油松抗性相關激素與代謝物對油松毛蟲取食與剪葉刺激的響應

趙亞楠,孫天驊,王利峰,許 強,劉軍俠,高寶嘉,周國娜

(河北農業大學林學院,河北 保定 071000)

植物受到脅迫后會啟動茉莉酸(jasmonic acid,JA)、水楊酸(salicylic acid,SA)和乙烯途徑參與抗性的形成[1-2],并且JA、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、SA與脫落酸(abscisic acid,ABA)等植物激素之間的相互作用在植物體中廣泛存在[3-4]?？剐孕纬蛇^程同樣是植物體平衡生長和防御的過程,如,植物響應脅迫時會在葉綠體中產生大量的活性氧,ABA則可通過調節氣孔的開閉控制光合作用,以此參與調控植物抗逆。在林木抗蟲性形成過程中,抗性緊密相關激素JA、SA與生長發育相關激素之間的相互關系仍需進一步探究。代謝物是反映植物體變化的最直接指標,不同脅迫因子誘導不同代謝物發生變化[5]。樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolia)中的酚類與萜烯類物質含量在松異舟蛾(Thaumetopoeapityocampa)刺激下發生變化[6];黏蟲(Mythimnaseparate)取食刺激誘導甘蔗(Saccharumofficinarum)中參與碳水化合物、苯丙烷類、尼古丁合成代謝途徑的物質表達上調[7]。植物激素是次生代謝物被誘導表達的信號分子[8],但激素與抗性物質相關關系的探究多通過在室內施加外源激素來進行,林木感受到刺激后內源激素的表達與抗性物質之間的相互作用及調控方式仍然比較模糊。

自然條件下的油松(P.tabuliformis)受到生物脅迫后,防御酶類、次生代謝物質、蛋白酶抑制劑的組成和含量發生明顯變化,生物堿、酚類化合物、單寧等化學物質含量增加,某些防御蛋白質的含量同樣發生變化[9-12]。但相關研究僅解決了單一的物質變化情況,缺乏對針葉樹的抗蟲性代謝通路的整體探究。隨著油松染色體基因組測序工作的完成,油松中復雜的調控元件對基因表達的作用也為針葉樹的抗蟲機制研究提供了強有力的參考[13]。為了確定針葉樹抗蟲過程中代謝物的整體變化,以自然條件下的油松和油松毛蟲(Dendrolimustabulaeformis)為研究對象,同時以剪葉處理作為機械損傷,對不同處理后油松針葉的內源植物激素JA、SA、生長素(IAA)和ABA的表達量進行測定,并且對未處理以及不同處理方式下油松針葉進行代謝組鑒定及驗證,揭示針葉樹響應昆蟲脅迫過程中類黃酮途徑變化的情況,為了解油松在生長與抗性相關激素的拮抗作用方面提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

在河北省承德市平泉市黃土梁子林場(119°13′E,41°18′N),選取海拔(560 m)、坡度(16°)以及坡向(西南)相同,樹勢及管理水平相似且無油松毛蟲蟲害的油松純林。該林場位于河北省東北部,與內蒙古、遼寧兩省/自治區毗鄰,屬中溫帶大陸性干旱季風山地氣候,年平均氣溫6.6 ℃,無霜期120～130 d,降水量540 mm左右。

1.2 試驗設置

試驗前,對5～7齡健壯油松毛蟲進行饑餓處理10 h,蟲源為河北省承德市平泉市七溝林場(118°21′E,40°55′N)。隨機選擇樹齡為10 a左右、未被植食性昆蟲取食的健壯油松共75棵,每組5棵樹作為重復,分為15組,在自然條件下對其中7組分別進行10頭油松毛蟲取食刺激(feeding stimulation,FS)處理,7組分別進行剪葉(leaf clipping control,LCC)處理,1組作為對照不進行任何處理,即處理0 h(CK,記為0 h),每種處理的7組分別為處理后的0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0與8.0 h。剪葉處理用于模擬油松毛蟲取食過程中的機械損傷及取食量,處理時自松針針尖反復剪葉多次模擬至10 頭油松毛蟲取食量。處理時選取每棵樹的“東西南北” 4個方位枝長、離地高度一致的枝條進行,取松毛蟲取食點和剪葉點以下3 cm針葉,每根枝條選取10根松針為1包,每組可從5棵樹上共獲得松針20包。對照組取完整松針10根為1包。均用錫箔紙保存,放入-80 ℃凍存。

1.3 代謝組測定

取油松針葉放置于凍干機(100F,寧波新芝生物科技有限公司)中真空冷凍干燥后利用研磨儀(MM 400,德國萊馳公司)研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末狀,稱取100 mg的粉末,溶解于1.2 mL 70% (體積分數)甲醇提取液中,每30 min渦旋1次,每次持續30 s,共渦旋6次,樣本置于4 ℃冰箱過夜。12 000 r/min離心10 min后,吸取上清液,用微孔(孔徑0.22 μm)濾膜過濾樣品,保存于進樣瓶中,用于超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)(Nexera X2,日本島津公司)和串聯質譜(Tandem mass spectrometry,MS/MS)(4500 QTRAP,美國應用生物系統公司)分析,分別對取食刺激和剪葉刺激后0、2和8 h時(記為0 h、FS 2 h、FS 8 h、LCC 2 h與LCC 8 h)油松針葉中的初生代謝物和次生代謝物進行鑒定。代謝組委托武漢邁特維爾生物科技公司進行測定。

液相條件為:色譜柱,Agilent SB-C18 1.8 μm,2.1 mm×100 mm;流動相,A相為超純水(含體積分數0.1% 的甲酸),B相為乙腈(含體積分數0.1% 的甲酸)。洗脫梯度,初始B相比例為5%(體積分數);9 min內B相比例線性增加到95%,維持1 min;10～11 min B相比例降至5%,平衡至14 min。流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量4 μL。

ESI源操作參數為:離子源,渦輪噴霧;源溫度550 ℃;離子噴霧電壓(IS)5 500 V(正離子模式)/-4 500 V(負離子模式);離子源氣體I(GSI),氣體Ⅱ(GSⅡ)和簾氣(CUR)分別設置為3.447×105、4.137×105和1.724×105Pa,碰撞誘導電離參數設置為高。在三重串聯四級桿(QQQ)和線性離子阱(LIT)模式下分別用10和100 μmol/L聚丙二醇溶液進行儀器調諧和質量校準。QQQ掃描使用質譜多反應監測(MRM)模式,并將碰撞氣體(氮氣)設置為中等。通過進一步去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)優化,完成各個MRM離子對的DP和CE。根據每個時期內洗脫的代謝物,在每個時期監測1組特定的MRM離子對。

1.4 植物激素含量測定

稱取0.6 g油松針葉,在液氮中充分研磨,加入5.4 mL pH為7.3的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS), 4 ℃ 5 000 r/min離心30 min。JA、SA、IAA、ABA的測定使用植物激素酶聯免疫分析試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。試劑盒采用雙抗體夾心法測定植物樣本中的植物激素水平。用1050酶標儀(賽默飛世爾科技公司)在波長450 nm下測定吸光值,在ELISA Calc中使用4參數Logistic模型擬合標準曲線,R2均大于0.9,表明模型擬合效果較好。

1.5 類黃酮含量測定

稱取0.6 g油松針葉,在液氮中充分研磨,加入6 mL提取液,60 ℃ 300 W超聲提取,每5 s間歇8 s,30 min后12 000 r/min常溫離心10 min,使用植物類黃酮含量檢測試劑盒(北京盒子生工科技有限公司)測定類黃酮含量。用1050酶標儀(賽默飛世爾科技公司)在波長510 nm處測定吸光值并根據標準曲線(R2> 0.99)計算植物中類黃酮含量。

1.6 數據處理

文中數據均為3次生物學重復的平均值±標準偏差。植物激素測定結果使用鄧肯新復極差法檢驗,總黃酮測定結果使用LSD法檢驗,均符合P<0.05,雙因素方差分析(Two-way ANOVA)、相關性分析(Spearman)均使用SPSS 21.0進行。

2 結果與分析

2.1 取食刺激與剪葉處理后油松代謝物的表達變化

使用超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)平臺廣泛靶向代謝技術鑒定取食刺激和剪葉刺激0、2和8 h的油松針葉中的初生代謝物和次生代謝物。試驗共檢測到999種代謝物,種類最多的前3種為黃酮類30.8%(質量分數,下同),酚酸類17.2%,脂質13.5%,其余物質的含量分別為氨基酸及其衍生物7.5%,有機酸7.0%,木脂素和香豆素5.7%,核苷酸及衍生物5.2%,萜類2.9%,鞣質1.4%,生物堿1.4%,其他物質7.3%。黃酮類物質中共監測到93種黃酮醇,90種黃酮,37種二氫黃酮,19種黃酮碳糖苷,17種黃烷醇類,15種查耳酮,15種異黃酮,13種二氫黃酮醇,7種花青素,2種雙黃酮。對所有代謝物進行主成分分析(principle component analysis,PCA),如圖1所示,其中第一主成分(PC1)解釋了原始數據33.3%的特征。

圖1 各組樣品的PCA得分圖Fig. 1 PCA of metabolites in different groups

基于正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)模型的變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)與差異倍數值(fold change,FC,式中記為FC)來進一步篩選出差異代謝物。選取log2|FC|≥1,VIP ≥ 1的物質為差異累積代謝物(different accumulated metabolites,DAMs)。經測定,0 h 和 LCC 2 h對比組中共檢測到145個DAMs,0 h 和 LCC 8 h對比組中,共有229個DAMs。由圖2分析可知,FS 2 h 的248個DAMs中有161個是由機械損傷引起的;FS 8 h的202個DAMs中有100個是由機械損傷引起的;取食刺激導致150個代謝物差異表達,其中28個DAMs的變化是由機械損傷外的其他物質或行為引起的。

圖2 各個分組中差異表達代謝物的數量Fig. 2 Number of different accumulated metabolites (DAMs) in different groups

2.2 油松差異代謝物的功能富集分析

將不同比較組中的所有DAMs匹配KEGG數據庫,從而獲得其通路信息,對注釋結果進行富集,獲得富集程度較高的通路。其中,FS 2 h 和 LCC 2 h對比組的差異代謝物主要注釋和富集的前3條通路為類黃酮生物合成(12個),氨基酸合成代謝(8個),精氨酸和脯氨酸代謝(6個);FS 8 h和LCC 8 h對比組的差異代謝物主要注釋和富集的前3條通路為類黃酮生物合成(14個),亞油酸生物合成(6個),黃酮和黃酮醇的生物合成(6個)。類黃酮生物合成為不同處理的兩個對比組中富集到DAMs最多的途徑。對不同對比組的類黃酮類物質的表達差異倍數進行分析,以確定昆蟲取食與剪葉刺激中類黃酮類物質的變化情況。如表1所示,異櫻花素[物質數字識別號碼(chemical abstracts service number,簡稱CAS號):480-43-3]與山柰酚(CAS號:520-18-3)在FS 2 h和LCC 2 h對比組與0 h和FS 2 h對比組出現表達差異;橙皮素(CAS號:520-33-2)在FS 8 h和LCC 8 h對比組與0 h和FS 8 h對比組出現表達下調和表達上調;柚皮素(CAS號:480-41-1)與球松素(CAS號:480-37-5)僅在不同處理的對比組之間具有表達差異且均表現為在LCC處理中表達下調,表明油松毛蟲取食刺激不會導致二者出現變化。同時,FS處理導致二氫楊梅素(CAS號:27200-12-0)、二氫槲皮素(CAS號:480-18-2)、圣草酚(CAS號:552-58-9)、根皮素(CAS號:60-82-2)、紫鉚素(CAS號:492-14-8)、短葉松素(CAS號:548-82-3)、柚皮素查爾酮(CAS號:73692-50-9)表達上調,而橙皮素與香橙素(CAS號:480-20-6)的表達上調出現在0 h和8 h對比組。與FS處理相比,LCC處理2 h與8 h時分別導致異櫻花素與黃顏木素(CAS號:20725-03-5)的表達上調。

表1 不同時間對比組類黃酮類物質表達差異情況

根據KEGG代謝通路還原表達具有差異的類黃酮類物質的代謝通路(圖3)。苯丙氨酸途徑的產物p-香豆酰輔酶A可以合成根皮素與紫鉚素,進而生成根皮苷和黃顏木素。柚皮素作為整個反應的中間物質不僅生成圣草酚、二氫山柰酚(香橙素)與異櫻花素,同時參與異黃酮的生物合成。圣草酚與二氫山柰酚經反應合成二氫槲皮素,與圣草酚的其他反應產物共同生成二氫楊梅素(蛇葡萄素)進入花青素的生物合成途徑,二氫山柰酚的反應產物山柰酚進入黃酮和黃酮醇的生物合成。

實線表示反應沒有中間步驟,虛線表示反應需要經過中間過程。Solid lines show the reaction with no intermediate steps and dashed lines show the reactions need the intermediate process. 圖3 具有表達差異的類黃酮類物質代謝通路Fig. 3 Metabolic pathways of flavonoids with different accumulation

2.3 油松植物激素的含量變化及相關性分析

通過標準曲線計算樣品中4種植物激素的濃度,如圖4所示。隨著時間的延長,FS處理使JA濃度先上升后下降再次上升。FS處理JA濃度最高點出現在1.5 h,為185.16 pmol/L,比LCC 1.5 h高59.8%。LCC處理的最高點出現在1 h,為157.43 pmol/L,比FS處理1 h高19.2%。除1 h與6 h外,其余時間點的JA濃度均表現為FS處理高于LCC處理。且除0和4 h外,其余時間點的兩種處理均具有顯著差異,表明與LCC處理相比,FS處理后短期(2 h)即可誘導JA的表達上調。

不同大寫字母表示相同時間不同處理間的植物激素含量差異顯著,不同小寫字母表示相同處理不同時間的植物激素含量差異顯著(P<0.05)。Different uppercase letters mean significant differences among different treat modes in the same time after different treatments at P <0.05. Different lowercase letters mean significant difference among different time after treatments under the same treat mode at P <0.05.圖4 不同時間取食刺激處理與剪葉刺激處理的油松JA(A)、SA(B)、IAA(C)、ABA(D)的含量變化Fig. 4 Concentration of JA (A), SA(B), IAA(C) and ABA(D) at different time after treatment

FS處理導致SA濃度在1 h與4 h時出現斷崖式下降,濃度分別為25.86與29.21 pmol/L,與0 h相比,分別降低70.0%與66.1%。LCC處理的SA濃度最低值僅出現在處理后4 h,最高點出現在處理后2 h,為115.22 pmol/L,FS處理導致SA濃度降低74.6%。2 h后LCC處理的SA濃度均高于FS處理,且隨時間延長呈明顯上升趨勢,但兩種處理之間除6 h外沒有顯著差異。

IAA質量濃度含量在FS處理1 h后表達顯著上調達到峰值18.53 μg/L,顯著高于LCC處理;LCC處理2 h的IAA質量濃度顯著下調,且與FS處理之間具有顯著差異;FS處理4 h與8 h時均導致IAA質量濃度高于LCC處理,表明FS處理在短期(2 h)內會引起IAA表達顯著上調,而隨著時間的延長LCC處理并不會引起IAA質量濃度出現顯著差異。

FS處理會導致ABA質量濃度在1 h中持續升高至34.68 μg/L后降低,但處理6 h和8 h時再次出現表達上調,比0 h分別增加49.8%和23.6%。LCC處理的最高值為19.36 μg/L,出現在8 h,且僅在8 h時與0 h的表達量具有顯著差異;最低值為9.40 μg/L,出現在1.5 h;雖然在處理4 h與6 h之間具有顯著差異,但是在LCC處理4 h時ABA的質量濃度高于FS處理,而LCC處理6 h的質量濃度低于FS處理。

4種植物激素的雙因素方差分析結果表明,處理方式、處理后不同時間及二者交互效應均對JA、SA、IAA與ABA產生極顯著影響(P<0.001),不同處理主效應之間的事后檢驗結果顯示, JA、IAA與ABA在FS處理與LCC處理、0 h與FS處理間差異顯著(P<0.05),0 h與LCC處理間差異不顯著;SA在0 h與FS處理間差異顯著(P<0.05),在0 h與LCC處理、FS處理與LCC處理間差異不顯著。表明單純的機械損傷不會引起JA、IAA與ABA的表達顯著差異。不同處理時間導致JA與SA之間、JA與IAA之間、IAA與ABA之間正相關關系顯著(P<0.05),相關系數分別為0.39、0.30和0.61;SA與IAA和ABA呈負相關關系。

2.4 總類黃酮含量的變化分析

為了驗證代謝組學的結果,對其中表達量差異最大的類黃酮質量濃度進行測定(圖5)。隨著時間推移,兩種處理均會導致總類黃酮質量濃度的增加。FS與LCC處理8 h總類黃酮質量濃度分別為0.24與0.12 mg/mL,與0 h時質量濃度為0.08 mg/mL相比均差異顯著,FS處理會導致表達具有顯著差異;FS處理2 h和LCC處理2 h之間差異不顯著,但FS處理8 h和LCC處理8 h之間差異顯著;FS處理2 h和FS處理8 h的質量濃度之間具有顯著差異,LCC處理則不會導致顯著差異。以不同處理與處理后不同時間作為影響因子對總類黃酮質量濃度進行雙因素方差分析,結果顯示,處理方式的主效應極顯著[F(1,10) =26.16,P<0.001];處理后不同時間主效應極顯著[F(1, 10) = 39.43,P<0.001]。經綜合,以LSD法對不同處理主效應之間進行事后檢驗,FS處理與未經處理的針葉中類黃酮的質量濃度具有顯著差異,且FS處理與LCC處理8 h時差異性同樣顯著,但未處理的針葉與LCC處理之間沒有顯著性。

不同小寫字母表示總類黃酮含量差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters mean significant differences of total flavonoid at P <0.05.圖5 不同處理下不同時間的油松總類黃酮含量Fig. 5 Concentration of total flavonoid at different time after treatment

3 討 論

類黃酮類物質通過清除自由基抗氧化參與植物對脅迫的響應[14-17]。本研究中,松融取食刺激(FS)處理與剪葉刺激(LCC)處理的對比組中均有大量的差異累積代謝物富集在類黃酮途徑。根據KEGG代謝通路,苯丙氨酸途徑中C4H將肉桂酸裂解為4-香豆酸[18],進而生成p-香豆酰輔酶A后在查爾酮合酶的催化下生成柚皮素查爾酮[19],是本研究中大多數差異表達類黃酮類物質的合成前體,但不同處理8 h不存在表達差異。然而FS處理8 h查爾酮的下游物質柚皮素顯著高于剪葉刺激,但柚皮素的下游物質在LCC處理2 h表達量上升。說明油松毛蟲取食刺激時間的延長可能削弱了柚皮素流向異櫻花素的反應,導致接下來柚皮素、圣草酚等在黃烷酮3-羥化酶(F3H)催化下形成二氫黃酮醇、二氫山柰酚、二氫槲皮素和二氫楊梅素的反應[19]。紫花苜蓿(Medicagosativa)中,石墨烯可以誘導異槲皮素和脯氨酸的上調表達參與植物對ROS的清除,保護其免受氧化損傷[20]。在處理8 h后,油松毛蟲誘導了二氫山柰酚-二氫槲皮素-槲皮素的反應,且同時根據圖3所示,山柰酚將參與黃酮和黃酮醇的生物合成。這些結果與黏蟲取食過后的甘蔗、尺蠖(Ectropisobliqua)取食后的茶樹(Camelliasinensis)中代謝物的變化保持一致[7, 21]。但除油松毛蟲取食過程中機械損傷外的哪些因素誘導植物的防御啟動仍然需要進一步探究。

植物受到脅迫的短期內生成大量茉莉酸(JA),茉莉酰異亮氨酸可以與COI1受體結合介導JAZs泛素化和降解,從而激活JA信號通路[22],調控類黃酮途徑中花青素形成的大多數步驟[23]。本研究中JA表達變化表明油松毛蟲取食刺激可能誘導了JA的表達并由其調控后續類黃酮途徑參與氧化應激,且其在取食刺激短期內含量迅速升高后恢復可能是由于其過度積累導致植物防御過度而影響其生長發育[24]。水楊酸(SA)在兩種處理之間、LCC處理與未處理組之間無顯著差異,在FS處理1 h時出現的含量驟減可能是由于JA與SA之間的相互作用導致的[25-26]。在茶樹抗蟲性形成過程中JA與SA信號相互作用并調控其他植物激素的表達[27]。雖然二者的拮抗作用明顯[27],但本研究中二者存在正相關關系,可能是在油松抗蟲性的形成過程中JA與SA更多地表現出協同效應以調控其他植物激素的信號轉導。研究表明,SA類似物可以抑制生長素(IAA)合成相關基因的表達,本研究中二者的負相關關系也可能是由于異分支酸途徑中的酶的調控。ABA可以調節植物氣孔開閉減少水分流失,參與植物非生物脅迫的響應[28-29],也可與JA共同作用調控植物對咀嚼式口器昆蟲的防御反應[30],對杉木進行機械損傷也可以觀察到內源IAA與ABA的升高[31],擬南芥中存在的可逆的氧化網絡有助于ABA的信號調控[32],而黃酮類物質受JA調控參與植物的抗氧化過程。本研究中,油松在油松毛蟲取食刺激后總類黃酮含量升高,且與同時間的ABA呈現顯著正相關關系,而JA與ABA之間無顯著相關關系,可能是在油松抗蟲性形成過程中存在JA、類黃酮與ABA的相互作用共同參與氧化應激[33]。