDI家族中功能被研究得比較透徹的一個氧化還原性質的分子伴侶。ERp57可以清除錯誤折疊的蛋白質,抵抗內質網脅迫誘導的細胞凋亡[26]。ERp57底物結合的特異性與PDI相似。ERp57可以與凝集素伴侶分子鈣聯蛋白CNX和鈣網蛋白CRT結合。用藥物干擾CNX和CRT的結合位點可有效阻止ERp57和糖蛋白的相互作用[27-28],因此糖蛋白二硫鍵的形成可能與ERp57催化功能相關。細胞表面CNX-ERp57復合物還原胞外二硫鍵是細胞外基質降解的必要條件[29]。ERp57也可作為補體來調控凝集素途徑[30]。

Blees等[31]通過低溫電子顯微鏡發現ERp57是主要組織相容性類MHC-1肽組裝復合體的一部分,通過a和a′區域的U型結構與伴侶分子Tapasin結合形成二硫鍵,參與對腫瘤和病毒的免疫反應。MHC-I通路中兩個重要因子ERp57和Tapasin的相互作用對抗原提呈腫瘤細胞產生顯著影響[32]。血凝素作為一種表面免疫原蛋白,是流感病毒的重要組成部分。ERp57可以還原血凝素,降低二硫鍵綁定的血凝素三聚體的百分比,從而提高H3N2流感病毒血凝素的穩定性和免疫原性[33]。對ERp57的研究有助于開發預防流感大流行的疫苗。

2.3 ERp44(PDIA10)

ERp44由a-b-b′ 3個域構成V型結構,N端含有CRFS序列,然而缺乏C端的活性區域[34]。ERp44主要定位于內質網-高爾基體中間室和順式高爾基體區域,其C末端會因亞細胞pH的差異導致ERp44結構的改變,從而影響ERp44與底物的結合[35-37]。ERp44的底物較廣泛,包括內質網氧化還原酶Ero1α和Ero1β(高度保守的黃素酶,與FAD一起產生二硫鍵并優先將其轉移到蛋白質二硫鍵異構酶上)、Ⅰ型1,4,5-三磷酸肌醇受體ITPR1等。ERp44在內質網應激中被誘導,通過C29位點特異性與內質網氧化還原酶Erolα結合,并形成二硫鍵交聯中間體,通過該介導作用,使得Ero1α活性降低且滯留在內質網中[38]。ERp44與三磷酸肌醇受體間的相互作用對細胞內鈣穩態調節起到重要作用[39]。

ERp44也參與病理的發生和發展,可作為結直腸癌患者復發情況的指示蛋白[40]。敲低ERp44的表達水平,細胞凋亡相關蛋白如caspase-3,GRP78水平升高,caspase-12被激活,表明內質網應激誘導細胞凋亡,進一步表明ERp44沉默通過激活內質網應激導致細胞凋亡[41]。

3 PDI活性的檢測方法

PDI是一種氧化酶、還原酶及異構酶,在過去的幾十年里,測定PDI酶活性以及篩選抑制劑的方法相對成熟。下面將簡單討論PDI酶的3種活性測定方法,以便用于高通量篩選PDI抑制劑,同時也將簡單闡述這些方法的優缺點。

3.1 還原活性測定

3.1.1 胰島素濁度測定方法

胰島素由A,B兩條肽鏈通過二硫鍵交聯組成[42]。PDI作為一種還原酶可以破壞A,B鏈之間的兩個二硫鍵,致使B鏈聚集,而A鏈仍可溶。因此一般在供體谷胱甘肽或二硫蘇糖醇存在下,最終以過氧化氫淬滅反應,通過OD650可檢測B鏈的濁度,從而間接得知PDI還原酶的活性[43]。該檢測方法雖然簡單、經濟且高效,可以用于高通量抑制劑篩選,但濁度的靈敏度較低,谷胱甘肽和二硫蘇糖醇也存在一定的還原能力,檢測過程中容易出現假陰性的情況。

3.1.2 熒光檢測方法

熒光檢測方法利用兩個相同發色基團(氨基苯、伊紅)連接在氧化型谷胱甘肽的兩邊,PDI的加入使得中間二硫鍵斷開,熒光基團的淬滅效應降低,熒光增強[44]。根據熒光的強度計算PDI的活性。該方法簡單且靈敏度比胰島素濁度法高,適用于血小板等復雜樣本中PDI活性的測定。

3.2 氧化活性測定

PDI最初是因其具有催化還原RNase復性的能力而被分離出來的。RNase通過催化磷酸二酯鍵的水解來消化RNA,不活躍的還原性RNase被PDI氧化而復性。具有活性的RNase隨后催化循環單磷酸胞苷(cCMP)水解生成CMP,導致296 nm處的吸光度增加。因此cCMP的水解速率間接反映了PDI的氧化酶活性。然而該方法的影響因素較多,如反應的pH、鹽濃度、cCMP和復性的程度等。同時,很多抑制劑也會在測量波長下有吸收,導致該方法的局限性較大[45]。

3.3 異構酶活性測定

PDI可以催化被完全氧化并形成雜亂的二硫鍵失活狀態的RNase中分子間和分子內二硫鍵的交換異構,從而導致新的二硫鍵的形成,使RNase酶活性恢復。利用RNA作為底物,RNase活性的測定間接反映了PDI的異構酶活性。然而該方法依賴含無序二硫鍵的RNase的制備,批次之間的重復率不高[46]。

4 PDI相關疾病

目前針對PDI及其家族的研究雖然越來越多,了解得也越來越透徹,但其低表達或過表達都可能會導致疾病的發生,下面重點簡述與PDI相關的幾種疾病。

4.1 PDI與癌癥

近期,通過芯片技術和蛋白質組學發現在腦癌[47]、淋巴癌[48]、肺癌[49]和卵巢癌[50]等不同的癌癥組織中PDI至少上調兩倍。PDI也在乳腺癌的細胞間隙液中高表達,可作為乳腺癌前期檢測的生物標志物。高表達的PDI也與癌癥的轉移和侵襲相關,針對ER折疊因子,特別是PDI家族成員,可能改善轉移性乳腺癌的治療效果[51]。目前,針對PDI抑制劑的開發也逐漸增多。比如Neamati課題組通過將PACMA31與熒光物質BODIPY結合,發現PACMA31是PDI的共價結合抑制劑,抑制PDI的Cys397或Cys400活性位點,同時在不同的卵巢癌細胞系中表現出較好的抑制效果[50]。

4.2 PDI與神經退行性疾病

神經退行性疾病,比如阿爾茨海默病、帕金森、亨廷頓病和肌萎縮側索硬化癥等,表現為認識和記憶力下降,主要因蛋白質的錯誤折疊引起[52]。而PDI家族的主要功能就是輔助蛋白質折疊,因此也受到了關注。阿爾茨海默病(AD)的特點之一是產生過多的一氧化氮,使得PDI的活性半胱氨酸S-亞硝基化(SNO-PDI),從而抑制其活性,導致多聚泛素的堆積,并激活未折疊蛋白應答[53-55]。最近研究表明:SNO-PDI不僅喪失了識別靶蛋白的能力,而且也喪失了抑制AD患者腦內異常沉積的Tau蛋白相分離(相分離描述的是一種細胞內不同組分相互碰撞形成液滴的現象)的能力。無論是野生型PDI還是活性位點中半胱氨酸突變后的PDI均能顯著抑制細胞中Tau蛋白的病理磷酸化和異常聚集,降低Tau蛋白導致的毒性,這對SNO-PDI和Tau蛋白在神經疾病中的作用機制有了更進一步的闡釋,并為治療疾病提供了思路[5]。

Stockwell課題組在68 000多個小分子庫中發現該16F16小分子可特異性抑制PDI和ERp57的活性,從而減弱其調控的聚谷酰胺誘導亨廷頓病細胞模型凋亡的作用[56]。后來又篩選出了具有神經保護作用的一葉秋堿Securinine生物堿,確定了其在亨廷頓病細胞模型中具有保護作用[57]。該研究為尋找新的PDI抑制劑提供了方法和思路。

4.3 PDI與艾滋病

PDI不僅在內質網中起作用,也在細胞表面催化二硫鍵的形成。該功能有助于一些病毒和細菌的侵入,比如HIV病毒[58]、新城疫病毒[59]等。PDI通過催化糖蛋白gp120中二硫鍵的還原切割實現HIV-1與細胞的融合[60-61]。在HIV-1主要受體CD4附近有10～14個PDI簇,它們與PDI和HIV-1包膜糖蛋白gp120有單獨的結合位點。HIV-1的gp120與CD4結合,隨后PDI催化還原gp120中的二硫鍵,導致gp120的主要構象發生變化,增強gp120與共同受體CCR5和CXCR4的作用。隨后,一種非共價結合gp120的病毒糖蛋白gp41重新排列并與細胞膜作用,導致病毒包膜與細胞膜融合,使得病毒侵入細胞[62]。因此,PDI也被認為是一種治療HIV的潛在藥物靶點。

Osada課題組利用高通量的胰島素聚集濁度分析方法,從10 000種天然產物中篩選到可抑制PDI催化gp120還原的juniferdin先導化合物,從而阻止病毒粒子的進入[58]。據報道,有一種宿主細胞蛋白SERINC5可通過改變病毒粒子上的gp120構象或物理掩蔽特定的HIV-1病毒粒子表位來抑制HIV-1的感染性[63]。SERINC5抑制HIV-1感染的確切機制雖然尚不清楚,但可針對病毒粒子設計新的抗病毒策略。

4.4 PDI與血栓

血栓形成過程中PDI扮演著重要的角色[64]。自20世紀90年代發現PDI在血小板功能中起作用以來,科學家致力于探究血小板PDI參與動脈血栓形成的分子機制[65]。抑制細胞外PDI活性可以減少激光引起的血栓形成過程中血小板的聚集和纖維蛋白的沉積[66]。胞外PDI可能是預防和治療血管疾病的一個新的治療靶點。單寧酸作為一種PDI結合植物多酚能夠在體外抑制PDI還原酶活性,減少血小板表面硫醇的生成,抑制PDI活性、血小板活化和血栓形成[67]。通過下腔靜脈部分狹窄小鼠模型可知,PDI抑制劑PACMA31可抑制血小板沉積和纖維蛋白形成,并且抑制方式取決于骨髓細胞的組織因子。不過最近證明PDI家族的跨膜成員TMX1可以抑制血小板功能和血栓形成,這表明PDI在血栓形成中也可能具有相反的功能[68]。

5 結論與展望

綜上所述,PDI的結構功能與疾病之間存在著密切的關系。目前,PDI抑制劑的開發雖然取得了一定的進展,但抑制劑只能抑制PDI的單個活性位點,且PDI在不同亞細胞器中還有一些未知的功能,其在疾病發生和發展中的作用機制也尚未明確。未來本課題組將通過PROTAC技術來實現PDI的完全降解,并嘗試對其致病下游蛋白的表達情況進行闡述。相信隨著研究技術的不斷創新,PDI在疾病過程中的作用機制將被逐一解釋,相關疾病的預防和治療也將成為可能。