超聲波輔助熱水提取藍莓多糖的工藝研究

黃 浩

(遼寧鐵研種業科技有限公司,遼寧 鐵嶺 112616)

藍莓 (VacciniumSpp.),為杜鵑花科越橘屬多年生落葉或常綠灌木植物.我國于2000年開始了藍莓的商業化種植推廣,藍莓種植主要分布于貴州、遼寧、山東、吉林、四川等省.2023年我國藍莓產量達34.72萬噸,其中,鮮果上市量達25.00萬噸.藍莓中除含有大量多糖、蛋白質、維生素、食用纖維等常規營養素以外,還富含酚酸、花青素、熊果苷、紫檀芪等特殊性營養物質[1].藍莓是一種氧化性強的水果,對衰老、癌癥和心臟疾病能發揮抗氧化作用,除此之外,還具有延緩腦神經衰老、增強人體記憶力的功效.藍莓多糖是藍莓的一種重要活性成分,具有降壓、抗癌、緩解疲勞、清除自由基以及抑制腸道有害菌等功能[2-6].藍莓鮮果的貨架期不超過半個月,不利于運輸和貯存,由此限制了藍莓的推廣和食用.因此,將藍莓用于食品、保健品的加工,不僅利于解決產銷不平衡問題,還可提高藍莓附加值,促進藍莓產業發展.

多糖的提取、分離純化是活性研究的基礎,目前,提取藍莓多糖的方法有熱水浸提法、堿提取法、酶提取法、超聲波輔助法、微波輔助提取法等.國內外研究藍莓多糖提取的相對較少.熱水浸提法是提取多糖最傳統的方法,該法簡單、容易操作且成本低,但存在耗費時間長、提取率不高的缺點.李穎暢等[7]采用熱水浸提法提取藍莓葉多糖,提取率為29.2 mg/g.堿提取法適宜于提取酸性多糖,時間會縮短但容易含雜質,使多糖降解.DENG等[8]采用堿法提取貓眼藍莓多糖,提取率為36.02%;王鵬等[9]采用堿浸提法提取藍莓多糖,提取率為2.181%.酶法、超聲波法、微波提取法相較其他方法更為高效,酶法對溫度和pH 要求嚴格,且酶的價格高.孫璐等[10]、孫麗娜等[11]分別采用果膠酶和纖維素酶提取藍莓多糖,提取率分別為2.721%、2.91%.超聲提取高效但有噪聲,超聲強度過高和時間過長會導致多糖降解.崔笑傲等[12]采用超聲輔助纖維素酶提取藍莓多糖,提取率為8.13%;李敬等[13]、郭麗等[14]利用超聲輔助提取藍莓多糖,提取率達4.93%、5.83 mg/g;孟憲軍等[15]以響應面法優化設計微波輔助提取法提取藍莓多糖,提取率為3.32%.

本文前期預實驗研究了超聲輔助熱水浸提法、堿法、酶法提取藍莓多糖,發現超聲輔助熱水提取效果要優于其他方法.而且已報道的響應面優化超聲輔助提取藍莓多糖大多優化的工藝參數是酶解條件,對超聲條件的優化相對較少.因此,本文選擇市售藍莓為原材料,經速凍解凍后超聲輔助熱水提取藍莓多糖,用苯酚-硫酸法測定多糖含量,通過響應面法優化超聲工藝參數,在保障提取完全的同時,有效節約資源與成本,以期為藍莓多糖的生產和應用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓(市售);無水葡萄糖(分析純,沈陽市試劑三廠);苯酚(分析純,天津化學試劑有限公司);濃硫酸(優級純,沈陽化學試劑廠).

1.2 儀器與設備

BCD-190TMPK 冰箱(海爾智家股份有限公司),T6 新世紀紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司),2200TH 數控超聲清洗器(上海安譜實驗科技股份有限公司),SHZ-DⅢ 循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司),DZKW-12-2 電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司),FA1104 型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司),80-2 電動離心機(常州市江南實驗儀器廠).

1.3 方法

1.3.1 藍莓多糖的提取 稱取一定量速凍后的藍莓鮮果,于燒杯中以40 kHz、20 ℃、10 min進行超聲波解凍[16],解凍后放于干凈的研缽中,研磨成漿后準確稱取藍莓漿3.000 g于250.0 mL燒杯中,按1∶10料液比[9-10]加入30.0 mL蒸餾水,攪拌,在80 kHz、50 ℃、40 min進行超聲波提取[17],將藍莓多糖提取液倒入離心管內,以3 000 r/min離心15 min得藍莓多糖提取液.

1.3.2 藍莓多糖的測定 采用苯酚-硫酸法[18]測定藍莓多糖.精確稱取無水葡萄糖100.000 mg于燒杯中加蒸餾水溶解,定容至100.0 mL容量瓶,用蒸餾水配制成1.0 mg/mL的葡萄糖溶液.取上述溶液10.0 mL配制成0.1 mg/mL的葡萄糖儲備液,分別量取0.1 mg/mL葡萄糖儲備液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中,加蒸餾水至2.0 mL,然后分別加入1.0 mL蒸餾水、1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸,搖勻,放入沸水中加熱20 min,拿出靜置冷卻至室溫,參考文獻[17]中藍莓多糖最大吸收波長490 nm,并在該波長下測定吸光度值.以葡萄糖含量(μg/mL)為橫坐標,吸光度值(A)為縱坐標,繪制標準曲線,求得回歸方程為

y=0.013 2x+0.011 9,R2=0.995 7

將測定樣液的吸光度值代入回歸方程,計算藍莓多糖的含量.

1.3.3 單因素實驗 分別設置超聲溫度30、40、50、60、70 ℃,超聲頻率50、60、70、80、90 kHz,超聲時間30、40、50、60、70 min,進行單因素實驗;取1.0 mL藍莓多糖提取液于20.0 mL比色管中,加入1.0 mL蒸餾水、1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL濃硫酸,搖勻,放入沸水浴中加熱20 min,拿出靜置冷卻至室溫,稀釋一定倍數,同時做空白對照,在490 nm吸收波長處測定藍莓多糖提取液吸光度值,根據葡萄糖標準曲線回歸方程,計算樣品中多糖含量.

1.3.4 二次回歸正交旋轉實驗 基于單因素實驗結果,利用Design-Expert軟件進行二次回歸正交旋轉設計,確定超聲溫度、超聲頻率、超聲時間3個因素與多糖含量的回歸關系.

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲溫度的確定 藍莓多糖經超聲溫度30、40、50、60、70 ℃,固定超聲頻率70 kHz和超聲時間50 min提取離心后得到樣液體積為29.5、29.5、27.0、26.5、19.5 mL.由表1可得,隨著超聲溫度增加,藍莓多糖含量逐漸增加,當超聲溫度為60 ℃時,提取的藍莓多糖含量出現峰值,為984.957 mg/100 g,即9.850 mg/g.繼續升高溫度,藍莓多糖含量呈下降趨勢,溫度過高,氧化劇烈,導致其含量降低,這與徐麗萍等[19]的研究一致.超聲溫度70 ℃所測定多糖含量低,可能由于溫度高導致離心后樣液體積減小.因此,選擇60 ℃為最佳超聲溫度.

表1 超聲溫度確定

2.1.2 超聲頻率的確定 以 2.1.1得到的最佳超聲溫度進行提取,固定超聲時間50 min,分別以超聲頻率50、60、70、80、90 kHz提取藍莓多糖,離心后得樣液體積均為24.0 mL.由表2可得,隨著超聲頻率增加,藍莓多糖的含量先增加后減少,當超聲頻率70 kHz時,藍莓多糖含量出現峰值,為1 066.946 mg/100g,即10.669 mg/g.超聲頻率超過70 kHz時,由于超聲頻率過高引起多糖糖苷鍵斷裂,這與李敬等[13]和孫希云等[17]的研究一致.實驗過程中經單因素多次重復實驗驗證發現,以頻率60、70 kHz測定吸光度值、多糖含量均無明顯差異,因此,選擇60 kHz為最佳超聲頻率.

表2 超聲頻率確定

2.1.3 超聲時間的確定 以2.1.1和2.1.2確定的最佳超聲溫度和超聲頻率,超聲時間30、40、50、60、70 min后提取藍莓多糖,離心后得樣液體積為27.0、25.0、24.5、23.0、19.5 mL.由表3可得,隨著超聲時間延長,藍莓多糖含量先升后降,當超聲時間為 50 min時,提取藍莓多糖含量出現峰值,為1 058.610 mg/100 g,即10.586 mg/g.繼續延長超聲時間,藍莓多糖在超聲作用下發生降解,藍莓多糖含量逐漸減少,這與李敬等[13]和孫希云等[17]研究一致.根據單因素多次重復實驗驗證,測定吸光度值在50、60 min時有差異,吸光度值高可能由于時間延長導致提取樣液體積變小,但多糖含量在50、60 min時無明顯差異,因此,綜合考慮選擇50 min為最佳超聲時間.

表3 超聲時間確定

2.2 二次回歸正交旋轉試驗結果

為了優化提取結果,在單因素實驗的基礎上進行二次回歸正交旋轉組合設計,實驗方案見表4.

表4 三因素二次回歸正交旋轉組合設計因素水平編碼

由表5可知,回歸系數為b0、bj、bij、bjj,得初步回歸方程

表5 三因素二次回歸正交旋轉組合設計試驗結果

y=945.80+29.92x1-16.40x2+22.45x3-16.71x1x2+51.86x1x3+0.15x2x3+37.61(x12-

0.594)-21.68(x22-0.594)-22.42(x32-0.594)

當x1=1,x2=-1,x3=1時,即超聲溫度為60 ℃、超聲頻率為60 kHz、超聲時間為60 min時,回歸方程算出的預測值為1 080.355 mg/100 g,驗證實驗得到的值為1 036.080 mg/100 g,求得的變異系數為2.96%.

表6 方差分析

由表7可知,剔除不顯著因素后,回歸方程高度顯著,新的優化回歸方程為

表7 簡化后回歸方程的方差分析

y=975.72+51.86x1x3+37.61(x12-0.594)=953.38+51.86x1x3+37.61x12

該模型預測的最優條件為超聲溫度70 ℃、超聲頻率50 kHz、超聲時間70 min.結合單因素實驗和三因素二次回歸正交旋轉組合設計試驗結果,溫度越高、時間越長會造成多糖破壞.確定所對應驗證條件是超聲溫度60 ℃、超聲頻率50 kHz、超聲時間60 min.

2.3 驗證實驗

將回歸正交分析中接近于最大值的三個實驗組合、單因素最佳條件、三因素二次回歸正交分析結果中的最佳條件一起進行驗證,驗證實驗結果見表8.由表8可知,當x1=1,x2=-1,x3=1時,即超聲溫度60 ℃、超聲頻率60 kHz、超聲時間60 min,回歸方程算出的預測值為1 042.256 mg/100 g,驗證實驗得到的值為1 036.080 mg/100 g,變異系數為0.42%,其他組合變異系數都大于該值.這5組驗證實驗中,只有第5組超聲頻率50 kHz變異系數大于5%,提取率偏低,影響顯著;第2、3、4組超聲頻率為70、80 kHz時,雖變異系數較第1組大,但均不顯著,因此,綜合考慮選擇藍莓多糖提取的最佳超聲溫度為60 ℃、超聲頻率為60 kHz、超聲時間為60 min.

表8 驗證實驗

3 結論

通過單因素及三因素二次回歸正交旋轉實驗最終確定藍莓多糖提取條件為超聲溫度60 ℃、超聲頻率60 kHz、超聲時間60 min,在此條件下,提取得多糖含量預測值為 1 042.256 mg/100 g,驗證實驗值為1 036.080 mg/100 g.通過三因素二次回歸正交旋轉實驗結果分析得到結論,影響藍莓多糖提取條件因素的主次順序依次為超聲溫度、超聲時間、超聲頻率.回歸方程y=953.38+51.86x1x3+37.61x12,具有可預測性,擬合性好.