肺缺血-再灌注核心基因介導的競爭性內源性RNA網絡的構建

李曉鳳 唐明政 劉禧禧 宋子晴 張國欣 楊開銀 張凌云

自1983年以來，肺移植已成為治療各種終末期肺病的有效方法，全球每年約有4 000 例雙肺或單肺移植[1-2]。肺移植目前存在的主要問題是供者短缺[3]。據報道，約24%等待供肺的患者可能死亡[4]。肺缺血-再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）是導致肺移植失敗和病死率高的主要原因[5]，包括局部缺血性損傷和再灌注損傷[6]?，F有改善LIRI 的治療方案主要包括支持和替代治療[7-9]。對尋找生物標志物、干細胞療法、藥物治療和基因治療等干預措施還在探索中[10]，很少有用于臨床的預防和治療策略。因此，仍需要探索新策略預防LIRI，改善肺移植后的短期和長期預后。

競爭性內源性RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）是含有微小RNA（micro RNA，miRNA，miR）識別元件的RNA[11]，可以通過與miRNA 競爭性結合來調節含有相應識別元件的基因或蛋白質表達[12]。其中環狀RNA（circRNA）可通過反剪形成閉環，保護其免受核糖核酸酶R 的侵害，并穩定表達[13]。根據序列起源，circRNA 可分為3 類：外顯子circRNA，內含子circRNA 和外顯子-內含子circRNA[14]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可以“海綿”互補miRNA，促進其靶分子的去抑制，在lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA網絡中發揮作用[12,15]。ceRNA 網絡可能會影響疾病并解釋疾病過程，為新療法提供思路[12]。因此，有必要在L I R I 中發現新的功能性以l n c R N A 介導的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 網絡，以確定更多與LIRI 診斷和預后相關的ceRNA 網絡。本研究整合了多種生物信息學分析工具，以探索LIRI 的核心基因、通路、靶向藥物和ceRNA 構建，為其治療提供新的策略和思路。

1 材料與方法

1.1 微陣列數據信息

基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫是一個提供高通量基因表達數據的公共基因組學數據存儲庫[16]。從GEO 數據庫下載原始數據GSE145989 作為訓練集，其中包括67 個人肺冷缺血樣本和67 個人肺再灌注樣本。將GSE172222 和GSE9634 數據集當作驗證集，GSE172222 包括15 個人正常樣本和16 個人LIRI 樣本，GSE9634 包括6 個大鼠正常樣本和12 個大鼠LIRI 樣本。

1.2 DEG 的識別

使用LIMMA 包（http://www.bioconductor.org/packa ges/release/bioc/html/limma.html）分析微陣列數據，比較肺缺血與肺再灌注組織的表達值，以識別差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）。在t檢驗后，將P值進行調整，并設定P＜0.05 且對數折變率（logFC）＞1 作為篩選標準。使用熱圖包（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/he atmaps.html）繪制DEG 熱圖。

1.3 基因本體、通路富集分析

DAVID 基因功能分類工具可將大基因分類為生物模塊[17]?；虮倔w（gene ontology，GO）是主要用于注釋基因并分析其生物過程的生物信息學工具，而京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）則是一種數據庫資源，可從高通量實驗技術生成的大規模分子數據集中了解高級功能和生物系統。本研究使用clusterProfiler軟件包（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html）對DEG 進行GO 和KEGG 通路分析。GO 分析包括分子功能（molecular function，MF）、細胞成分（cellular component，CC）和生物學過程（biological process，BP），而通路分析則通過KEGG 對DEG 進行分類。本研究設置P＜0.05 和基因計數＞5 為臨界點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡集成

STRING 數據庫是一個在線資源，其主要功能是構建功能性蛋白質關聯網絡[18]。本研究定義交互作用評分＞0.9（中等可信度）為顯著性。使用Cytoscape軟件構建了蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，并進一步分析DEG 之間的相互作用關系[19]。

1.5 篩選并驗證核心基因

通過MCODE 插件選擇候選核心基因，采用RStudio 中的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）軟件包繪制ROC 曲線，對核心基因進行分析[20]。曲線下面積（area under the curve，AUC）＞0.6 和P＜0.05 作為核心基因的判定標準。

1.6 通過CIBERSORT 分析進行免疫浸潤

采用CIBERSORT 算法分析之前獲得的基因表達數據，以獲取22 種免疫細胞的比例，其中包括幼稚B 細胞、記憶B 細胞、漿細胞、CD8+T 細胞、幼稚CD4+T 細胞、靜息記憶CD4+T 細胞、活化記憶CD4+T 細胞、濾泡輔助性T 細胞、調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg）、γδT 細胞、靜息自然殺傷（natural killer，NK）細胞、活化NK 細胞、單核細胞、M0 型巨噬細胞、M1 型巨噬細胞、M2 型巨噬細胞、靜息樹突狀細胞、活化樹突狀細胞、靜息肥大細胞、活化肥大細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞。使用P＜0.05 篩選樣品，并計算各種免疫細胞在樣品中的百分比。利用R 版本4.2.1 中的vioplot 軟件包，分析免疫細胞的免疫浸潤水平。

1.7 ceRNA 網絡的構建和驗證

通過starBase 檢測和鑒定5 個核心基因預測的mRNA-miRNA 相互作用。從美國國家生物技術信息中心獲取mRNA 序列，使用miRbase 下載人類miRNA 序列，使用miRanda 數據庫預測mRNAmiRNA 的核酸結合。使用TargetScan 數據庫預測miRNA 靶基因。StarBase 用于篩選mRNA-lncRNA相互作用，構建mRNA-miRNA-lncRNA 的ceRNA 網絡。驗證ceRNA 網絡成員在GSE145989、GSE172222和GSE9634 中的表達。

1.8 基于ceRNA 網絡的靶向藥物

使用DGIdb 數據庫分析可能靶向標記基因的藥物，并基于ceRNA 網絡成員，構建并分析它們之間的相互作用關系。

1.9 統計學方法

對所有的基因數據進行了對數轉換以進行歸一化處理，并使用R 軟件（版本4.2.1）對數據進行可視化。P＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 DEG 的識別及GO、KEGG 和免疫細胞浸潤分析

人LIRI 上調的DEG 基因101 個，下調的DEG 基因197 個。按調整后的P值排序的前100 個基因在各樣本中的表達量通過熱圖顯示（圖1A）。

圖1 DEG 的GO、KEGG 和免疫細胞浸潤分析Figure 1 GO,KEGG and immune cell infiltration analysis of DEG

GO 分析結果顯示，DEG 的BP 主要與細胞遷移、分化和調節有關；CC 主要與內吞囊泡膜、漿膜和膜筏有關；MF 主要與趨化因子受體、G 蛋白偶聯受體、免疫受體活性和抗原結合有關（圖1B、C）。

KEGG 分析結果顯示，DEG 參與趨化因子、甲狀腺激素、松弛素、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly adenosine-diphosphate-ribose polymerase，PPAR）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、Wnt、白細胞介素（interleukin，IL）-17、T 細胞受體、B 細胞受體、核因子（nuclear factor，NF）-κB 等信號通路，及癌癥中的程序性細胞死亡蛋白配體1（programmed cell death protein-ligand 1，PD-L1）表達和程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）檢查點通路（圖1D）。

免疫細胞浸潤分析表明DEG 與漿細胞、幼稚T 細胞、靜息記憶CD4+T 細胞、活化記憶CD4+T 細胞、γδT 細胞、靜息NK 細胞、活化NK 細胞、M1 型巨噬細胞、M2 型巨噬細胞、靜息樹突狀細胞、活化樹突狀細胞、靜息肥大細胞、活化肥大細胞和中性粒細胞有關（圖1E）。

2.2 核心基因的篩選

PPI 網絡共獲得了179 個節點，包括118 個上調基因和61 個下調基因組成的DEG（圖2A），差異基因打分結果見圖2B。CD8A、IL2RG、STAT1、CD3G 和SYK 為能夠區分肺缺血和再灌注的候選核心基因，在高表達組中，這5 個基因呈上調狀態（圖2C）。5 個基因之間呈正相關關系，具有功能相似性（圖2D）。

圖2 核心基因的篩選Figure 2 Screening of the core genes

2.3 核心基因的診斷作用

CD8A、IL2RG、STAT1、CD3G 和SYK 5 個核心基因在訓練集LIRI 組高表達（圖3A），在驗證組數據集里也高表達（圖3B、C）。ROC 曲線結果顯示這5 個核心基因診斷LIRI 具有相對較強的效力，但是CD8A 在鼠源性的LIRI 診斷效力比人源性的LIRI 更強（圖3D、E）。

圖3 核心基因的驗證Figure 3 Validation of core genes

2.4 核心基因和免疫細胞相關性分析

SYK 與靜息樹突狀細胞，M0 型巨噬細胞和濾泡輔助性T 細胞呈正相關，與活化樹突狀細胞和漿細胞呈負相關；STAT1 與M1 型巨噬細胞呈正相關；IL2GR 與中性粒細胞和活化記憶CD4+T 細胞呈正相關，與活化樹突狀細胞、M2 型巨噬細胞、靜息肥大細胞和靜息記憶CD4+T 細胞呈負相關；CD8A 與活化記憶CD4+T 細胞，CD8+T 細胞和濾泡輔助性T 細胞呈正相關，與幼稚C D 4+T 細胞呈負相關；CD3G 與M1 型巨噬細胞和CD8+T 細胞呈正相關，與記憶B 細胞、活化樹突狀細胞和幼稚CD4+T 細胞呈負相關（圖4）。

圖4 核心基因和免疫細胞相關性分析Figure 4 Correlation analysis of core genes and immune cell

2.5 ceRNA 網絡構建與表達驗證

ceRNA 網絡包括205 個節點（5 個核心基因，98 個miRNA，102 個lncRNA），217 個邊緣（圖5A）。共5 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-146a-3p，10 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-28-5p 和5 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-593-3p 共同控制CD3G 的表達；19 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-149-3p，8 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-342-5p，6 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-873-5p 和5 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-491-5p 共同調節IL2RG；3 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-194-3p 和miR-512-3p，5 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-377-3p 和8 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-590-3p 共同調節SYK；1 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-590-3p 和4 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-875-3p 共同調節CD8A；6 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-143-5p，4 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-1 231，8 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-590-3p 和4 個lncRNA 可以競爭性地結合miR-875-3p 共同調節STAT1。

圖5 ceRNA 網絡構建與表達驗證Figure 5 ceRNA network construction and expression validation

基于c e R N A 成員在數據集G S E 1 4 5 9 8 9、GSE172222 和GSE9634 的表達進行驗證，結果發現MUC2、MIR2909、MIR143HG、LINC01165、MIR1205、LINC01070、LINC00689 和TMEM191A均為高表達（圖5B）。

2.6 確定靶向藥物

IL2RG 有4 種靶向藥物，CD3G 有13 種靶向藥物，SYK 有28 種靶向藥物，lncRNA MUC2 有3 種靶向藥物，未發現預測核心基因CD8A、STAT1 和其他ceRNA 網絡基因的靶向藥物。

賽度替尼、PRT-2 607、福坦替尼、R-343、ENTOSPLETINIB、R-112、R-406、HMPL-523、T A K-6 5 9、R-3 4 8 和R-3 3 3 是S Y K 的抑制劑（圖6A）；愛歐山和FORALUMAB 是CD3G 的抑制劑（圖6 B）；達利珠單抗和巴利昔單抗是IL2RG 的抑制劑，而阿地白介素是IL2RG 的受體激動劑（圖6C）；lncRNA MUC2 的靶向藥物有3 種（圖6D）。

圖6 標記基因靶向藥物的預測Figure 6 Prediction of marker gene-targeted drugs

3 討論

肺移植是晚期肺病患者的有效治療方法，但供肺的利用率較低[21]。LIRI 是肺移植術后早期原發性移植物功能障礙的最常見危險因素之一[22]，并且會增加移植物功能障礙和排斥反應等風險[23]。盡管肺移植完全缺氧的時間只持續幾個小時，卻產生無法避免的影響[1]。嚴重的LIRI 可導致原發性移植物功能障礙，這是肺移植術后短期和長期病死率增加的主要原因[24]。目前尚無特定預防LIRI 的治療方法，本研究結合了微陣列基因表達譜和生物信息學方法，旨在探索人類LIRI 過程中潛在新核心基因和分子機制。

首先，從GSE145989 數據集篩選DEG，并進行GEO、KEGG 和PPI 網絡分析，篩選出61 個下調和118 個上調的DEG。通過Cytoscape 鑒定出5 個核心基因并進行ROC 曲線、免疫細胞相關性、ceRNA 網絡構建等一系列分析。GO 分析顯示DEG 與內皮細胞、G 蛋白偶聯受體和免疫相關細胞等有關。有研究發現內皮祖細胞通過內皮型一氧化氮合酶途徑減輕肺移植術后的缺血損傷[25]，LIRI 后肺組織中S1P G 蛋白偶聯受體1 上調表明S1P/S1PR1 軸參與LIRI 的病理生理過程[26]，CXCR2 上調內皮細胞對腎缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）具有保護作用[27]，而單核細胞、淋巴細胞、白細胞和T 細胞浸潤易發生于LIRI 中[28]。KEGG 分析表明DEG 參與包括NF-κB、PPAR、TNF、Wnt、B 細胞受體和Toll 樣受體等信號通路，各通路在LIRI 都扮演著重要的角色。如甲烷和西洛他唑可分別通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）-NF-κB 和PPARA 信號通路調節缺氧-復氧引起的氧化應激、炎癥因子釋放和細胞凋亡，促進LIRI 修復[29-30]。此外，miR-145 可以NF-κB 依賴的方式抑制Beclin1 和SIRT1，從而減弱LIRI 小鼠模型自噬過程[31]。B 細胞依賴性途徑則在小鼠IRI 后慢性肺同種異體移植排斥反應中發揮作用[32]。TNF-α 激活JNK/FoxO3a 軸，延遲中性粒細胞凋亡并導致LIRI 發展[33]。另外，miR-122 通過Toll 樣受體信號通路加速LIRI[34]。

本研究發現，與LIRI 相關的5 個核心基因分別為CD8A、IL2RG、STAT1、CD3G 和SYK，ROC 分析驗證其具有較高的診斷價值。值得注意的是，已有研究證實IL2RG、SYK 和CD8A 與IRI 相關。如IL2RG 小鼠通過減少中性粒細胞損耗來降低肝臟IRI[35]。而抑制SYK 線粒體裂解途徑與IRI 微血管保護有關[36]。另一項研究顯示，CD8A 在腎IRI 過程中表達最高[37]。此外，本研究還發現巨噬細胞與SYK、STAT1 和CD3G 呈正相關，T 細胞及其相關細胞與SYK、IL2GR、CD8A 和CD3G 呈正相關，SYK 與樹突狀細胞和IL2GR 與中性粒細胞呈正相關。有研究發現，巨噬細胞和樹突狀細胞中的Mincle-Syk 通路與微生物群調節能夠影響IL-17 和IL-22 表達[38-39]。但在B 細胞和T 細胞中，SYK 的表達在整個進化過程中是嚴格分離的[40]。此外，STAT1 促進巨噬細胞內Nampt 表達和功能，并且增強巨噬細胞的抗病毒先天免疫[41-42]。CD8A 通常主要在效應性T 細胞和細胞毒性T 淋巴細胞上表達，但有時也在Treg、NK 細胞以及樹突狀細胞上表達[43-45]。

ceRNA 網絡分析揭示了核心基因與眾多的miRNA 和lncRNA 復雜關系，包括miR-146a-3p、miR-149-3p、miR-28-5p、miR-342-5p、miR-377-3p、miR-590-3p、MUC2 和miR143HG 等miRNA 和lncRNA?；赾eRNA 網絡分析結果發現miRNA 已有研究。miR-146a-3p 抑制NF-κB 通路保護心臟和小腸免受IRI[46-47]，并在急性肺損傷中減輕炎癥反應[48]。miR-149-3p 與心肌IRI 有關[49]，而miR-28-5p 與脊髓IRI 也有關[50]。神奇的是，肺源性外泌體中的miR-28-5p 在急性肺損傷中也調節間充質干細胞的功能[51]。此外，lncRNA PEG11as 通過miR-342-5p/PFN1通路加重腦IRI[52]，而miR-342-5p 調控GPRC5A 通路預防心肌IRI[53]。另外，miR-342-5p 和miR-590-3p 分別抑制TLR9 和TRAF6 以減輕敗血癥小鼠的急性腎損傷[54-55]，而miR-377-3p 靶向RPTOR 誘導自噬，從而改善脂多糖誘導的急性肺損傷[56]。下調mmu_circ_0000943 則通過調節mmu-miR-377-3p/Egr2 軸，改善腎IRI 引發的炎癥和氧化應激[57]。此外，miR-590-3p 通過調節HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB 軸來防止氧-葡萄糖剝奪和復氧細胞模型中的IRI[58]。最后，MUC2 黏蛋白和非黏蛋白微生物群在腸損傷中具有特殊的宿主防御作用[59]，而miR143HG通過miR-504 海綿效應和miR-21 甲基化來抑制細胞的增殖[60]。

綜上所述，本研究通過挖掘微陣列基因表達譜和生物信息學相結合，發現了5 個核心基因，為研究LIRI 的分子機制和治療靶點提供了新的思路和切入點。本研究運用基因表達譜和生物信息學相結合的方法發現人類LIRI 過程中的潛在新核心基因和ceRNA，但由于基因芯片數據的可用性有限及滿足研究條件的樣本數較少，本研究納入的樣本量有限，因此仍需要在更多的實驗和臨床實踐中進一步驗證研究結果。