轉錄因子Ascl1誘導體細胞重編程為神經元的研究進展*

張瑩丹, 陳 莉

廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科,南寧 530021

細胞重編程是指分化的細胞在特定條件下被重新編程恢復到全能狀態,或者轉分化成另一種細胞類型的過程[1]。導入外源性特定神經元決定基因(neuronal determination genes)到非神經元細胞中表達(即異位表達),可將非神經元細胞直接重編程為具有功能的誘導神經元(induced neurons,iNs),從而改善神經功能,為神經系統疾病提供了新的治療策略[2-4]。其中,神經母細胞特異性轉移因子——Achaete-scute家族bHLH轉錄因子1(achaete scute homolog-1,Ascl1)及其相關的重編程機制在指導終末分化的非神經元細胞重編程為誘導神經元的研究中取得突破。本文將主要圍繞Ascl1重編程神經元這一主要科學問題,就Ascl1對不同非神經元細胞的重編程及其機制進行闡述。

1 Ascl1重編程非神經元細胞為神經元的可行性

1958年,Gurdon等[5]將非洲爪蟾胚胎晚期的細胞核移植到卵細胞中,使移植后的卵細胞獲得了細胞全能性,表明終末分化細胞的基因狀態不是靜止的,推翻了細胞分化是不可逆過程的理論,為細胞重編程研究的發展打下基礎。特定因子的異位表達如骨骼肌調節的關鍵轉錄因子MyoD可將成纖維細胞(fibroblast,Fb)重編程為成熟的肌細胞[6],這表明可能存在著特定譜系調節因子影響細胞發育和分化。

Ascl1是堿性螺旋-環-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)轉錄因子家族中的一員,該家族在神經源性命運決定(neurogenic fate determination)中起著重要作用[7]。Ascl1基因位于12號染色體長臂22區至23區上,其蛋白主要由兩組極性氨基酸殘基和位于第118～170號氨基酸序列組成的典型的堿性螺旋-環-螺旋結構域構成,可以與目的基因啟動子的E-box模塊結合,促進神經相關基因的轉錄活性,主要在發育中的神經系統中表達[8];Ascl1在神經發育過程中有助于γ-氨基丁酸能中間神經元的產生,參與了前腦發育過程中神經決定(neural determination)和神經元表型的確定,也在泛神經發生(panneurogenic)和神經元亞型決定中起著重要作用[9-10],并且對小腦、脊髓及視網膜等特定的細胞亞型也有著多重貢獻[11]。此外,Ascl1在中樞神經系統的異位表達可以改變神經祖細胞的分化方向,從而調控細胞命運[9]。

Heins等[12]發現神經源性的決定因子Pax6可以指導體外星形膠質細胞(astrocyte,AST)轉分化為具有一定功能的神經元,進一步驗證了特定因子的表達可以增強細胞的神經元譜系特性,甚至指導非神經元細胞的神經發生,表明通過調控特定轉錄因子的表達可改變終末分化細胞的命運,并將其重編程為神經元細胞。隨后,許多研究也證實了成纖維細胞、星形膠質細胞或其他細胞能夠響應Ascl1的異位表達重編程為誘導神經元(induced neurons,iNs),并且能夠在神經網絡中發揮功能,促進了相關神經功能的恢復[13]。

2 Ascl1誘導成纖維細胞向神經元的轉分化

成纖維細胞起源于胚胎中胚層的間充質,增殖能力強且代謝旺盛,在體內分布廣、數量多,并且具有多向分化能力,尤其是分化為成骨和成軟骨細胞、去分化為多能干細胞甚至轉分化為神經元細胞[14-17]。目前已有多項研究利用Ascl1或多因子組合將成纖維細胞直接重編程為具有功能的誘導神經元。

2.1 Ascl1誘導成纖維細胞向多巴胺能神經元的轉分化

2010年,Vierbuchen等[18]篩選了在神經發育中發揮重要作用的轉錄因子Ascl1、Brn2和Myt1,并以慢病毒為載體過表達于小鼠成纖維細胞中,發現單獨表達Ascl1能夠在體外誘導成纖維細胞為具有未成熟電生理特性的iNs,而共表達Ascl1、Brn2和Myt1(ABM)三因子時,iNs表現出與內源性成熟神經元相似的膜電生理特性,并且這些iNs大多數為興奮性神經元。Pfisterer等[19]在ABM三因子組合的基礎上共轉染指導多巴胺能神經元命運決定轉錄因子Lmx1a和FoxA2,觀察到成纖維細胞在體外誘導為功能性多巴胺能神經元(induced dopaminergic neurons,iDANs),實現將成纖維細胞向特定神經元亞型的成功轉化。非人類靈長類狨猴成纖維細胞在Ascl1結合microRNA-9/9*和microRNA-124誘導下也轉分化為具有自發神經元活動的神經元[20]。

以上研究僅證明了過表達Ascl1可將體外培養的成纖維細胞重編程為iNs。Caiazzo等[21]將Ascl1、Nurr1和LMX1a因子共表達于小鼠、健康成人及帕金森患者供體來源的成纖維細胞,獲得了功能性iDANs,并成功移植到新生小鼠腦室中,對重編程技術在由體外到體內移植的應用進行了研究,觀察到iNs能夠整合到宿主神經網絡中獲得完整的神經元多巴胺能細胞命運,并長期保持電生理活動。進一步研究發現,將Ascl1、Ngn2、Sox2、Nurr1和Pitx3多因子轉化的iDANs移植到帕金森大鼠疾病模型上后,iDANs能夠在體發揮多巴胺能神經元的功能,緩解帕金森大鼠的相關運動癥狀[22],實現了重編程iDANs由轉變形態到發揮功能的應用。這一發現為未來帕金森疾病的治療提供了一個潛在有效的治療策略。

2.2 Ascl1誘導成纖維細胞向氨基酸類神經元的轉分化

除了多巴胺能神經元外,Ascl1也能將成纖維細胞重編程為氨基酸類神經元。Ascl1與Foxg1、Sox2、Dlx5和Lhx6多因子共同重編程成纖維細胞的功能性γ-氨基丁酸能神經元,能夠整合到宿主神經元網絡中抑制宿主海馬體的興奮性神經元[23],這一研究為治療癲癇或平衡其他神經系統疾病相關的神經元回路中抑制/興奮信號傳導提供了新的治療策略。

此外,Ascl1、Brn2、Myt1三因子(ABM)與其他因子共轉染誘導人成纖維細胞為具有電生理特性的前腦谷氨酸能神經元,這些iNs移植到哺乳動物腦室能夠與中樞神經系統宿主神經元建立突觸連接[24]。另一項研究通過將ABM因子與bHLH家族的NeuroD1在胎兒和人出生后成纖維細胞中共表達,獲得的谷氨酸能神經元,能夠形成功能性突觸整合到體外小鼠皮層神經元共培養神經網絡中,但是在體內的研究未能進一步完善深入[25]。在此之前,科學家們應用的重編程策略多為ABM三因子或在ABM因子的條件下添加其他因子誘導成熟神經元的產生,但在沒有其他因子輔助的情況下,Chanda等[26]也證實了單因子Ascl1也足以誘導體外培養的成纖維細胞為成熟谷氨酸能神經元。

2.3 Ascl1誘導成纖維細胞向5-羥色氨酸能神經元的轉分化

FEV、Lmx1b和FoxA2是5-羥色胺能神經元終末分化的關鍵轉錄因子,Xu等[27]將其同Ascl1轉染于人成纖維細胞中,發現細胞檢測到5-HT、AADC等神經元標志物的表達,表現出自發動作電位和自發興奮性突觸后電流,表明經誘導細胞轉分化為5-羥色胺能神經元(Induced serotonergic neurons,iSNs)。這項研究與之前誘導成纖維細胞向神經元的轉分化研究一致,即在沒有Ascl1表達的條件下,神經元的產生效率明顯受到影響。同年,Vadodaria等[28]發現在人成纖維細胞中過表達5-羥色胺能神經元中高表達的轉錄因子NKX2.2、FEV、GATA2和LMX1B與神經元轉錄因子Ascl1、NGN2,能高效轉化為5-羥色胺能神經元。

除此之外,通過Ascl與其他因子共同作用于成纖維細胞重編程可誘導出視網膜神經節細胞、去甲腎上腺素能神經元等[29-31]。

2.4 Ascl1誘導成纖維細胞向神經元轉分化的相關機制

ABM因子重編程成纖維細胞向神經元轉分化過程中存在著分級機制,即Ascl1結合成纖維細胞中許多同神經祖細胞相似的神經元靶基因位點,并打開封閉的染色質、快速誘導染色質重塑和核小體定相,在重編程早期具有主導靶向能力,發揮著“先驅轉錄因子”的作用[32-33]。進一步單細胞測序分析提示,外源性Ascl1的過表達導致成纖維細胞相關基因的沉默和增強子的失活、神經元靶基因的上調以及細胞周期基因的下調,并參與神經元形態學定義基因的表達,從而誘導細胞退出細胞周期,進入神經元發育的起始階段,與此同時Ascl1重編程細胞過程中伴隨不同啟動子的高甲基化的發生,如單獨誘導非CG甲基化的獨特神經元特征,而其他輔助轉錄因子如Brn2和Myt1等則針對競爭性成肌細胞程序,在從頭甲基化中抑制供體成纖維細胞轉化過程中的成肌細胞程序,從而指導更準確的神經細胞轉化程序,為神經元轉分化后期的成熟發育創造了有利條件[34-36]。

3 Ascl1誘導星形膠質細胞向神經元的轉分化

星形膠質細胞是成年中樞神經系統中分布最為廣泛的細胞,約占中樞神經系統細胞的20%～40%[37]。在成人大腦中,成熟的星形膠質細胞一般處于靜止狀態,當大腦處于損傷或應激狀態下,星形膠質細胞則反應性增生肥大,表達膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)、巢蛋白(nestin)等神經前體細胞蛋白,此時星形膠質細胞具有多能神經干細胞的潛能[38],是神經元重編程中最理想的細胞來源類型。

3.1 Ascl1誘導星形膠質細胞向神經元的轉分化

Berninger等[39]利用Ascl1和Neurogenin2共同誘導出生后早期小鼠大腦皮質星形膠質細胞轉化獲得iNs,這些iNs存在動作電位,但未建立功能性突觸輸出,也未確定具體亞型。Liu等[40]證實僅Ascl1的表達足以誘導體外培養的出生后及成年小鼠的中腦背側星形膠質細胞轉分化為功能性神經元;該研究進一步實驗表明,使用GFAP啟動子的腺相關病毒作為載體感染體內中腦背側星形膠質細胞表達Ascl1,能夠有效將中腦背側星形膠質細胞轉化為功能性GABA能及谷氨酸能神經元。在DLX2協同Ascl1的作用下,體外皮層星形膠質細胞可定向誘導出功能性GABA能神經元并建立功能性突觸輸出[41],而移植到內側顳葉癲癇伴海馬硬化癥模型小鼠海馬體中的皮質星形膠質細胞可重新編程以產生GABA能iNs,并與顆粒細胞建立GABA能突觸整合到癲癇網絡中,以減少自發性復發性海馬癲癇發作[42]。

除氨基酸類神經元外,Ascl1同NeuroD1、LMX1A、MiR218體外實驗將人星形膠質細胞重編程為多巴胺能神經元,體內實驗將帕金森成年小鼠紋狀體星形膠質細胞重編程為多巴胺能神經元,并實現對帕金森模型小鼠部分運動障礙癥狀一定程度上的改善[3,43]。

在Ascl1誘導下,星形膠質細胞可向不同的神經元亞型轉分化,這可能是由于星形膠質細胞內Notch1信號通路的水平導致了星形膠質細胞對神經元重編程的敏感性不同[44],而不同的轉錄因子輔助以及星形膠質細胞起源影響著重編程的方向[45],這對深入研究誘導星形膠質細胞定向重編程為特定亞型神經元提供了新的切入點,為治療人類神經疾病補充各種神經元亞型的細胞來源提供了新的可能。

3.2 Ascl1介導星形膠質細胞轉化為神經元的相關機制

Ascl1在重編程星形膠質細胞向神經元的轉化過程中早期誘導了神經源性程序——上調參與神經系統發育和神經發生調節的Insm1、Sox11、Sox4、Dll1等以及下調星形膠質細胞中Aqp4、Slc1a3、Fgfr3和膠質祖細胞中的Pax6、Fabp7、Vimentin等典型基因的表達,提高Rcor2、Ncor2、Cbfa2t3等轉錄因子的轉錄活性[46],并結合了多個靶標基因如KLF10、MyT1、MyT1L等進行調控iNs細胞軸突形成及電生理成熟[47]。同時,Ascl1絲氨酸磷酸化受體位點突變增強成人皮質星形膠質細胞的神經元轉化[48];神經元富含的線粒體抗氧化蛋白如SOD1和PRDX2,通過對抗異常的活性氧來增加更多的細胞進入神經元轉化過程[49];作為抑制因子,NOTCH1信號傳導介導Ascl1驅動的星形膠質細胞到神經元的轉化[50]。

4 Ascl1誘導Müller膠質細胞向神經元的轉分化及機制

Müller膠質細胞具有干細胞潛能,是視網膜再生的可靠來源[51]。Müller膠質細胞中Ascl1或協同Atoh1、Pou4f2,Islet1表達,可轉化為視網膜神經元,與宿主視網膜神經元建立突觸連接,并對光做出反應,有效刺激視網膜再生[52-53]。

Ascl1在重編程Müller膠質細胞的過程中,可與神經系統發育相關基因如Tubb3、NeuroD4等結合調控神經發生[54],同時受到STAT信號途徑的調控影響,STAT信號途徑激活或與Ascl1結合誘導分化基因抑制劑(inhibitor of differentiation,Id)表達,從而抑制Ascl1在Müller膠質細胞亞群中啟動神經發生;此外,STAT途徑的抑制導致Ascl1與非STAT靶標的結合增加,導致神經元基因的富集,實現Ascl1在神經發生所需的基因上更有效的結合,促進重編程的發生[55]。

5 Ascl1誘導其他非神經元細胞向神經元的轉分化

在轉錄因子Ascl1重編程策略下,其他非神經元細胞的研究也取得了一定進展。在成年鼠損傷大腦皮層NG2膠質細胞中過表達Ascl1和Sox2可誘導皮層的功能性iNs發生[56],體內海馬原位神經膠質細胞中Ascl1和Dlx2可誘導GABA能iNs,減少內側顳葉癲癇伴海馬硬化癥小鼠癲癇發作[36],Ascl1協同其他因子將成年人腦周細胞、多能干細胞成功重編程為功能性iNs[57-59],更有Ascl1對腫瘤細胞進行重編程的成功驗證[60-61]。

6 總結和展望

近年來在直接神經元重編程領域取得了長足的進步,尤其是Ascl1相關的重編程方案正日趨成熟。利用Ascl1將非神經元細胞直接重編程為神經元細胞以代替特異性神經元發揮功能,這對于更深入地研究神經系統細胞的同一性和可塑性具有重大價值,同時為治療人腦神經系統疾病細胞代替治療、藥物發現和再生醫學研究開辟了一條全新的道路。體內外的重編程已使得模型動物的神經功能和相應運動癥狀得到顯著改善,但迄今為止僅僅局限于對局部神經元、局部神經網絡和相關運動障礙癥狀的觀察。使用重編程的神經元替換退化或損傷的神經元,重編程后的神經元產量如何維持穩定、身份特性是否能維持長期穩定,其新形成的神經網絡是否存在異常連接,正常的神經通路是否受損以及如何整合到神經網絡中發揮功能仍未得到解答。此外,將非神經元細胞如膠質細胞在體重編程為誘導神經元,其局部非神經元細胞的數量和功能如何維系,也應得到重視。神經系統的重編程更深入的機制仍不十分明朗,這將不利于將細胞重編程技術應用于未來神經系統疾病的治療中。因此,要將這項前沿技術運用到實際臨床中,仍需對神經元細胞直接重編程的細胞網絡連接以及重編程中的分子機制和細胞微環境進一步探索。