基于網絡藥理學及實驗驗證探討補腎定眩湯治療高血壓的作用機制

肖沐紫，王思齊，賈壯壯，王志剛

高血壓是以體循環動脈壓升高為主要臨床表現的心血管綜合征，是我國危害嚴重的慢性疾病之一，是多種心腦血管疾病的重要病因及危險因素[1]。雖然對高血壓病診治取得了很多進展，藥物不斷更新換代，但高血壓藥物也有諸多不足之處，依然存在用藥持續性和血壓控制率不良等問題[2]。高血壓病發病機制復雜，涉及遺傳因素、環境因素，并與神經機制、腎臟機制、激素機制、血管機制及胰島素抵抗等密切相關，中藥具有的多組分、多靶點、多機制作用特點，在其治療中具有獨特優勢。網絡藥理學作為系統生物學的重要組成部分，從多角度闡釋藥物-靶點-疾病間的復雜網絡關系，與中醫學整體觀念的基本特點相吻合，為研究多組分、多靶點的中藥機制提供可靠的方法[3-5]。本研究采用網絡藥理學結合動物實驗驗證，初步揭示補腎定眩湯對高血壓病的治療作用及調控途徑，為后續基礎研究及臨床推廣提供理論及實驗依據。

1 資料與方法

1.1 補腎定眩湯活性化合物篩選 通過計算系統生物學實驗室數據庫(TCMSP：http：//tcmsp-e.com/tcmsp.php)，設置ADME 參數為OB≥30%、DL≥0.18、Caco-2≥-0.4、BBB≥-0.3、HL≥4 h，對補腎定眩湯方藥組成中包含的天麻、附子、茯苓、黨參、白芍、白術所含化合物進行篩選分析，構建補腎定眩湯活性化合物調控靶點數據庫。

1.2 化合物-靶點網絡構建 將篩選出的補腎定眩湯藥物靶點通過UniProt平臺(https：//www.uniprot.org/)將蛋白靶點轉化為基因，并采用Cytospase 3.6.1軟件將補腎定眩湯化合物-靶點網絡化。

1.3 潛在核心靶點篩選 基于OMIM 數據庫(http：//www.omim.org/)、TTD 數據庫(https：//db.idrblab.net/ttd/) 與DisGeNET 數據庫(http：//www.disgenet.org/)并結合文獻報道篩選高血壓疾病靶點，并與藥物-靶點網絡進行融合，篩選出補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點。

1.4 潛在核心靶點之間蛋白互作網絡分析 基于STRING 數據庫(https：//string-db.org/)，將補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點構建蛋白互作網絡(protein-protein interaction network，PPI)，將靶點關系可視化。

1.5 GO/KEGG 信號通路富集分析 利用DAVID數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)，對生物過程(biological process，BP)、細胞成分(cellular component)、分子功能(molecular function)進行GO/KEGG 調控通路富集分析，綜合預測補腎定眩湯改善高血壓的調控機制。

1.6 實驗動物 選取SPF 級雄性10 周齡自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)及Wistar 大鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006；飼養于天津中醫藥大學動物實驗中心，自由進食進水，室溫20～25 ℃，相對濕度56%～60%；實驗動物所有操作均嚴格按照天津中醫藥大學動物倫理委員會標準執行(TCM-LAEC2015028)。

1.7 分組與干預 將50 只SHR 大鼠隨機分為模型組(Model 組)、卡托普利組(Captopril 組)、補腎定眩湯低劑量組(BSDX-L 組)、中劑量組(BSDX-M組)及高劑量組(BSDX-H 組)；另設10 只Wistar 大鼠為正常對照組(NC 組)，每組各10 只。Captopril組每日給予卡托普利片12.5 mg/kg，補腎定眩湯低、中、高劑量組每天分別按6.3 g/kg、12.6 g/kg、18.9 g/kg 生藥劑量，各組灌胃給藥，NC 組和Model組給予等容積的蒸餾水灌胃，連續給藥6 周。

1.8 血壓測定 各組大鼠分別于給藥6 周后，于大鼠清醒狀態下檢測尾動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒 張 壓 (diastolic blood pressure，DBP) 及平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)，每只大鼠測量3 次，取平均值。

1.9 HIF-1/TGF-β 信號通路檢測 各組大鼠末次測壓之后，3%異氟烷吸入麻醉后，開胸并小心分離胸主動脈，剪取主動脈弓下一段，輕輕將血管周邊殘留的結締組織剝離干凈，再將其放入生理鹽水中進行漂洗，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。采用Western-Blot 法檢測HIF-1α 蛋白表達水平，采用ELISA 法檢測TGF-β 表達水平。

1.10 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計分析軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較若滿足正態分布，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較若方差齊采用LSD 法，不滿足方差齊性采用Tamhane's T2 法；不符合正態分布采用秩和檢驗；最小顯著差異水平設定為P＜0.05。

2 結果

2.1 補腎定眩湯活性化合物信息 通過統計篩選并刪除重復或無靶點的補腎定眩湯6 味中藥所含組分，最終得到23 個活性成分，其中天麻4個，附子4 個，黨參5 個，白芍3 個，白術3 個，茯苓4 個，見表1。

表1 補腎定眩湯活性化合物信息

2.2 化合物調控靶點 通過對補腎定眩湯所含23 個化合物的調控靶點進行統計篩選，共獲得天麻調控靶點17 個，附子調控靶點28 個，黨參調控靶點71 個，白芍調控靶點61 個，白術調控靶點35 個，茯苓調控靶點44 個。

2.3 補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點基于OMIM 數據庫、TTD 數據庫及DisGeNET 數據庫并結合文獻報道篩選高血壓疾病靶點444個；與補腎定眩湯對應的化合物-靶點進行比對，篩選出15 個補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點，見表2。

表2 補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點

2.4 核心靶點PPI 網絡 將補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點導入STRING 平臺構建PPI 網絡，結果顯示核心靶點PPI 網絡共包含15個節點、65 條邊，平均度值為8.67，其中節點代表靶點蛋白，邊代表各個蛋白之間的互作關系，節點連接邊數表明靶點蛋白在PPI 網絡互作關系中的關鍵程度。

2.5 GO/KEGG 調控通路富集分析 補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點GO/KEGG 功能富集分析表明，補腎定眩湯可通過調節血管收縮及舒張的生物過程、腎素-血管緊張素生物過程、松弛素信號通路、HIF-1 信號通路(HIF-1 signaling pathway)、轉化生長因子-β 信號通路(TGF-β signaling pathway)等途徑改善高血壓，見圖1～2。

圖1 核心靶點GO 功能富集分析

圖2 潛在核心靶點KEGG 信號通路富集分析

2.6 補腎定眩湯對大鼠血壓的影響 與NC 組比較，Model 組大鼠SBP、DBP、MAP 均顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.01)；與Model 組比較，補腎定眩湯各劑量干預組SBP、DBP、MAP 均下降，差異具有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)；其中高劑量組血壓下降程度優于低、中劑量組(P＜0.01)，見圖3。

圖3 補腎定眩湯對大鼠血壓的影響

2.7 補腎定眩湯對大鼠HIF-1/TGF-β 信號通路的影響

2.7.1 補腎定眩湯對HIF-1α 蛋白表達水平的影響 與NC 組比較，Model 組大鼠HIF-1α 蛋白相對表達量顯著上調，差異具有統計學意義(P＜0.01)；與Model 組比較，補腎定眩湯低劑量干預后，HIF-1α 蛋白相對表達量無差異，中、高劑量干預后，HIF-1α 蛋白相對表達量均下降，差異具有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)；其中高劑量組下降程度優于中劑量組(P＜0.01)，見圖4。

圖4 補腎定眩湯對大鼠HIF-1α 蛋白表達的影響

2.7.2 補腎定眩湯對TGF-β 表達水平的影響與NC 組比較，Model 組大鼠TGF-β 表達水平顯著上調，差異具有統計學意義(P＜0.01)；與Model 組比較，補腎定眩湯低劑量干預對TGF-β表達量無影響；中、高劑量干預后，TGF-β 表達水平顯著下降，差異具有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)；其中高劑量組改善程度優于中劑量組(P＜0.05)，見圖5。

圖5 補腎定眩湯對大鼠TGF-β 表達水平的影響

3 討論

高血壓發病涉及神經遞質異常、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活及大小動脈結構功能失衡等機制，中醫學常將其歸屬于“眩暈”“頭痛”等范疇，認為本病的病機為本虛標實，肝陽上亢為標，腎陽虧虛為本[6-8]。中藥多組分、多靶點、多機制的作用特點與網絡藥理學復雜網絡關系特點吻合，可系統揭示中藥調控疾病的物質基礎及作用途徑[9-11]。補腎定眩湯由天麻、附子、白芍、黨參、白術、茯苓組成。網絡藥理學分析結果表明，補腎定眩湯含有23 個活性成分，改善高血壓病的潛在核心靶點15 個，包括ECE1、AGT、BMPR2、HIF1A、ACE2、TGFB1 等；可通過調節血管收縮及舒張的生物過程、腎素-血管緊張素生物過程、松弛素信號通路、HIF-1信號通路、轉化生長因子-β 信號通路等途徑改善高血壓。進一步通過補腎定眩湯干預SHR 大鼠模型的實驗結果表明，補腎定眩湯可顯著降低大鼠收縮壓、舒張壓及平均動脈壓，顯著抑制HIF-1/TGF-β 信號通路激活。

基于網絡藥理學對補腎定眩湯治療高血壓病作用機制研究提示，松弛素作為來源于妊娠黃體的多肽類激素，其心腦血管保護作用主要包括保護內皮、抗纖維化、抗炎癥、抗氧化、舒張血管、抑制內皮細胞向間質轉化等[12-13]，可顯著降低自發性高血壓大鼠的血壓，減低鹽誘導高血壓大鼠的收縮壓[14]。RAAS 調控機制是關鍵的神經內分泌調節機制之一，高血壓及其心血管靶細胞損傷均與該系統失調有關[15-18]。HIF-1 的穩定表達是維持心血管細胞對缺氧反應的關鍵條件，其調控作用涉及紅細胞生成、葡萄糖轉運、血管生成、糖酵解代謝、活性氧處理和細胞增殖等[19]。HIF-1α 表達量顯著增加，導致其與調節血液濃度和血管內皮相關的基因異常表達，促進高血壓病的發生，并且腎臟髓質HIF-1表達異常，可通過調節水鹽電解質平衡參與血壓調節[20]。HIF-1 直接激活血管緊張素Ⅱ受體，調節血管緊張素Ⅱ的活性，參與血壓調節[21]。TGF-β 介導的信號通路參與多種生理病理調節過程，研究發現通過調節TGF-β/Smads 信號通路從而抵抗高血壓大鼠心肌纖維化過程[22]，對高血壓及相關的心肌損傷具有顯著的改善作用。內皮功能障礙是高血壓發生發展過程中的重要因素，其中內皮炎癥反應為重要特征之一[23]，TNF-α 作為主要的促炎因子參與多種疾病引起的血管內皮細胞功能障礙和損傷，TNF-α 可抑制eNOS 轉錄增加氧自由基表達，與高血壓引起的血管內皮細胞功能障礙密切相關[24]。在高血壓早期，機體啟動炎癥狀態，于血管壁釋放大量炎性因子，進而導致血管平滑肌增生，最終發展為動脈粥樣硬化[25]。VEGF 在血管生成、血管緊張度及內皮增殖遷移等方面均有重要作用，對于高血壓治療及相關靶器官損害的預防都具有重要意義[26]。NO 減少可導致血管收縮和外周阻力增加，同時可引起水鈉潴留，進而導致血壓升高；另外，ET-1 增加，NO 減少會進一步引發氧化應激反應，導致血管氧化細胞損傷而升高血壓，VEGF 促進NO 生成，減緩血容量擴張，從而保護血管損害，降低血管緊張度，改善高血壓及靶器官損害[27-28]。

本研究基于網絡藥理學方法，系統分析了補腎定眩湯“多組分-多靶點-多機制”治療高血壓的靶點及作用機制，并基于自發性高血壓大鼠模型驗證了治療效果，為其進一步臨床應用提供了科學依據。網絡藥理學作為基于數據庫的虛擬研究模式，并不能確切地揭示藥物在生物體內的調控作用及途經，因此尚需進一步明確有效成分及靶點的分子作用機制。