下調XBP1s通過Sirt3/SOD2/mtROS軸減輕缺氧/復氧誘導的腎小管上皮細胞衰老

彭宣 倪海強 顧世琦 宮念樵

腎移植術后可發生急性腎損傷和移植腎功能延遲恢復，而缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是其發生的重要因素[1-3]。近年研究表明，IRI 過程中由于線粒體失功產生的大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）能誘導細胞衰老[4]。衰老的腎小管上皮細胞一方面由于細胞周期阻滯而停止增殖，另一方面由于衰老相關分泌表型促進炎癥和纖維化，加速急性腎損傷向慢性腎病進展[5-6]。因此，探索細胞衰老發生的分子機制及尋求干預策略，具有重要意義。

IRI 過程中會發生嚴重的內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），ERS 主要由肌醇需求激酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、轉錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）、蛋白激酶R 樣內質網激酶（p r o t e i n k i n a s e R-l i k e endoplasmic reticulum kinase，PERK）介導[7-8]。其中，非剪接型X-盒結合蛋白1（unspliced X-box binding protein 1，XBP1u）被激活的IRE1 剪接一個內含子重編碼生成剪接型X-盒結合蛋白1（spliced X-box binding protein 1，XBP1s），而XBP1s 作為轉錄因子能通過調控一系列下游ERS 相關蛋白調節內質網穩態[9-10]。筆者團隊前期研究表明下調XBP1s 能減少IRI 過程中ROS 產生[11]，但下調XBP1s 能否減輕ROS 誘導的細胞衰老及其可能機制尚不清楚。研究報道，沉默信息調節因子3（sirtuin 3，Sirt3）作為最重要的線粒體去乙?；?，通過使超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）2 去乙?；?，增強SOD2 活性，從而抑制線粒體ROS（mitochondrial ROS，mtROS）產生[12-13]，Sirt3/SOD2/mtROS 信號軸在IRI 過程中調控氧化應激及細胞衰老至關重要[14-15]。本研究通過建立體外缺氧-復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，探討XBP1s 調控Sirt3/SOD2/mtROS 信號軸對H/R 誘導的細胞衰老影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 實驗材料 用于提取原代腎小管上皮細胞的健康無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級C57BL/6 雄性小鼠（6～8 周齡）購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。小鼠飼養在華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院SPF 級動物中心，飼養環境為22 ℃，55%濕度和12 h 晝夜循環。所有動物實驗均經同濟醫院實驗動物福利與倫理委員會批準（批號：TJH-202 207 003），并遵守中華人民共和國科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

1.1.2 試 劑 EpiCM-a 培養基購自美國ScienCell 公司，胎牛血清購自上海翌圣生物科技股份有限公司；總RNA 提取試劑購自上海飛捷生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒購自日本Takara 公司，腺病毒由上海和元生物技術股份有限公司合成，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成；Sirt3、p53、p21、γ H 2 A X、S O D 2、β-a c t i n、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔二抗、染色質免疫沉淀試劑盒購于武漢愛博泰克生物科技有限公司，XBP1s 抗體購自美國CST 生物公司、Ac-SOD2 抗體購于英國Abcam 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ROS 檢測試劑盒、SOD 活性檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；線粒體超氧化物指示劑mitoSOX 購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代腎小管上皮細胞提取和培養 選用6～8 周C57BL/6 雄性小鼠，在無菌條件下取出腎臟，剝離腎包膜后，剪碎腎皮質組織，再使用組織分離器打碎腎臟，加入膠原酶/復合酶和DNA 酶消化獲得單細胞懸液。用70 μm 濾器過濾，濾液經離心、洗滌、裂紅后，用EpiCM-a 完全培養基重懸細胞，轉至細胞培養瓶內，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養，48 h 后，可見部分細胞貼壁并換液，后續每隔2～3 d 更換培養基，并根據細胞生長情況進行傳代。

1.2.2 細胞分組與轉染 將細胞隨機分為空白對照組（NC 組）、H/R 組、轉染空載腺病毒的陰性對照組（Ad-shNC 組）、轉染靶向沉默XBP1s 的腺病毒組（Ad-shXBP1s 組）、轉染空載腺病毒+H/R 處理組（Ad-shNC+H/R 組）、轉染靶向沉默XBP1s 的腺病毒+H/R 處理組（Ad-shXBP1s+H/R 組）。以感染復數50 為參考進行原代細胞轉染，48 h 后即可檢測轉染效率和干擾效果，XBP1s 干擾序列為5'-CAGCGCAG ACTGCTCGAGATAGAAA-3'。

1.2.3 建立H/R 模型 參考前期研究者經驗建立H/R 模型[16]，將培養基更換為預先缺氧的無血清培養基，然后將細胞置于含有5% CO2、1% O2、94% N2的37 ℃三氣培養箱中培養24 h 進行缺氧，缺氧結束后更換為正常完全培養基，并移至常氧培養箱繼續培養2 h 進行復氧。整個過程常氧組予以正常完全培養基培養，并于常氧培養箱中培養。

1.2.4 β-半乳糖苷酶染色 棄除12 孔板中的細胞培養液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌1 次，然后每孔加入500 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫下固定15 min。再棄除固定液，用PBS 洗滌3 次，每次3 min。最后每孔加入500 μL 含有X-Gal 的染色工作液，于37 ℃孵育過夜，次日于普通光學顯微鏡下觀察。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測蛋白表達 使用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，然后進行蛋白定量。經SDSPAGE 凝膠電泳后轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinyidene fluoride，PVDF）膜，室溫用5%脫脂奶粉封閉1 h。洗膜后加入相應一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜后進行顯影。

1.2.6 ROS 水平測定 用DCFH-DA 熒光探針檢測細胞內的ROS 水平。用無血清培養基按1∶1 000 將DCFH-DA 稀釋成終濃度為10 μmol/L 的工作液。培養細胞結束后，棄除培養基，用PBS 洗3 遍，加入適當體積工作液充分覆蓋細胞。于細胞培養箱內避光孵育20 min 后，用無血清細胞培養基洗滌3 次。在熒光顯微鏡下隨機選取不同視野拍照觀察。

1.2.7 MDA 和SOD 檢測 細胞培養結束后，用SOD 活性檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒按照說明書分別檢測SOD 活性及MDA 含量。

1.2.8 染色質免疫共沉淀檢測XBP1s 與Sirt3 結合將細胞與1%甲醛交聯，然后裂解，用蛋白A/G 磁性瓊脂糖將提取液預清除，4 ℃下過夜。接著用抗XBP1s 或抗IgG 抗體進行免疫沉淀后，按說明書洗滌蛋白質復合物。洗滌之后解除蛋白質/DNA 復合物之間的交聯，然后純化DNA 進行染色質免疫共沉淀-測序（chromatin immunoprecipitation followed by sequencing，ChIP-seq）與定量聚合酶鏈反應（chromatin immunoprecipitation followed by quantitative polymerase chain reaction， ChIP-qPCR）分析。根據Sirt3 基因啟動子上預測的XBP1s 結合的motif 所設計引物1-5 的序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.9 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測mRNA 表達采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（r e a l-t i m e fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）檢測細胞中XBP1s、Sirt3 表達水平。提取細胞總RNA，測定濃度后配成反應體系，用逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，再進行擴增。以β-actin 作為內參基因，用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。引物序列見表1。

1.2.10 流式細胞術檢測mtROS 將線粒體超氧化物指示劑MitoSOX 溶于二甲基亞砜中，制成5 mmol/L的儲存液，再用含鈣、鎂的Hank's 平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）稀釋成濃度為1 μmol/L 的工作液。棄除培養基后，加入適量工作液覆蓋細胞，于培養箱中孵育30 min，最后用HBSS 洗滌3 次，胰酶消化后收集細胞進行流式細胞儀分析。

1.3 研究內容

檢測N C 組、H/R 組、A d-s h N C 組、A d-shXBP1s 組XBP1s 信使RNA（messenger RNA，mRNA）和蛋白表達情況，驗證沉默效率及H/R 對細胞XBP1s 表達的影響。檢測Ad-shNC 組、AdshNC+H/R 組、Ad-shXBP1s+H/R 組β-半乳糖苷酶染色情況，細胞衰老標志物p53、p21、γH2AX 表達情況，ROS、MDA 和SOD 水平。驗證XBP1s 轉錄調控Sirt3，檢測下調XBP1s 后Sirt3 及下游SOD2 表達，并檢測mtROS。

1.4 統計學方法

實驗數據用軟件GraphPad Prism 9.0 進行統計分析，數據符合正態分布以均數 ± 標準差表示，采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析進行比較分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H/R 處理原代腎小管上皮細胞后XBP1s 表達上升

與NC 組比較，H/R 組XBP1s mRNA 相對表達量升高（P＜0.001，圖1A），XBP1s 蛋白表達增多（圖1B）。與Ad-shNC 組比較，Ad-shXBP1s 組XBP1s mRNA 相對表達量下降（P＜0.001，圖1C），XBP1s 蛋白表達減少（圖1D）。

圖1 H/R 對腎小管上皮細胞XBP1s 表達的影響Figure 1 The effect of H/R on XBP1s expression in renal tubular epithelial cells

2.2 下調XBP1s 減輕H/R 誘導的腎小管上皮細胞衰老

與Ad-shNC 組相比，Ad-shNC+H/R 組β-半乳糖苷酶染色陽性細胞數增加，衰老標志蛋白p53、p21、γH2AX 表達增多；與Ad-shNC+H/R 組比較，Ad-shXBP1s+H/R 組β-半乳糖苷酶染色陽性細胞數減少，p53、p21、γH2AX 表達減少（圖2）。

圖2 下調XBP1s 減輕H/R 誘導的細胞衰老Figure 2 Downregulation of XBP1s mitigates cell senescence induced by H/R

2.3 下調XBP1s 減輕H/R 誘發的氧化應激

與Ad-shNC 組比較，Ad-shNC+H/R 組ROS、MDA 水平較高，SOD 活性下降；與Ad-shNC+H/R組比較，Ad-shXBP1s+H/R 組ROS、MDA 水平較低，SOD 活性升高（均為P＜0.05，圖3）。

圖3 下調XBP1s 減輕H/R 誘發的氧化應激Figure 3 Downregulation of XBP1s alleviates oxidative stress induced by H/R

2.4 XBP1s 調控Sirt3/SOD2/mtROS 通路

通過ChIP-seq 篩選出XBP1s 轉錄調控的且與細胞衰老和氧化應激密切相關的分子Sirt3，XBP1s 可能與Sirt3 基因啟動子區域結合（圖4A）。ChIPqPCR 證明XBP1s 與Sirt3 基因啟動子序列中的引物5 對應的擴增序列結合，與IgG 組相比，XBP1s 組富集倍率增高（P＜0.01，圖4B）。

圖4 下調XBP1s 對Sirt3/SOD2/mtROS 信號軸的影響Figure 4 The impact of downregulating XBP1s on the Sirt3/SOD2/mtROS signaling axis

RT-qPCR 結果顯示，Ad-shNC+H/R 組Sirt3 mRNA 相對表達量較Ad-shNC 組下降，Ad-shXBP1s+H/R 組Sirt3 mRNA 相對表達量較Ad-shNC+H/R 組升高（均為P＜0.01，圖4C）。

蛋白質印跡結果顯示，Ad-shNC+H/R 組Sirt3 蛋白表達較Ad-shNC 組減少，Ad-shXBP1s+H/R 組Sirt3 蛋白表達較Ad-shNC+H/R 組增多（圖4D）。與Ad-shNC 組比較，Ad-shNC+H/R 組Ac-SOD2/SOD2 比值升高；與Ad-shNC+H/R 組比較，AdshXBP1s+H/R 組Ac-SOD2/SOD2 比值下降（均為P＜0.01，圖4D、E）。

流式細胞術結果顯示，A d-s h N C+H/R 組mtROS 產生較Ad-shNC 組增多，Ad-shXBP1s+H/R組mtROS 產生較Ad-shNC+H/R 組減少（均為P＜0.01，圖4F、G）。

3 討論

近年來，細胞衰老在IRI 中的作用越來越受到關注[3,17-19]，研究表明，在小鼠單側腎IRI 模型中，誘導衰老腎小管上皮細胞凋亡能減輕腎纖維化[20]。故探索細胞衰老發生機制從而開發新型干預策略至關重要。

筆者團隊前期發現下調XBP1s 能減少H/R 后mtROS 的產生及p53 表達[11,21]，但尚不清楚XBP1s能否調控ROS 誘導的細胞衰老。有研究報道，線粒體相關的Sirt3 可減少SOD2 乙?；潭?，增強SOD2 活性，抑制mtROS 產生[22-24]。本研究采用原代腎小管上皮細胞建立H/R 模型，證明下調XBP1s 能減輕H/R 誘導的細胞衰老，其機制可能是減少了XBP1s 對Sirt3 的轉錄抑制，使Sirt3 表達上調，促進SOD2 的去乙?；?，從而增強SOD2 活性，抑制mtROS 產生，減輕氧化應激。

研究表明H/R 可通過氧化應激使細胞過早發生衰老[4,16,25-26]。為探討XBP1s 對H/R 誘導的細胞衰老的影響，本研究通過腺病毒靶向沉默XBP1s，結果顯示下調XBP1s 減少了衰老細胞，同時抑制了氧化應激水平。然而，XBP1 與細胞衰老的關系尚存爭議。在自然衰老小鼠中，過表達XBP1 能防止甚至恢復認知功能衰退，保持突觸傳遞的完整性并減少衰老細胞的自然積累[27]。在結腸癌中，XBP1u 可通過增強p53 泛素化負向調控與細胞衰老密切相關的p53/p21軸[28]。由此可見，XBP1 與細胞衰老的關系需放在具體疾病模型、組織細胞類型及衰老類型中探討。

本研究通過ChIP-seq 篩選XBP1s 轉錄調控的下游分子并通過ChIP-qPCR 驗證其與啟動子序列的結合，Sirt3 作為Sirtuins 家族中最重要的線粒體去乙?；竅29-30]，可通過位于線粒體的抗衰老分子SOD2 起到抗氧化應激作用，并且S i r t 3 可以直接結合SOD2 使其去乙?；痆14,31-35]。本研究結果證明XBP1s 可對Sirt3 起到轉錄抑制作用，下調XBP1s 減少其對Sirt3 的轉錄抑制，促進SOD2 去乙?；?，從而增強其抗氧化應激活性。近年研究表明，Sirt3/SOD2/mtROS通路除了在氧化應激和細胞衰老中起作用，在炎癥、自噬性細胞死亡、鐵死亡、線粒體穩態中也起到重要調控作用[12,36-38]。這為拓寬XBP1s 的調控作用提供了可能的探索路徑。

綜上所述，本研究通過構建腎小管上皮細胞H/R 模型，證實下調XBP1s 可減輕細胞衰老，其可能是通過Sirt3/SOD2/mtROS 信號軸發揮作用。這一研究結果可能為延緩急性腎損傷向慢性腎病進展提供新的理論基礎和研究方向。但本研究未探索上調XBP1s 后產生的效應，且細胞實驗不能完全模擬體內病理生理過程，缺乏臨床標本數據加以驗證，后續仍需要進一步探索。