石蒜年生長周期內NSC及其代謝酶活性變化

魏緒英,張 瑤,馬美霞,姜雪茹,陳慧婷,吳 靖,楊 玉,蔡軍火*

(1.江西財經大學藝術學院,江西 南昌 330032;2.江西農業大學園林與藝術學院,江西 南昌 330045)

石蒜(Lycorisspp.)為石蒜科石蒜屬植物,又名紅花石蒜,于秋季花后萌葉,且花葉不同時,又被稱為“魔術花”。其夏眠習性[1]與原產地(華東地區)的夏季濕潤氣候不相協調[2],科學研究價值特殊。因花期至今難以有效調控,在世界切花產業中的份額不大[3]。目前,對該屬植物的生長發育研究多聚焦于環境因子影響、花芽分化、開花生理、花期調控等方面[4],但較少從非結構性碳水化合物(NSC)含量變化及代謝的視角開展研究。

NSC作為主要的能量儲存形式,參與了植物眾多的重要生命代謝過程。植物的生理休眠和解除與碳水化合物的積累、轉化、代謝關系甚密[5-6]。NSC主要包括淀粉和可溶性糖(如蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、棉籽糖等)[7-10],是植物生長代謝的重要能量供應物質[11],能夠反映植物的碳代謝狀況及抗逆性[12]。石蒜屬植物鱗莖中淀粉含量約占40%[13]。淀粉作為存貯物質,主要供應將來的生長發育需求[14],其合成伴隨著生長過程[15]?？扇苄蕴鞘侵参镏饕墓夂袭a物、糖的代謝與運轉形式[16-17],在滲透調節中起關鍵作用[18-19]。同時又作為信號分子影響植物的生長發育以及脅迫響應[20]。蔗糖是可溶性糖的主要運輸形式和淀粉合成底物[21-22]。光合作用產生的蔗糖,通過韌皮部轉運至“庫”組織后被水解產生果糖和葡萄糖。因而,植物體內的果糖和蔗糖含量對環境溫度的變化較為敏感[23]。

不同物種間的糖積累機制及其代謝酶調控作用差異較大。目前,國內外對球根花卉的糖代謝研究主要集中在百合屬植物及與糖積累密切相關的轉化酶(InV)、蔗糖磷酸合酶(SPS)和蔗糖合成酶(SuS)上[24-25]?？扇苄缘矸酆铣擅?SSS)和結合態淀粉合成酶(GBSS)的活性是影響鱗莖養分積累的主要因子[26],冷藏可明顯增強鱗莖內α-淀粉酶(α-AL)、β-淀粉酶(β-AL)的活性[6],促使葡萄糖含量增加,蔗糖含量降低[27]。SPS一般與蔗糖磷酸酯酶以復合體形式存在,是蔗糖生物合成中的關鍵限速酶[28]。SuS主要是催化蔗糖分解生成果糖和UDPG(葡萄糖供體),因InV作用生成果糖和葡萄糖[29],能調控糖的積累和流向[29]。果糖經轉運進入細胞質后,先被果糖激酶(FRK)或己糖激酶(HXK)磷酸化才能進入到各種代謝途徑[30]。FRK對果糖的親和力遠高于HXK[31],是果糖代謝的控制閥[32]和植物源-庫代謝的關鍵激酶,在生長發育調控和逆境脅迫響應中發揮重要作用[31]。

石蒜屬(Lgcoris)植物具有獨特的生物學特性(花葉不相遇、根葉生長不同步)和夏眠習性[27],生長節律與氣候溫度密切相關[33]。因對其休眠生理及調控機制缺乏深入研究,至今難以實現切花的周年生產。因此,筆者在前期物候觀測的基礎上,重點關注了紅花石蒜年生長發育過程中,鱗莖內NSC的積累及相關代謝酶的活性變化,旨在從NSC視角探析其獨特生長節律的內在生理機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試紅花石蒜(L.radiata)種球[球徑(D)為(3.5±0.2 cm)]于2016年11月定植于江西農業大學試驗基地(28.76°E,115.83°N)。在2019—2020年的1個完整年生長周期內,分別在6個不同的生長期(Lo.展葉期;RLe.葉旺長期;LMa.葉成熟期;LWi.葉枯黃期;Dor.休眠期;Flo.開花期。見圖1),隨機挖掘相同徑級的地下鱗莖45粒(分3次重復,每次重復15粒),經去除葉片、根系,并洗凈后置于冰盒中作為樣品待測。在低溫條件下,分別取鱗莖的內層(1～4片)、中層(5～8片)、外層鱗片(9～12片),切碎混勻后用錫箔紙包裹好放入液氮中速凍20 min,再移至-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

Dor. 休眠期 dormancy period; Flo. 開花期 flowering period; Lo. 展葉期 leafing-out period; RLe. 葉旺長期 rapid leaf extension period; LMa. 葉成熟期 leaf maturity period; LWi. 葉枯黃期 leaf withering period。下同。The same below.圖1 紅花石蒜不同生長發育時期Fig. 1 Different growth periods of Lycoris radiata

1.2 測定方法

1.2.1 營養物質測定

稱取新鮮鱗莖組織0.2 g,加入1 mL提取液(蘇州科銘有限公司酶測試試劑盒,下同),進行冰浴勻漿經碾磨粉碎待用?？扇苄蕴?、葡萄糖、果糖、麥芽糖含量分別采用蒽酮比色法測定620、480、480、505、505 nm波長下的吸光值,再根據葡萄糖的標準曲線分別計算出含量。其中,淀粉用高氯酸法提取,均借鑒Buysse等[34]的測定方法。非結構性碳水化合物含量即為可溶性糖和淀粉的含量之和[35-36]。

1.2.2 酶活性測定

稱取新鮮鱗莖組織100 mg,加入1 mL提取液,進行冰浴勻漿。在4 ℃條件下10 000轉/min離心10 min,取上清液,置冰上待測。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)、結合態淀粉合成酶(GBSS)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、蔗糖合成酶(SuS)、蔗糖磷酸合酶(SPS)、α-淀粉酶(α-AL),β-淀粉酶(β-AL)、淀粉脫分支酶(DBE)、淀粉分支酶(SBE)的酶活性使用紫外分光光度計(型號UV-5200,上海元析儀器有限公司)和酶標儀(Synergy H1,BioTek intruments,美國)法檢測。粗酶液與基質液作用,其產物分別在340、340、340、480、480、540、540、540、660 nm處有最大吸收峰。將分光光度計或酶標儀預熱30 min以上,調節波長,蒸餾水調零,通過測定吸光度,計算酶的活性(按以每g組織每分鐘催化產生1 mg或1 nmol還原糖定義為1個酶活力單位)。

1.2.3 數據處理

采用 SPSS 24.0進行單因素方差分析(鄧肯氏法)。

2 結果與分析

2.1 不同生長期鱗莖內NSC變化規律

紅花石蒜鱗莖內的8種糖分(NSC總量、淀粉、可溶性糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、還原糖)的含量在不同生長期間的差異均顯著(P<0.05)。其中,在年生長周期中,鱗莖內的NSC總含量(淀粉和可溶性糖)、淀粉、蔗糖和葡萄糖含量的變化基本一致,總體呈“先升后降”趨勢(圖2a、2b、2c)。

不同小寫字母表示非結構性碳水化合物含量在不同時期0.01水平上的差異顯著。Different lowercase letters indicate significant difference in non-structure carbohydrate at 0.01 level in different periods.圖2 紅花石蒜非結構性碳水化合物動態變化Fig. 2 Dynamic content changes of non-structural carbohydrates in Lycoris radiata bulb

從圖2還可得知,鱗莖內的NSC總含量、可溶性糖、葡萄糖、果糖、還原糖均以葉成熟期(LMa)最高,而淀粉和蔗糖的含量則以葉黃枯期(LWi)最高;而麥芽糖、果糖、葡萄糖、還原糖卻均以葉黃枯期(LWi)最低。另外,鱗莖內的可溶性糖、果糖、還原糖、麥芽糖的含量變化也基本一致,總體呈“先升后降再升”趨勢。其中,可溶性糖、果糖、還原糖的含量均在葉成熟期(LMa)最高,麥芽糖則以葉旺長期最高,且均在葉黃枯期(LWi)降低后又迅速上升(圖2b、2c、2d)。由此可見,淀粉積累的峰值要滯后于可溶性糖。另外,還原性糖在可溶性糖中的占比也以展葉期最高(76.2%),而以葉黃枯期最低(37.1%)。這說明,NSC的含量變化與葉片的生長狀態密切相關。

此外,不同時期鱗莖內的果糖含量均顯著高于蔗糖(圖2b、2c),且果糖在可溶性糖中的占比較大。這說明,果糖在紅花石蒜的年生長節律變化中也扮演著重要角色。

在休眠期,紅花石蒜鱗莖內的NSC含在Dor期保持較高水平,也有側面說明了其“夏眠”僅是地上部的休眠,而地下部鱗莖的內部生理仍然“活躍”。

2.2 不同生長期鱗莖內淀粉代謝酶變化規律

紅花石蒜年生長過程中NSC代謝酶活性動態變化情況表明(圖3),不同發育階段紅花石蒜鱗莖內的9種NSC代謝相關酶活性均差異顯著(P<0.01)。其中,NSC代謝酶總活性以葉枯黃期最高[1 473.82 μg/(min·g)],而以開花期最低[1 187.29 μg/(min·g)],均顯著高于或低于其他5個時期。在同一時期,AGP酶的活性最高均顯著高于其他8種酶。

在紅花石蒜的年生長周期中,AGP、SPS活性變化均呈“先升后降”趨勢,而SSS、SuS、DBE 3種酶的活性變化則呈完全相反的趨勢。其中,SPS活性的峰值出現(葉成熟期)的早于AGP(葉枯黃期);而SSS、SuS的谷值出現時期(葉成熟期)也早于DBE(休眠期)。另外,GBSS與SBE的活性變化也基本呈相反趨勢,且除LWi期外,SSS活性總體顯著高于GBSS。這說明,在石蒜生長過程中鱗莖中的淀粉代謝是以支鏈淀粉為主。

從展葉期(Lo)至開花期(Flo),β-AL活性和α-AL的變化趨勢基本相似(峰值在Flo期,谷值在LWi期),且除LWi期外,β-AL的活性始終高于α-AL(圖3a)。結合圖2c、2d可以發現,麥芽糖的含量始終高于葡萄糖,但麥芽糖的谷值時期(LWi)正好與葡萄糖的谷值時期重疊。這說明,β-淀粉酶水解淀粉的主要產物是麥芽糖,不是葡萄糖。

除LMa階段外,SuS的活性也始終顯著高于SPS(圖3d、圖3c),這與不同時期鱗莖內的果糖含量顯著高于蔗糖相呼應(圖2b、2c)。

SBE是參與植物支鏈淀粉合成的關鍵酶。本研究表明,AGP和SBE的酶活性變化趨勢大體相反(圖3b、3d)。另外,SBE活性也始終高于DBE,且二者均在Flo期較高,但前者峰值出現在RLe期,后者的峰值則出現在Lo期(圖3d)。這說明,石蒜鱗莖內淀粉的合成是以支鏈淀粉占優勢。

2.3 鱗莖內NSC、代謝酶相關性分析

由紅花石蒜NSC含量及代謝酶活性相關性分析結果見表1。

表1 紅花石蒜NSC含量及代謝酶活性相關性分析

由表1可知,石蒜鱗莖內的淀粉含量與AGP、SPS的活性變化呈極顯著與顯著正相關,而與SSS、SBE、DBE的活性變化呈顯著負相關。另外,淀粉與蔗糖的含量變化也呈極顯著的正相關,而與麥芽糖的含量變化呈顯著負相關(R=-0.58,P<0.05)。說明AGP、SPS均參與了淀粉的合成過程,其中SPS主要通過促進蔗糖的合成而實現;而SSS、SBS、DBE主要參與淀粉的水解過程,且在一定程度上淀粉的合成速度取決于蔗糖含量的水平。

另外,麥芽糖的含量變化與果糖(R=0.84,P<0.001)、葡萄糖(R=0.49,P<0.05)含量呈極顯著與顯著正相關;果糖與葡萄糖的含量變化也呈極顯著正相關(R=0.77,P<0.001)。這說明,鱗莖內的二糖與單糖的含量變化密切相關。從表1還可得知,蔗糖與果糖、麥芽糖的含量變化及SBE、β-AL的活性均呈極顯著負相關,而與GBSS(R=0.80,P<0.001)的活性變化呈極顯著正相關。然而,GBSS又與果糖、葡萄糖、麥芽糖的含量變化也均呈極顯著負相關。這說明,紅花石蒜鱗莖內結合態淀粉的合成主要取決于蔗糖的供給水平,而其水解的強度則會顯著影響體內的果糖、麥芽糖的水平。

表1還表明,果糖與麥芽糖的含量變化呈極顯著正相關(R=0.84,P<0.001),與DBE的活性變化呈顯著正相關(R=0.48,P<0.05),而與GBSS(R=-0.87,P<0.001)、SuS活性均呈極顯著的負相關(R=-0.84,P<0.001)。

3 討 論

3.1 石蒜的年生長節律與鱗莖NSC含量及相關代謝酶的活性變化密切相關

鱗莖內NSC含量及其代謝酶活性易受外界條件、自身的生長與代謝狀況影響。石蒜的鱗莖富含淀粉和膠質[37],是養分、非結構性碳和水分的存貯庫[27]。

本研究發現,在Dor—Flo—Lo時期,鱗莖中的蔗糖、淀粉含量均出現了顯著下降,說明該過程存在大量的淀粉水解和蔗糖消耗,轉化為葡萄糖和麥芽糖。這與百合類植物在解除休眠至出苗過程中[38-39]和開花過程中[40]的淀粉含量變化類似。在Lo—RLe時期,隨著葉片的生長及其光合作用能力的增強,鱗葉中NSC各組分的含量均出現了上升,鱗莖的功能開始由“源”向“庫”轉變。這與羅琦[41]的研究結果一致。

在RLe—LMa—LWi期,葉片通過光合作用形成的碳水化合物能夠逆濃度梯度的向下運輸至鱗莖[42]。其中,RLe—LMa期間鱗葉中的NSC總量呈上升趨勢,而在LMa—LWi期間又下降,淀粉及蔗糖的總量卻一直呈上升趨勢;而在LWi—Dor期,鱗葉中的淀粉、蔗糖含量均出現顯著下降。該結果與孫紅梅等[25]、吳沙沙[43]對百合的研究結果基本一致,這可能還與石蒜的能量回收率較高有關。此外,不同時期鱗莖內的果糖含量均顯著高于蔗糖,且與麥芽糖含量呈極顯著正相關,推斷其生理作用與石蒜的獨特生物學特性有關。

綜上所述,不同的NSC組分在紅花石蒜的年生長周期中出現的峰值時期不同,總體表現于淀粉的積累峰值要滯后于可溶性糖。其中,淀粉和蔗糖的含量均以葉黃枯期(LWi)最高,可溶性糖、果糖、還原糖、葡萄糖的含量均在葉成熟期(LMa)達到最高,而麥芽糖的含量則以葉旺長期(RLe)最高。這表明,NSC含量的變化與紅花石蒜葉片生長的旺盛狀態密切相關,可以根據葉片的生長情況大體判別其“源-庫”轉化狀態。在Dor—Flo—Lo,鱗莖以發揮著“源”的作用為主(淀粉水解為葡萄糖),而在RLe—Lwi期,鱗莖主要發揮“庫”功能?？梢?伴隨鱗莖內淀粉和蔗糖含量的升高,葉片漸趨于老化和進入休眠。這也從能量消耗的角度說明了石蒜地上部“葉片休眠”,地下部卻未真正休眠。

3.2 NSC的含量變化受相關代謝酶的調控

本研究還表明,在石蒜年生長周期中,淀粉的含量變化不僅與蔗糖的含量顯著正相關,還與AGP、SPS的活性變化也呈顯著正相關,而與麥芽糖的含量、SSS、SBE、DBE的活性變化呈顯著負相關。蔗糖含量與淀粉的含量、GBSS活性呈極顯著正相關,而與β-AL、SBE活性呈極顯著負相關,且SPS與SuS呈極顯著負相關。這說明,鱗片內的淀粉積累主要受AGP、SPS(正向)和SSS、SBE、DBE(反向)的共同調控;鱗莖中的蔗糖水平主要受SPS和SuS的雙向合成調控,還要受淀粉水解(α-AL、β-AL、SBE)的綜合影響。

果糖(單糖)與麥芽糖(二糖)含量呈極顯著正相關,且二者均與DBE顯著正相關,而與GBSS、SuS呈極顯著負相關極顯著負相關。說明鱗片內的果糖積累量主要受DBE(正向)和GBSS、SuS(反向)共4種酶的雙向調控作用。

此外,GBSS與SuS的活性變化呈極顯著正相關,而與β-AL、果糖、葡萄糖、麥芽糖呈極顯著負相關,與淀粉的含量變化相關性卻不顯著。這說明,GBSS雖也參與了鱗莖內淀粉的正向調控作用,但不起主導作用。推測GBSS主要通過與SuS、β-AL配合,調節還原糖含量而起作用。

在年生長周期中,不同階段的鱗莖內9種糖代謝酶的活性均有極顯著差異(P<0.01);在同一時期,AGP酶的活性顯著高于其他8種酶,除LWi期外,β-AL的活性始終高于α-AL,SBE活性始終高于DBE,SSS和SuS的活性也總體分別高于GBSS、SPS。這與不同時期鱗莖內的果糖含量均顯著高于蔗糖相呼應,從側面證實了“石蒜鱗莖中的淀粉是以支鏈淀粉為主”的結論[13]。

3.3 果糖在紅花石蒜的生長節律中發揮著重要作用

FRK是果糖代謝的控制閥和植物源-庫代謝的關鍵激酶[32],果糖進入各種代謝途徑前,須先被FRK或HXK磷酸化[30],在生長發育調控和逆境脅迫響應中發揮重要作用[30]。果糖還可作為信號分子直接或通過與其他信號通路交叉調節基因的表達[44]。前期的研究表明,在休眠期的石蒜鱗莖盤中的果糖含量顯著高于鱗片[45],說明果糖也是鱗莖內NSC轉運的主要形式之一。本研究也發現,在年生長周期內,石蒜鱗葉的果糖含量始終顯著高于其他3種可溶性糖(蔗糖、葡萄糖、麥芽糖),且與麥芽糖含量、DBE顯著正相關,而與GBSS、SuS、蔗糖含量顯著負相關。由此推測,鱗莖內高含量果糖的來源不限于由光合器官轉運至鱗莖內的蔗糖水解,主要來源很可能是淀粉水解而產生的蔗糖。

InV和SuS對于調節“源”與“庫”關系和促進葉片制造光合產物均具有重要意義[46]。SuS活性通常與淀粉的積累或者器官的生長發育緊密相關[47]。當InV活性較高時,蔗糖積累大量減少[48]。本研究發現,果糖、葡萄糖的含量與SuS酶活性呈顯著負相關,這與果糖和葡萄糖抑制SuS的降解活性的結論基本吻合[49]。很顯然,InV在石蒜NSC代謝中也發揮著一定的作用。然而,不同形式的InV在植物不同發育階段和不同組織中的作用不同[50-52]。筆者僅重點關注了不同發育期的6種NSC組分及9種相關代謝酶的活性變化,尚未對InV、FRK、HXK等酶在鱗莖生理代謝中的作用進行研究,有待下一步深入探究。