靈芝孢子油體內外抗氧化作用研究

向世東,張廣磊,周功強,黃文康,陳 浩,俞 浩*

1.安徽科技學院食品工程學院,安徽鳳陽,233100;2.固鎮金葉養殖家庭農場,安徽固鎮,233700;3.亳州學院中藥學院,安徽亳州,236800

靈芝(Ganodermalucidum)為多孔菌科植物赤芝或紫芝的干燥子實體,既可用于藥用,亦可用于食用,古有“仙草”之稱,是一種傳統的補品[1]。據《神農本草經》記載,靈芝有“強筋骨、抗衰老、補中益肝腎”之功效。靈芝栽培廣泛,主要分布于亞洲東部地區,在我國主要分布于長江以南高溫多雨地區。

靈芝孢子油(GanodermalucidumSpore oil,簡稱GLSO)主要提取自靈芝孢子,屬于一種油狀物質,其主要生理活性包括抗腫瘤、增強免疫力、保護肝臟、抗氧化和延緩衰老等,作為保健食品日益受到人們的重視,具有較好的開發利用前景[2-3]。GLSO主要活性成分為不飽和脂肪酸、甘油酯、萜類、甾體類、維生素等,是GLSO發揮生理功效的物質基礎[4-6]。Zhang等[7]采用果蠅模型評價靈芝孢子油的生物學效應,發現在正常條件和氧化應激下均可延長果蠅平均壽命,并顯著提高其抗氧化酶活性。胡瞬等[8]也證實在D-半乳糖衰老小鼠模型上,GLSO能夠有效地增加小鼠血清中SOD和CAT活性。上述試驗表明,GLSO可以起到抗氧化和延緩衰老的作用。然而,其有效成分GLSO抗氧化能力具體作用機制研究鮮有報道。因此,試驗通過體內外兩個水平探討GLSO的抗氧化作用及其具體作用機制,為GLSO的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SPF級昆明種小鼠60只,雌性,4～6周齡,體重(20±2)g,購自江蘇華創信諾醫藥科技有限公司,動物質量合格證編號:NO2023042002,動物生產許可證號:SCK(蘇)2020-0009。

1.2 藥材與試劑

靈芝孢子油,黃山云樂靈芝有限公司;維E軟膠囊,浙江醫藥股份有限公司;維生素C,天津大茂化學試劑廠;DPPH、ABTS,美國sigma公司;NBT、PMS、NADH、D-半乳糖,上海麥克林生化科技有限公司;SOD、MDA、CAT、總蛋白(TP)試劑盒,南京建成生物工程研究所;PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗體,美國CST公司;HPR標記的IgG二抗,英國Abcam公司;β-actin、BCA試劑盒、ECL發光試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 儀器與設備

ME55型分析天平(成都一科儀器設備有限公司);XMTD-7000型恒溫水浴鍋(上?？坪銓崢I發展有限公司);UV-1900i型紫外分光光度計(島津企業管理中國有限公司);MS3型旋轉混勻器(德國IKA公司);TGL-20M型臺式高速離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司);JXCL-6K型冷凍研磨儀(上海凈信實業發展有限公司);DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠);ZD-9556型水平搖床(太倉市科教儀器廠);SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器(上海汗諾儀器有限公司);Spectra Max iD3型酶標儀(美谷分子儀器有限公司)。

1.4 方 法

1.4.1 GLSO體外抗氧化作用研究

DPPH清除測試:將配制好的各濃度溶液取2.0 mL,添加DPPH(0.2 mmol/L)溶液2.0 mL,黑暗處靜置30 min,517 nm處測定吸光值[9],按式(1)計算:

DPPH清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100

(1)

其中,A1、A2、A0分別表示樣品、對照、空白溶液的吸光值。

ABTS清除測試:參考文獻[10]配制ABTS工作液,將配制好的各種濃度溶液取0.1 mL,添加ABTS溶液3.9 mL,黑暗處靜置5 min,734 nm處測定吸光值,按式(2)計算:

ABTS清除率/%=[1-A1/A0]×100

(2)

其中,A1、A0分別表示樣品、空白溶液的吸光值。

(3)

其中,A1、A2、A0分別表示樣品、背景、空白溶液的吸光值。

1.4.2 動物分組及給藥

參考文獻方法[12-13],將60只小鼠適應性飼養1周,按體重隨機分為正常組(Normal組),模型組(D-gal組),維E組(VE組),靈芝孢子油低(GLSOL)、中(GLSOM)、高(GLSOH)劑量組,每組10只。除Normal組外,其余組腹腔部位注射D-半乳糖120 mg/kg(0.1 mL/10g體重)以構建小鼠衰老模型;Normal組注射等體積生理鹽水,Normal組和D-gal組灌胃相同量植物油作對照。VE組灌胃100 mg/kg的VE;GLSO組分別灌胃200、400、800 mg/kg的GLSO(0.1 mL/10g體重)。各給藥組在灌胃前均采用植物油配制相應的濃度,1次/d,持續7周。每周稱量小鼠體重1次以調整灌胃、注射劑量。

1.4.3 血清及肝組織SOD、CAT、MDA含量測定

試驗第7周末,小鼠禁食12 h,采集血液并制備肝組織勻漿,按試劑盒說明書測定各指標含量[14]。

1.4.4 Western blot檢測衰老小鼠肝組織蛋白表達

取小鼠肝組織剪碎加到液態氮中研磨,再放入離心管中充分裂解,進行離心處理。通過BCA法定量并提取總蛋白,進行凝膠電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。將一抗按1∶1 000的比例進行稀釋并孵育過夜,然后進行每次3 min的TBST洗膜5次。添加HRP標記的二抗(1∶5 000),室溫下孵育2 h,TBST重復洗膜5次,ECL發光試劑盒顯色。以β-actin作參照物,運用圖像處理軟件對目標蛋白的相對表達量進行分析。

1.5 數據處理

2 結 果

2.1 DPPH清除率

如圖1所示,在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內,GLSO對DPPH的清除效果逐漸提高。濃度為1.0 mg/mL時,GLSO和VC都表現出最大清除效果,清除率分別為(81.75±1.26)%和(97.26±1.05)%。此時,GLSO的清除能力相當于VC的84.05%,表明GLSO對DPPH具有較強的清除能力。

圖1 DPPH清除率

2.2 ABTS清除率

如圖2所示,在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內,GLSO對ABTS清除效果不明顯。濃度為1.0 mg/mL時,對ABTS清除能力達到飽和狀態,清除能力最高可達(21.45±1.2)%,此時,GLSO的清除能力相當于VC的22.05%,表明GLSO對ABTS具有一定的清除能力。

圖2 ABTS清除率

圖3 ·O-2清除率

2.4 對衰老小鼠血清生化指標的影響

與Normal組相比,D-gal組小鼠血清SOD和CAT值顯著降低(P<0.01),MDA顯著升高(P<0.01);與D-gal組相比,GLSOM、GLSOH組小鼠血清SOD和CAT值顯著升高(P<0.05,P<0.01),GLSOM、GLSOH組較D-gal組MDA顯著降低(P<0.05,P<0.01),見表1。

表1 小鼠血清生化指標檢測結果

2.5 對衰老小鼠肝組織生化指標的影響

與Normal組相比,D-gal組小鼠肝組織SOD和CAT值顯著降低(P<0.01),MDA顯著升高(P<0.01);與D-gal組相比,GLSOM、GLSOH組小鼠肝組織CAT值顯著升高(P<0.05,P<0.01),GLSOH組較D-gal組SOD值顯著升高(P<0.01),GLSOM、GLSOH組較D-gal組MDA顯著降低(P<0.05),見表2。

表2 小鼠肝組織生化指標檢測結果

2.6 對衰老小鼠肝組織PI3K/AKT通路的影響

與Normal組相比,D-gal組小鼠肝組織p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K比值顯著降低(P<0.01);GLSOM、GLSOH組較D-gal組小鼠肝組織p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K比值顯著升高(P<0.05,P<0.01),見表3。

表3 小鼠肝組織PI3K/AKT通路蛋白檢測結果

3 討 論

PI3K/AKT通路是一種重要的細胞信號傳導通路,參與調控多種病理生理過程。該通路在細胞增殖、存活、分化以及代謝調控方面發揮關鍵作用[21]。在多種器官和組織中,PI3K/AKT通路顯示出顯著的抗氧化功能,對細胞的氧化應激具有重要的保護作用[22]。Sha等[23]以麥芽酚為研究對象,對D-半乳糖衰老小鼠模型研究結果表明激活PI3K/AKT通路可以改善氧化應激損傷。有研究認為隨著年齡的增長MDA水平升高,SOD、CAT抗氧化酶活性降低,繼而導致活性氧(ROS)增加,引發氧化應激反應,ROS的過量產生可以反向調節PI3K/AKT通路[24-25]。試驗結果顯示,與模型組相比,GLSO各劑量組能夠不同程度提高p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K比值,表明GLSO可能通過激活PI3K/AKT通路調節細胞增殖,抵抗肝臟細胞氧化應激反應。

綜上所述,GLSO能夠清除自由基提高機體抗氧化能力,對衰老小鼠有保護作用,其作用機制可能通過調控PI3K/AKT通路實現的,但試驗關于其上下游蛋白調控機理,有待進一步研究。