酒精性肝炎自噬關鍵基因的篩選及生物信息學分析

袁超 練慶海 尼貝貝 許燕 張彤 張劍

酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）是酒精性肝病的急性臨床表現[1]，其發病機制由多種因素造成，除遺傳因素外，也與酒精誘導的肝損傷、活性氧、脂肪變性、炎癥等有關[2-5]。持續的慢性肝損傷會導致肝纖維化、肝硬化和肝衰竭[6-8]，最終可能發展為肝細胞癌[9]。戒酒是AH 的最佳治療方法[10]，如繼續進展至肝硬化或肝細胞癌等晚期疾病，可能需要肝移植[11]。早期肝移植可以提高藥物治療無效的重度AH 患者的生存率，但高昂的手術費用及術后很可能恢復飲酒習慣使得患者施行肝移植手術的意愿低[12]。因此，迫切需要探索新的AH 治療方法。

自噬在維持細胞內穩態、清除老化或異常細胞成分等方面發揮著重要的作用[13-17]，從而影響細胞代謝、免疫調節、細胞凋亡和疾病的發生與發展[18]。自噬在清除肝細胞中的脂滴方面起著關鍵作用[19]，長期飲酒會抑制自噬，從而降低脂質清除率[20]。而急性酒精攝入可能會激活自噬，進而去除受損的線粒體和積累的脂肪酸[21]。這意味著對AH 患者來說，自噬對減少酒精帶來的肝損傷至關重要[22]，增強自噬可能是AH 的治療策略[23]。然而自噬與酒精性肝炎之間的具體調控機制尚未明確。本研究擬通過生物信息學的方法，將酒精性肝炎和自噬進行交叉分析，篩選出與AH 自噬相關的基因[24]，探討能預測AH 患者預后的生物標志物及治療靶點[25]，旨在為改進AH 的診斷、疾病風險預測以及個性化治療方案制定提供了新的視角及解決方案。

1 材料與方法

1.1 AH 芯片數據源

筆者從基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫官方網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載了AH 芯片數據集（GSE28619、GSE142530）及其對應的臨床數據文件。GSE28619 包含22 個樣本的基因表達譜，包括15 個AH 樣本和7 個正常肝臟樣本，GSE142530 包含28 個樣本，包括10 個AH 樣和12 個正常肝臟樣本，以及6 個肝硬化樣本。

1.2 生物信息學分析方法

1.2.1 基因表達差異分析 通過GEO2R 工具進行分析。將|log2FC|＞1 且P＜0.05 的基因被視為差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）。從GeneCards（https://www.genecards.org/）和MSigDB（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb）數據庫下載分別得到1 0 3 9 2 個和6 4 6 個自噬相關基因（autophagy-related gene，ARG）。DEG 和ARG 之間一致的基因被鑒定為差異性表達的自噬相關基因（differentially expressed autophagy-related gene，DEARG）。使用R 軟件（版本3.6.3）創建熱圖、火山圖。

1.2.2 加權基因共表達網絡分析 利用R 軟件構建AH 的加權基因共表達網絡分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）表達矩陣。為綜合考慮W G C N A 篩選的與A H 相關的基因、DEG 和ARG，使用韋恩圖分析這三者之間的共同基因。最終獲取了與AH 顯著相關的11 個關鍵自噬相關基因（hub 基因）。

1.2.3 關鍵基因蛋白質相互作用網絡的構建 為了深入研究這11 個自噬基因的功能網絡，采用TRING 數據庫（https://string-db.org/），借助R 軟件包構建了自噬基因的蛋白質相互作用（p r o t e i n-p r o t e i n interaction，PPI）網絡。

1.2.4 基因本體和京都基因與基因組百科全書通路富集分析 使用R 軟件進行基因本體（gene ontology，G O）和京都基因與基因組百科全書（K y o t o Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。校正后的P＜0.05 為差異有統計學意義。

1.2.5 免疫浸潤分析 通過使用CIBERSORT 算法來計算每個樣本中T 細胞亞群、B 細胞、巨噬細胞等免疫細胞類型的比例。通過使用ssGSEA 算法來計算每個樣本中免疫相關基因集的富集得分，從而了解免疫細胞在樣本中的整體活性。在完成CIBERSORT 和ssGSEA 計算后，進行了相關性分析、差異分析等，以探究免疫浸潤與自噬基因之間的關聯。

1.2.6 自噬相關基因的驗證以及AH 不同進展程度的分析 通過使用兩個公共基因表達數據集GSE155907和GSE143318 來驗證本研究篩選的11 個自噬基因的差異表達情況，用于探究自噬基因在AH 中的變化。通過使用GSE103580 數據集來對11 個自噬基因在AH 不同進展程度中的表達進行分期，研究11 個自噬基因在不同分期中的表達變化。使用M a n n-WhitneyU檢驗和可視化工具來分析GSE155907、GSE143318 和GSE103580 的數據，并進一步探究11 個自噬基因在AH 中的表達特征和與進展程度的關聯。

1.2.7 mRNA-miRNA 調控網絡的構建 使用miRNet 2.0（https://www.mirnet.ca/）預測免疫相關基因與其靶微小RNA（microRNA，miRNA，miR）和轉錄因子（transcription factor，TF）之間的相互作用。然后建立信使RNA（messenger RNA，mRNA）-miRNA和mRNA-TF 調控網絡來描述mRNA、miRNA 和TF 之間的相互作用，作為AH 細胞的潛在靶點。最后使用mirPathv.3 數據庫對這些預測得到的miRNA進行富集分析。

1.2.8 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應 提取總R N A 并使用逆轉錄試劑盒逆轉錄成互補D N A（complementary DNA，cDNA）。根據實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒說明書進行RT-qPCR。采用2-△△Ct計算mRNA的相對表達水平。

1.3 樣本來源及主要試劑

1.3.1 樣本來源 選取5 例AH 患者病肝和6 例健康供肝標本。入選標準：2022年1月1日至2023年6月30日在中山大學附屬第三醫院肝移植科進行非活體肝移植手術的受者及對應供者，受者年齡18～75 歲。排除標準：供者≥75 歲、重度脂肪變性供肝肝移植以及親屬活體肝移植。采樣已獲得中山大學附屬第三醫院倫理審查委員會的批準（倫理號：中大附三醫倫[2022]02-122-01）。所有參與研究的患者簽署了知情同意書。

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級6～8 周齡C57BL/6J 雌性小鼠購買自廣東藥康生物科技有限公司。AH 模型小鼠構建參考文獻[26]，通過檢測各項指標（肝臟指數、肝功能指標、肝組織脂質代謝指標、肝組織病理學觀察等）確認造模成功[26]，選取8 例AH 模型小鼠和8 例正常小鼠的肝臟樣本。動物實驗已獲得中山大學附屬第三醫院倫理審查委員會的批準（批準號：IACVC-F3-20-6 517）。

1.3.2 主要試劑 逆轉錄試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，AG11711）；RT-qPCR 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Q711-02）。

1.4 統計學方法

采用R 軟件（版本4.1.3）進行統計學分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的計量資料采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DEARG 的鑒定

為了評估組內數據的重復性，對GSE28619、GSE142530 數據集進行主成分分析（principal component analysis，PCA），結果顯示數據的重復性良好（圖1 A、B）。差異表達分析顯示，在GSE28619 中AH 組與對照組共有1 569 個DEG，其中856 個基因上調，713 個基因下調（圖1C）；在GSE142530 中AH 組與對照組共有3 242 個DEG，其中1 756 個基因上調，1 486 個基因下調（圖1D）。同時，對這兩個數據集進行WGCNA，圖1 E、F 和圖1G、H 分別為基因的聚類樹狀圖和基因模塊與臨床特征相關熱圖。動態樹切割算法分別識別出11 個和14 個基因模塊（圖1G、H），在圖1G 中黃綠色和紅色模塊與AH 高度相關（|R|＞0.6，P＜0.01），在圖1H 中赭色和淺黃色模塊與AH 高度相關（|R|＞0.6，P＜0.001），因此將這4 個模塊中的基因視為AH 相關基因。

2.2 AH 中ARG 的鑒定和富集分析

從GeneCards 和MSigDB 數據庫分別下載10 392 個和646 個ARG，與DEG 和WGCNA 結果取交集，分析鑒定了11 個表達一致上調的DEARG（EEF1A2、CFTR、SOX4、TREM2、CTHRC1、HSPB8、TUBB3、PRKAA2、RNASE1、MTCL1、HGF），繪制了韋恩圖（圖2A）。11 個DEARG 在GSE28619 和GSE142530 中的表達熱圖分別見圖2B、C，11 個DEARG 在染色體上的位置見圖2D。獲得11 個DEARG 后，在STRING 數據庫中構建一個包含這11 個基因的PPI 網絡以探索它們之中潛在的相互作用（圖2E）。KEGG 通路富集分析結果顯示，主要涉及的信號通路是叉頭盒蛋白O（forkhead box protein O，FoxO）信號通路、Apelin 信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monphosphate activated protein kinase，AMPK）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、Rap1 信號通路和鈣離子信號通路（圖2F）。在GO 生物過程類別中，大多數DEARG 主要參與自噬調節、細胞對氧化應激的反應、蛋白折疊等（圖2G）。在GO 細胞組分類別中，大多數DEARG 富集在膜微域和膜筏中（圖2H）。在GO 分子功能類別中，多數DEARG 富集在蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、熱休克蛋白結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等（圖2I）。

圖2 AH 中ARG 的篩選及功能分析Figure 2 Screening and functional analysis of ARG associated with AH

2.3 免疫浸潤分析

通過計算每個樣本中免疫相關基因集的富集得分，可以充分了解到免疫細胞在樣品中的整體活性。樣品的24 個免疫細胞的比例見圖3A，各免疫細胞之間的相關性見圖3B，其中輔助性T 細胞（helper T cell，Th）17、CD8+T 細胞與Th 高度相關，嗜酸性粒細胞與B 細胞高度相關，細胞毒性T 細胞、T 細胞與γδT 細胞高度相關，中性粒細胞與Th1 高度相關。在AH 組中，有較高比例的未成熟樹突狀細胞，而CD8+T 細胞、細胞毒性T 細胞、嗜酸性粒細胞、γ δ T 細胞和T h 1 7 比例較低（圖3 C）。通過Spearman 相關系數揭示了免疫細胞的豐度和hub 基因表達之間的關系，結果表明B 細胞、CD8+T 細胞、細胞毒性T 細胞、嗜酸性粒細胞、γδT 細胞和Th17 與hub 基因呈負相關，未成熟樹突狀細胞與hub 基因呈正相關（圖3D）。

圖3 免疫浸潤分析-ssGSEA 算法Figure 3 Immune infiltration analysis-ssGSEA algorithm

與此同時，本研究也通過CIBERSORT 算法計算AH 中各種免疫細胞類型的相對豐度，以期得到更完善的結果。樣品的22 個免疫細胞的比例見圖4A。各免疫細胞之間的相關性見圖4B，其中活化肥大細胞與靜息肥大細胞高度相關，M1 型巨噬細胞與γδT 細胞高度相關。在AH 組中，有較高比例的靜息肥大細胞和M0 型巨噬細胞，并且γδT 細胞比例較低（圖4C）。通過Spearman 相關系數揭示了免疫細胞的豐度和hub 基因表達之間的關系（圖4D），結果表明CFTR、HSPB8、TUBB3、HGF 基因與γδ T 細胞呈負相關，EEF1A2、CFTR、SOX4、TREM2、CTHRC1、HSPB8、TUBB3、PRKAA2、RNASE1、HGF、MTCL1 基因與M0 型巨噬細胞呈正相關，靜息樹突狀細胞與EEF1A2、PRKAA2 基因呈正相關，靜息肥大細胞與TUBB3 基因呈正相關，活化肥大細胞與EEF1A2、TREM2、TUBB3 基因呈負相關。

圖4 免疫浸潤分析-CIBERSORT 算法Figure 4 Immune infiltration analysis-CIBERSORT algorithm

2.4 數據集驗證

用GSE155907 和GSE143318 作為驗證集，為了評估組內數據的重復性，在本研究中對2 個數據集進行PCA，結果顯示數據的重復性良好（圖5A、D）。11 個關鍵基因均為上調基因（圖5B、E），且在AH 組中表達量高于對照組（圖5C、F）。

圖5 GSE155907、GSE143318 數據集驗證和AH 不同分期的基因表達Figure 5 Datasets validation of GSE155907 and GSE143318 and gene expression of AH at different stages

2.5 臨床相關性分析

為了探究hub 基因在不同進展階段的酒精性肝病中的表達關系，用GSE103580 數據集（不包含TUBB3 基因）進行驗證，數據集中包含了不同進展階段的酒精性脂肪肝、急性AH 和酒精性肝硬化的患者樣本。分析發現CFTR、HGF、HSPB8、SOX4、MTCL1、PRKAA2、RNASE1、TREM2 基因在酒精性肝病的不同進展階段有不同的表達水平，除TREM2 基因外，其余的基因在酒精性肝硬化階段的表達量最高，且CFTR 和PPKAA2 基因在酒精性肝硬化比在AH 階段的表達大幅度增高，提示其在酒精性肝硬化的發展中發揮著重要作用（圖5G～P）。

2.6 mRNA-miRNA、mRNA-TF 網絡的構建

采用miRNet 2.0 數據庫對肝臟中的11 個基因進行了miRNA 和TF 的預測。mRNA-miRNA 和mRNA-TF 網絡分析表明這11 個基因共調控了56 個m i R N A 和2 4 個T F（圖6 A），且H S P B 8、CTHRC1、PRKAA2、EEFIA2、MTCL1、SOX4 等基因都可能與hsa-miR-124-3p（又稱hsa-let-7b-5p）存在調控關系。使用mirPath v.3 數據庫對這些預測得到的miRNA 進行富集分析，以進一步深入了解這些miRNA 在調控網絡中的功能作用（圖6B），結果表明，這些miRNA 在多個信號通路中富集，其中包括FoxO 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β 信號通路以及與脂肪酸代謝相關的通路。

圖6 mRNA-miRNA 和mRNA-TF 網絡圖Figure 6 mRNA-miRNA and mRNA-TF network diagram

2.7 RT-qPCR 驗證

為了進一步驗證以上分析結果，本研究收集5 例AH 患者病肝和6 例健康供肝的肝臟組織，通過RT-qPCR 檢測EEF1A2、CFTR、SOX4、TREM2、CTHRC1、HSPB8、TUBB3、PRKAA2、RNASE1、MTCL1、HGF 基因的相對表達量，圖7A 結果顯示SOX4、TREM2、CTHRC1、HSPB8、TUBB3、PRKAA2、RNASE1 與生物信息學分析結果一致，在AH 患者肝臟組織中的相對表達量高于健康對照組。同時，本研究也利用AH 小鼠來驗證上述7 個基因的表達趨勢，結果顯示SOX4、TREM2、HSPB8、PPKAA2 基因在AH 小鼠中的相對表達量高于健康對照小鼠（圖7B）。

圖7 RT-qPCR 驗證結果Figure 7 Results of RT-qPCR validation

3 討論

自噬在酒精性肝損傷中發揮著重要作用，可能成為治療AH 的一個潛在靶點。本文從自噬相關基因的角度，通過生物信息學的方法，鑒定和驗證了AH 潛在的關鍵生物標志物。

在本研究中，將ARG 與DEG 和WGCNA 結果取交集，識別出11 個上調基因。根據KEGG 結果，DEARG 主要涉及的途徑是PI3K-Akt 信號通路、FoxO 信號通路和Apelin 受體信號通路[27]。PI3KAkt 信號傳導途徑參與急性酒精性脂肪肝的發生發展過程，PI3K-Akt 抑制劑可能具有治療酒精性脂肪肝的潛力。FoxO 不僅通過激活自噬基因的轉錄來誘導自噬，還通過與自噬蛋白相互作用和通過表觀遺傳機制（如通過組蛋白修飾和miRNA）來調節自噬活性[28]。自噬也可以直接或間接地調節FoxO 的降解[29-30]。FoxO 轉錄因子可調節Atg14 基因的表達[31]，并對肝臟自噬和脂質代謝有著顯著影響。Apelin信號通路通過PI3K 途徑激活AMPK 和誘導PPARα生成來防止肝臟中的脂質積累[32-33]。PPI 網絡和模塊分析顯示，11 個關鍵基因與其下游基因形成緊密的相互作用，共同調控AH 的發生發展。為充分探討AH 炎癥細胞失調的情況，本文進行了免疫浸潤分析，發現AH 組中未成熟樹突狀細胞、靜息肥大細胞和M0 型巨噬細胞比例較高，而CD8+T 細胞、細胞毒性T 細胞、嗜酸性粒細胞、γδT 細胞和Th17 比例相對較低。這幾項指標都代表AH 患者處于疾病初期，尚未發生明顯的感染或炎癥過敏反應，沒有受體與抗原結合，尚未參與到吞噬和抗原處理的階段，免疫應答不足。這充分說明AH 階段尚不嚴重，積極干預將會取得較好的成果。

用GSE155907 和GSE143318 作為驗證集發現，11 個關鍵基因均為上調基因，且在酒精組中表達量高于對照組，與上述研究結果相同。臨床相關性分析發現，CFTR 和PPKAA2 這兩個基因在酒精性肝硬化比在AH 階段的表達顯著增高。在酒精性肝硬化中，肝細胞受到長期酒精攝入和炎癥反應的刺激，導致細胞的功能和結構嚴重受損。為了應對這種嚴重的細胞損傷，細胞會通過增加自噬途徑來清除受損的細胞器和蛋白質，以維持細胞的穩態。因此，在酒精性肝硬化中，自噬的活性最高。

miRNA、lncRNA 預測發現hsa-miR-124-3p 可能是酒精性脂肪肝自噬的潛在靶點，有研究表明在肺癌的發生發展中，miR124-3p-STAT3-PRKAA 途徑誘導自噬的發生[34]。在帕金森病的發病機制中，miR-124 可調節p62/p38 的表達，進而促進自噬[35]。本研究中miRNA-mRNA 調控網絡分析結果提示，hsamiR-124-3p 可能是酒精性脂肪肝自噬的潛在靶點。

隨后，本研究對AH 患者和小鼠樣本進行RTqPCR 驗證，結果顯示4 個關鍵基因SOX4、TREM2、HSPB8、PPKAA2 在AH 組中的表達量顯著增高。根據已有研究，SOX4 在肥胖患者的肝臟中顯著上調，可促進肝臟脂肪變性，是肝脂肪代謝的重要組成部分，可能與AH 的發生發展有著密切的聯系[36]，而SOX4 與自噬相關聯系尚無文獻報道。HSPB8 與ATG3（自噬相關蛋白3）相互作用，可促進自噬體-溶酶體融合[37]，進而影響肝臟脂質代謝，從而可能參與AH 的發生發展。PPKAA2 可以顯著減少酒精引起的肝損傷并增強肝細胞的線粒體自噬水平[38]。TREM2 通過調節肥胖及其并發癥（如非酒精性脂肪性肝?。┑陌l生和進展來影響脂質代謝[39]，且TREM2可調節巨噬細胞自噬水平，進而影響動脈粥樣硬化的進展[40]，而TREM2 與AH 和自噬的關系還需進一步研究。這也許預示了這4 個關鍵基因可能在AH 與自噬的發生發展中起關鍵性作用，并可作為AH 與自噬的潛在靶點。

綜上所述，本文通過生物信息學分析識別出11 個AH 自噬關鍵上調基因（EEF1A2、CFTR、SOX4、TREM2、CTHRC1、HSPB8、TUBB3、PRKAA2、RNASE1、MTCL1、HGF），其中，SOX4、TREM2、HSPB8、PPKAA2 在AH 患者和小鼠樣本中都顯著升高，可能是AH 中自噬的關鍵基因。AH 與自噬的具體作用機制仍需進一步深入探究。