抗體工程化微型機器人清除水中新型冠狀病毒的研究

石 敏 陳 澤 潘 宏 鄭明彬,3 梁銳晶 蔡林濤*

1（中國科學院深圳先進技術研究院 深圳 518055）

2（中國科學院大學 北京 100049）3（深圳市第三人民醫院 深圳 518112）

1 引 言

由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起的新型冠狀病毒肺炎（簡稱“新冠肺炎”）在全球范圍內不斷蔓延，截至 2023 年 4 月，全球新冠肺炎累計確診病例超過 7.6 億，累計死亡人數超過689 萬（https://covid19.who.int/）。SARS-CoV-2 具有強烈的傳染性和致病性，可通過多種途徑傳播，包括呼吸道飛沫或氣溶膠的直接空氣傳播、接觸污染表面造成的間接污染物傳播[1]。研究顯示，除了新型冠狀病毒感染者的糞便樣本中存在 SARSCoV-2 外，在不同疫情蔓延程度地區的廢水中，SARS-CoV-2 的檢出載量為 0.02～3 000 copies/mL，表明 SARS-CoV-2 的傳播與水介質具有重要關系，存在經水媒介傳播的風險[2-3]。此外，SARSCoV-2 已被證明在室溫下的自來水和廢水中保持高度傳染性長達 7 天[4]。因此，開發高效清除水中 SARS-CoV-2 策略對降低其間接接觸傳播風險具有重要意義。

中和抗體能夠有效抑制病毒進入宿主細胞，并幫助免疫系統清除病毒，在對抗各類病毒性感染疾病的臨床應用中發揮重要作用[5]。SARSCoV-2 通過 S 蛋白的受體結合結構域（receptor binding domain，RBD）與宿主細胞表面上的血管緊張素轉換酶 2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結合，介導病毒進入細胞而造成感染[6]。因而，靶向 S 蛋白的中和抗體可以直接阻斷病毒與受體的結合，以抑制病毒感染。近年來，大量研究聚焦于尋找靶向 S 蛋白的高效中和抗體[7]。深圳市第三人民醫院張政教授團隊首次報道了具有高親和力、高特異性的中和抗體P2C-1F11，可有效對抗 SARS-CoV-2 感染[8]。該團隊在 SARS-CoV-2 感染者的單個 B 淋巴細胞中分離并鑒定出了 206 個特異性靶向 S 蛋白的單克隆抗體，從中篩選出一株高活性中和抗體 P2C-1F11。進一步研究表明，P2C-1F11 結合 RBD 時的表位和角度與 ACE2 結合 RBD 的情況基本一致，說明 P2C-1F11 與 ACE2 競爭結合 RBD 的表位，阻斷了 RBD 與 ACE2 的結合，從而抑制SARS-CoV-2 進入宿主細胞[9]。目前，P2C-1F11作為預防 SARS-CoV-2 感染的候選藥物，已被國家藥品監督管理局緊急批準上市，有望滿足我國新冠肺炎患者的臨床需求。

生物雜交微型機器人是由生物組件（如細菌、細胞等）和人造組件（如納米載體、抗體等）組成的自供能集成微型機器人[10-11]。近年來，生物雜交微型機器人被開發，并被用作一種新型的環境修復工具[12-13]。它們通過在溶液體系中自主運動，執行微納米尺度任務，包括快速清除水環境中的病原微生物和化學污染物，如重金屬[14-15]、有機污染物[16-17]、微塑料[18-19]和病原微生物[20-21]等，在大規模環境修復方面展示出良好的應用前景。與靜態的微/納米級村料相比，功能化微型機器人具有自驅動功能和動態吸附能力，可增加與目標污染物的接觸機率和吸附效率，實現高效“動態”清除。細菌具有獨特的鞭毛結構，被視作一種納米馬達[22]。它由內部生物能提供動力，可在水環境中自主推進，是一種理想的微型機器人候選村料?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis，BS）是一種易于大規模生產、壽命長和易于表面功能化的菌株。它能夠在不同的水環境中快速移動，可作為優良的自驅動模型[23]。研究表明，枯草芽孢桿菌可去除廢水中的硝酸鹽，在水質凈化方面的應用日益受到關注[24]，但在清除水中 SARS-CoV-2 方面的研究未見報道。

本文通過“點擊化學”反應將中和抗體P2C-1F11 錨定在枯草芽孢桿菌表面，構建一種抗體工程化微型機器人（antibody functionalized bacteria microrobot，AB-robot）。AB-robot 保留了原有的生物自主運動性，能在各種水介質中快速移動。將 SARS-CoV-2 假病毒作為模型污染物，表面錨定有中和抗體 P2C-1F11 的 AB-robot 通過快速移動增加與靶標病毒的結合效率，實現對SARS-CoV-2 假病毒的即時捕獲和有效清除。

2 材料與方法

2.1 材料

2.2 實驗方法

2.2.1 抗體工程化微型機器人的制備

首先，挑選出單克隆枯草芽孢桿菌，在含有3-疊氮基-D-丙氨酸（100 μmol/L，ALA-D-N3）的無抗性 LB 培養基中 37 ℃ 培養 6 h，獲得疊氮基團（-N3）代謝標記的枯草芽孢桿菌（BS-N3）[25]。然后，將中和抗體 P2C-1F11（10 μg/mL）與 DBCOPEG2000-NHS 酯（20 μmol/L）混合，室溫下孵育2 h。通過超濾法（超濾膜截留分子質量 50 ku，離心轉速 10 000 r/min）除去反應溶液中游離的 NHS酯，得到 DBCO 修飾的中和抗體 P2C-1F11（P2C-1F11-DBCO）。最后，將 BS-N3與 P2C-1F11-DBCO混合，室溫下孵育 2 h。通過離心（5 000 r/min，3 min）及 LB 培養基洗滌 3 次，即得到 ABrobot。收集用于進一步研究。

2.2.2 抗體工程化微型機器人的表征

（1）疊氮基團（-N3）的代謝表征

將 BS 和 BS-N3分別與配對疊氮基團的DBCO-Fluor 488 避光孵育 30 min，用 PBS 洗滌3 次，再用牛血清白蛋白體積分數為 1% 的 PBS重懸。通過流式細胞術分析 N3基團在枯草芽孢桿菌表面的代謝表達效率。

（2）中和抗體 P2C-1F11 的偶聯效率評價

2.5.13 術后逆行射精 等離子前列腺電切術后有一半以上患者出現逆行射精。原因可能為在術中切除膀胱頸部腺體時，破壞膀胱頸的正常結構及尿道內括約肌，造成術后膀胱頸功能不全而不能正常關閉，從而導致射精過程中精液向膀胱返流。因此，術中應盡量保留膀胱頸部的括約肌，以減少逆行性射精發生。

將 BS 和 AB-robot 分別與 anti-human IgG Antibody-PE 在冰上避光孵育 30 min，用 PBS 洗滌 3 次，再用牛血清白蛋白體積分數為 1% 的PBS 重懸。通過流式細胞術分析中和抗體 P2C-1F11 與 AB-robot 的連接效率。

2.2.3 抗體工程化微型機器人的運動行為評價

首先，考察 AB-robot 在培養基中的運動情況。將 BS、靜止的 AB-robot（AB-robotDead，通過紫外照射至無運動能力）和 AB-robot 分別重懸在LB 培養基中，各取 50 μL 懸浮液滴加到載玻片上，采用倒置光學顯微鏡拍攝視頻，紀錄其各自的運動情況。然后，考察 AB-robot 在不同水介質中的運動情況。將 AB-robot 轉移到含有 SARSCoV-2 假病毒（1×106TU/mL）的 PBS、飲用水和自來水中，各取 50 μL 懸浮液滴加到載玻片上，采用倒置光學顯微鏡拍攝視頻，紀錄 AB-robot 的運動情況。最后，通過 Image J 軟件分析并計算運動速度和追蹤運動軌跡[26]。

2.2.4 細胞培養

在含 10% 胎牛血清和 1% 雙抗的 DMEM 完全培養基中培養 HEK293T-ACE2 細胞，培養環境為 37 ℃，CO2濃度為 5%。使用胰酶和含 10% 胎牛血清的 PBS 緩沖液將 HEK293T-ACE2 細胞從培養瓶中分離，并通過離心（1 000 r/min，4 min）收集細胞，以供進一步研究。

2.2.5 抗體工程化微型機器人的抗病毒效果評價

（1）中和實驗

SARS-CoV-2 假病毒由深圳市第三人民醫院提供，制備方法見 Ju 等[8]的描述。假病毒中和實驗步驟如下。首先，將 HEK293T-ACE2 細胞以1×104/孔的密度接種到 96 孔板中，在 37 ℃ 和CO2體積分數為 5% 的環境中培養 24 h。然后，將 PBS、AB-robotDead（1×107CFU/mL）和 ABrobot（1×107CFU/mL）分別與等體積的 SARSCoV-2 假病毒（1×106TU/mL）在飲用水中孵育2 h。將所有處理組通過 5 000 r/min 離心 3 min，取上清液與 96 孔板中的 HEK293T-ACE2 細胞孵育 48 h。最后，向每孔 HEK293T-ACE2 細胞中加入熒光素酶底物，通過 IVIS?系統進行生物發光成像，對熒光素酶活性進行定量分析[27]。中和效率＝[1－（樣品的平均信號－背景的平均信號）/（僅病毒的對照組的平均信號－背景的平均信號）]×100%。

（2）掃描電鏡表征

通過掃描電鏡考察捕獲病毒前后的 ABrobotDead和 AB-robot 的形貌變化。樣品制備步驟如下：滴加一滴樣品于硅片表面，自然晾干后進行乙醇梯度脫水（30%-50%-70%-90%-100%），然后用叔丁醇-乙醇溶液梯度置換（30%-50%-70%-90%-100%），隨后進行真空冷凍干燥、噴金，最后用掃描電鏡觀察，并獲取圖像。

2.2.6 統計分析

使用 Graphpad Prism 8.0.1 軟件處理實驗數據，實驗結果均以“平均值±標準差”（n＝3）表示。組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和 Tukey 檢驗進行分析。其中，*** 為P＜0.001，表示有極其顯著的統計學差異。

3 結果與分析

3.1 抗體工程化微型機器人的表征

本研究采用氨基酸代謝標記結合點擊化學策略，構建了表面偶聯中和抗體 P2C-1F11 的枯草芽孢桿菌微型機器人。D 型氨基酸是細菌細胞壁的重要組成單元。將細菌與代謝前體 3-疊氮基-D-丙氨酸（ALA-D-N3）共孵育后，通過氨基酸代謝可在細菌細胞壁上表達出疊氮基團。如圖1（a）所示，與 BS 對照組相比，在 BS-N3組中，與疊氮基團配對的 DBCO-Fluor 488 熒光信號顯著增強，證實了 N3基團成功標記在枯草芽孢桿菌表面。類似地，圖1（b）結果顯示，約有87% 的 AB-robot 表現出 PE 陽性信號。而在 BS對照組中，未顯示出 PE 信號，表明中和抗體P2C-1F11 成功修飾在枯草芽孢桿菌表面。

3.2 抗體工程化微型機器人的運動評價

運動速度與遷移尺度是微型機器人的關鍵參數。為了探討化學偶聯是否對細菌的運動性能產生影響，本文采用光學顯微鏡觀察 AB-robot 的運動情況。如圖2（a）所示，AB-robot 的運動速度為（24.8±2.9）μm/s，與未修飾中和抗體的細菌（BS）的運動速度（（25.2±2.4）μm/s）相似，而與靜止的 AB-robot（AB-robotDead）的運動速度具有顯著性差異。進一步分析顯示，AB-robot 和 BS 具有相似的長距離運動軌跡（圖2（b）、（d）），而 ABrobotDead的運動距離可忽略不計（圖2（c））。以上結果表明，中和抗體的偶聯過程不會對細菌的運動能力造成損傷，AB-robot 保留了細菌原有的運動速度和活力，具有高效的自主運動行為。

圖2 通過光學顯微鏡評價 AB-robot 的運動行為Fig.2 Evaluation of the motor behavior of the AB-robot by optical microscopy

將 AB-robot 轉移到含 SARS-CoV-2 假病毒的不同水介質中，測試 AB-robot 在不同水環境中的運動性能。如圖3（a）所示，AB-robot 在 PBS、飲用水和自來水中均顯示出快速的運動能力（＞22 μm/s）。圖3（b）～（d）展示了 AB-robot 在PBS、飲用水和自來水中的代表性運動軌跡，反映了 AB-robot 在這些水介質中具有高度穩定的運動性能。以上結果表明，AB-robot 能夠在不同水介質中保持高效穩定的自主運動，可推廣應用于復雜的水環境中新型冠狀病毒的主動捕獲和清除。

圖3 通過光學顯微鏡評價 AB-robot 在 PBS、飲用水和自來水中的運動行為Fig.3 Evaluation of the motion behavior of AB-robot in PBS, drinking water and tap water by optical microscopy

3.3 抗體工程化微型機器人的病毒清除效率評價

假病毒是一種人工構建的與活病毒具有相似功能結構的病毒樣顆粒。假病毒具有與活病毒相近的宿主細胞感染能力，且其無法產生具有感染性的子代病毒，因此常用于開發或驗證新的抗病毒技術。本文采用的 SARS-CoV-2 假病毒系統包含 SARS-CoV-2 S 蛋白和熒光素酶報告基因。假病毒可以模擬感染靶細胞（HEK293T-ACE2）過程，進入靶細胞表達熒光素酶。因此，熒光素酶報告基因表達的強弱情況可以反映病毒感染細胞的程度。為了考察假病毒能否被 AB-robot 捕獲，并從水介質中清除，本文對 HEK293T-ACE2 細胞被 SARS-CoV-2 假病毒侵染的過程進行可視化驗證。如圖4（a）所示，IVIS 生物發光結果展示了未處理組（PBS 組）發出強烈的生物發光信號，表明水中的假病毒感染了宿主細胞，并在宿主細胞內高表達熒光素酶。相比之下，靜止 ABrobot 對照組（AB-robotDead）表現出中等的發光信號，而 AB-robot 處理組的發光信號可忽略不計（圖4（b））。中和效率結果（圖4（c））顯示，ABrobot 清除了水中 95% 的 SARS-CoV-2 假病毒，是靜止 AB-robot 對照組（AB-robotDead）清除率（41%）的兩倍以上。以上結果表明，中和抗體P2C-1F11 修飾的高活性微型機器人通過對病毒特異靶向和快速驅動的特性，提高對病毒的接觸、捕獲和清除效率。

圖4 不同處理組的病毒清除效率評價Fig.4 Efficiency of the virus removal in different treated groups

圖5 展示了 AB-robotDead和 AB-robot 分別與SARS-CoV-2 假病毒共孵育之前（圖5（a）、圖5（c））和之后（圖5（b）、圖5（d））的掃描電鏡圖?？梢郧宄赜^察到，與 AB-robotDead和 AB-robot 原本的光滑表面（5（a）、5（c））相比，與 SARS-CoV-2假病毒共孵育之后的 AB-robotDead和 AB-robot 的表面均結合了假病毒顆粒，且 AB-robot 結合的病毒粒子數量顯著高于 AB-robotDead。以上結果從微觀層面進一步驗證了 AB-robot 對病毒的高效捕獲。

圖5 捕獲病毒前后的 AB-robotDead 和 AB-robot 的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of the AB-robotDead and AB-robot before and after capture the virus

4 討論與分析

盡管通過目前的水體消毒工藝能一定程度上減少水中的 SARS-CoV-2，但考慮到 SARSCoV-2 的高穩定性和高致病性，所以亟須開發出更為嚴格和高效的病毒清除技術。Schoeler 等[28]開發了一種聚氨酯泡沫復合村料，以去除水中SARS-CoV-2。SARS-CoV-2 通過靜電相互作用被表面帶相反電荷的聚氨酯泡沫復合村料直接吸附，但是該方法缺乏病毒特異性，難免影響SARS-CoV-2 的清除效率。在本研究中，中和抗體 P2C-1F11 通過點擊化學反應修飾到細菌微型機器人表面。其中，中和抗體 P2C-1F11 已被證明對 SARS-CoV-2 S 蛋白具有高效、特異的靶向能力，并被批準上市用于 SARS-CoV-2 的治療和預防。本研究將中和抗體集成到自驅動細菌微型機器人平臺，以特異性的方式結合來自復雜環境的病毒。與常見的基于物理吸附作用的捕獲方式相比，這種基于抗原特異性捕獲方式顯著提高了捕獲 SARS-CoV-2 的效率。

Sun 等[29]提出了一種基于納米抗體功能化纖維素村料捕獲 SARS-CoV-2 的策略。該團隊通過纖維素村料表面的納米抗體對病毒進行捕獲，阻斷對宿主細胞的感染。然而，利用納米村料捕獲水體污染物的過程需要外加機械攪拌等方式來提高納米村料的擴散程度，增加納米村料與污染物的接觸機會和清除效率。本研究構建的抗體工程化微型機器人的運動實驗表明，AB-robot 保留了細菌固有的自驅動特性，能在各種水介質中快速運動，有效促進流體的混合，同時加快抗體擴散速度，增加了中和抗體與 SARS-CoV-2 的特異性接觸和結合效率，從而提升了 SARS-CoV-2 的清除效率。本研究利用 SARS-CoV-2 假病毒為污染物模型，驗證了 AB-robot 對病毒的結合和清除能力。研究結果表明，在高濃度的病毒載量下，AB-robot 的清除率高達 95%。使用 AB-robot 捕獲 SARS-CoV-2 假病毒后，進行離心分離處理，可以在不影響病毒清除效率的情況下從水介質中分離出 AB-robot。該操作簡單快速，具有相當大的實際應用潛力。

雖然本文目前的研究僅以新型冠狀病毒為污染物模型，但是這種“運動和修復”雙功能的微型機器人概念及構建技術還可以擴展應用到其他的病原微生物領域。未來的研究可以通過使用其他特異性靶標分子替換中和抗體模塊，實現對其他類型病毒或病原微生物的靶向捕獲。隨著新型冠狀病毒不斷迭代和突變，新出現的突變株發生比較嚴重的免疫逃逸，導致許多已有的中和抗體的中和效果顯著降低[30]，從而在一定程度上影響AB-robot 對新冠突變株的捕獲和清除效果。但是目前已經鑒定出更多的靶向 SARS-CoV-2 不同表位的特異性中和抗體，未來工作可以基于多價結合方式研究不同新冠抗體組合，以提高對新冠變異株的捕獲效率[31-32]。

5 結 論

本研究采用氨基酸代謝標記與點擊化學技術結合的策略，將中和抗體 P2C-1F11 修飾在具有自驅動功能的枯草芽孢桿菌表面，成功構建了抗體工程化的微型機器人（AB-robot），用于清除水中 SARS-CoV-2。AB-robot 不僅保留了細菌固有的自驅動活性，還增強了中和抗體對病毒的特異性靶向性能，在各種水介質中快速運動，并高效捕獲病毒。在 SARS-CoV-2 假病毒污染物模型中，AB-robot 的快速運動促進表面修飾的中和抗體 P2C-1F11 與靶病毒的高效結合。AB-robot對 SARS-CoV-2 假病毒的清除率高達 95%，實現了靶病毒的即時捕獲和高效清除?？傊?，本研究提供了一種簡單、快速、高效的清除水中病毒污染物的技術，為阻斷水中病毒的傳播提供了新思路。