噬菌體在畜禽業中的應用研究進展

任仕航，段慧慧，杜向黨，商艷紅

（河南農業大學動物醫學院，河南 鄭州 450002）

抗生素是20 世紀科學技術史上最偉大的成就之一，拯救了無數生命。隨著抗生素的殘留問題以及長期濫用，一些對多種抗生素耐藥的“超級細菌”迅速出現，由于新型抗生素的研發緩慢，細菌耐藥性對人類和畜禽的生命構成了嚴重威脅。 據報道，每年至少有42 萬人死于耐藥病原體，并預計到2050 年將增加到1 000 萬人［1］。 我國繼2016年發布《遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016—2020年）》 后， 為進一步加強遏制微生物耐藥工作于2022 年發布了 《遏制微生物耐藥國家行動計劃（2022—2025 年）》， 在行動計劃中多次重點強調遏制微生物耐藥工作的重要性， 研發新型抗菌藥物迫在眉睫。因此，能夠治療細菌性感染的噬菌體已經成為替代抗生素的新的研究熱點。

畜禽業是世界范圍內使用多種抗生素的行業之一， 抗菌藥物殘留以及多重細菌耐藥等問題給畜禽業的發展帶來了重大挑戰， 噬菌體作為抗生素的替代品， 在畜禽養殖業中具有廣闊的發展前景。 本文主要綜述噬菌體在畜禽業中的應用研究進展， 以期為噬菌體在畜禽業中的具體應用提供參考。

1 噬菌體概述

噬菌體在1915 年被發現并引起廣泛關注，是一類可以感染細菌、真菌、放線菌以及螺旋菌等微生物的病毒統稱，其廣泛分布在環境中，是已知存在的最大病毒群，據估算總量可達1031個［2］。 根據噬菌體的形態結構特征，可以分為有尾噬菌體、無尾噬菌體以及絲狀噬菌體， 噬菌體共分為15 個科，其中96%屬于有尾噬菌體目，又可根據尾部形態結構分為短尾噬菌體科、長尾噬菌體科、肌尾噬菌體科和阿克曼噬菌體科［3］。 根據噬菌體對宿主菌的破壞過程可分為裂解性噬菌體（又稱烈性噬菌體或毒性噬菌體）和溶原性噬菌體［4］，裂解性噬菌體在Ca2+、Mg2+等二價陽離子的作用下特異性結合吸附在細菌細胞壁上［5］，將自身遺傳物質注入細胞后， 在宿主菌的代謝系統下展開遺傳物質復制、蛋白質合成和子代噬菌體裝配等工作，在子代噬菌體達到一定數量后，噬菌體可以通過內溶素、穿孔素等裂解細菌細胞膜及肽聚糖層，在細胞內壓的作用下細菌細胞破裂，從而釋放子代噬菌體［6］。溶原性噬菌體是將自身基因組與宿主菌的DNA結合在一起，與細菌遺傳物質共同復制［7］，當環境發生改變時，轉變為烈性噬菌體裂解細菌。由于溶原性噬菌體可能會通過將一種細菌的遺傳物質轉移到另一種細菌導致抗生素耐藥性的發生， 甚至會增加宿主菌的毒力，因此，溶原性噬菌體不適合直接用于治療［8］。 也有學者認為除了這兩種經典的噬菌體復制周期以外還存在慢性感染、 持續感染模式和偽溶原性感染等不同的感染模式［9］。

相對于傳統的抗菌藥物， 噬菌體的研發周期更短，投入成本更低，且具有更高的專一性、更強的增殖能力、更安全、更不易產生耐藥等優點。 噬菌體根據本身的吸附部位以及受體菌表面受體結構的不同具有高度的宿主特異性， 使得一種噬菌體只會殺滅單一或同一亞型的致病菌［10］。 當一個噬菌體感染一個宿主菌后，能夠分裂出大約100個子代噬菌體，可以滲透藥物不能穿透的區域［11-12］，一次給藥后連續有效，直至消滅全部宿主菌后排出體外。噬菌體療法具有很高的安全性，在噬菌體療法發展的百年歷史以來，已被應用于多種人類細菌性疾病，其中包括對呼吸道內科疾病的治療［13］。據報道，細菌對抗生素產生對抗的突變頻率為10-5，對噬菌體產生對抗的突變頻率為10-7［14］，細菌會通過成簇的規律間隔的短回文重復序列CRISPR相關蛋白系統抵抗噬菌體的入侵， 同時噬菌體也能夠進化出相應的機制如表達anti-CRISPR 蛋白來對抗細菌的耐受性［15］。 可以說相比于抗生素對機體的作用，噬菌體對機體來講是一種“活藥”，在細菌與噬菌體相互作用時可以實現共同進化。

2 噬菌體在畜禽疾病治療中的應用研究

噬菌體療法是將篩選、 純化和富集特定宿主致病菌的專屬烈性噬菌體添加到被致病菌污染的介質中定向侵染并殺滅致病菌［16］。 事實上，早在20 世紀20 年代發現噬菌體之初就開始被用于治療細菌性感染， 在抗生素出現后噬菌體的研究一度被擱置，如今由于超級細菌的不斷增多，人們把目光轉移到了噬菌體療法上， 以期它能夠成為一種對抗細菌耐藥的抗生素替代療法［17］。 目前噬菌體療法已經可以普遍應用于防治畜禽致病性大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、彎曲桿菌等細菌感染性疾病。

2.1 大腸桿菌

禽致病性大腸桿菌可以誘發急性敗血癥、輸卵管炎、 氣囊炎等癥狀， 其病死率幾乎高達100%［18］，對畜禽業的發展造成了巨大的損失。 大腸桿菌作為革蘭陰性菌， 表面有一層較厚的莢膜多糖， 可以作為細菌的保護層使其免受來自外界的傷害， 同時可以使細菌逃避免疫系統的吞噬和補體的殺滅作用。 呂金暉等［19］從雞糞中分離出了1 株大腸桿菌裂解性噬菌體， 研究發現其解聚酶Dpo70 能夠特異性降解宿主菌表面的多糖， 同時通過實驗發現在解聚酶Dpo70 的輔助作用下25%的血清對于大腸桿菌E.coli 111 的殺滅作用基本上達到了100%，這說明噬菌體的解聚酶能夠通過降解宿主菌表面多糖來殺滅大腸桿菌。 Oliveira等［20］利用噬菌體制劑治療某雞舍的大腸桿菌感染性疾病，7 d 后死亡率明顯降低，21 d 后該雞舍的病雞徹底痊愈且無復發。 李金敏等［21］從某養殖場糞污采樣中提取到了一株大腸桿菌噬菌體Ф ECP2-1，隨后利用該噬菌體對處理過的養殖水體和雞糞中的宿主菌進行防控， 殺菌率達到99%以上， 這都很好地說明了噬菌體對于殺滅大腸桿菌具有良效。

2.2 沙門菌

沙門菌作為一種人獸共患病原菌， 在畜禽養殖中可導致多種疾病，同時也會通過污染禽蛋、肉等給人類的健康帶來威脅。 由韓國CJ CheilJedang公司研制的沙門菌噬菌體產品BioTector， 是首個在動物飼料中取代抗生素， 用以防治雞傷寒及雞白痢沙門菌的噬菌體產品［22］。 沙門菌能夠通過垂直傳播，Henriques 等［23］將噬菌體噴灑到孵化時被沙門菌感染的蛋殼表面，與對照組相比，噴灑組中孵化的雛雞關節炎癥狀有了顯著的改善， 并且在8 d 后這些癥狀全部消失，這表明了噬菌體能夠阻斷沙門菌的垂直傳播。 Nikkhahi 等［24］利用給小鼠口服灌胃噬菌體的方法來治療沙門菌感染， 結果發現， 噬菌體治療可以很好地避免小鼠被沙門菌感染， 盡管以環丙沙星為陽性對照也有同樣的保護作用，但是小鼠的體重卻有所降低，這表明與抗生素療法相比， 噬菌體療法不僅可以治療沙門菌的感染，而且對動物無害。

2.3 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌在環境中的分布非常廣泛，它是臨床上化膿性感染中最常見的致病菌之一，也是乳腺炎、關節炎和局部膿腫的主要致病菌，其中奶牛乳腺炎是阻礙奶牛業發展最常見的疾病之一，據統計全球患有此病的奶牛約有30%［25］。目前臨床上主要使用抗生素治療該疾病， 但是在膿腫的乳腺中金黃色葡萄球菌會形成生物被膜， 進而影響抗生素的殺菌效果， 而噬菌體能夠利用其裂解生物被膜的作用將其殺滅。 侯忠余等［26］以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 （methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA） 為宿主菌從奶牛養殖場污水中分離到1 株烈性噬菌體P65， 使用該噬菌體對宿主菌MRSA 2 和MRSA 24 處理48 h后， 宿主菌的被膜清除率分別高達91.3%和92.2%。李躍［27］在患乳腺炎的奶牛所在的污水系統中分離得到金黃色葡萄球菌裂解性噬菌體， 通過建立小鼠乳腺炎模型并使用該噬菌體對其治療，發現乳腺組織內細菌數量顯著下降， 明顯減少乳腺組織中淋巴細胞的滲出，緩解乳腺組織病變。噬菌體內溶素是噬菌體侵染宿主菌后期所釋放的一種能夠裂解細菌細胞壁肽聚糖的水解酶。 李曉妍等［28］制備了一種互穿網絡溫敏水凝膠，利用干態浸泡法負載金黃色葡萄球菌內溶素Lys84 獲得載藥水凝膠IPNT-Lys84，經過對其性能表征的測試試驗發現與游離內溶素相比， 負載于水凝膠中的內溶素Lys84 擁有更長的發揮作用時間， 因此，IPNT-Lys84 水凝膠能夠作為一種有前景的抗菌材料， 用于多重耐藥金黃色葡萄球菌外傷感染的防治。

3 噬菌體在畜禽養殖中的應用研究

禁用飼料添加抗生素以來， 動物的生長生產性能受到明顯影響， 大量研究表明噬菌體對畜禽腸道的物理屏障、化學屏障、免疫屏障和生物屏障的影響都會對其生長性能產生積極作用， 進而提高家禽出欄率及優質肉品生產率［29-30］。

機體的腸道物理屏障包括黏膜上皮和腸道緊密連接等， 其中胃腸道的黏膜上皮形態結構能夠影響營養物質的消化吸收， 絨毛高度與隱窩深度的比值升高則表明其消化吸收功能增強， 即機體的生長性能好［31］。 朱樹嬌等［32］在肉雞的飲用水中加入噬菌體復合制劑，結果顯示十二指腸、空腸、回腸的絨毛都比對照組顯著增高， 隱窩深度均比對照組顯著變深，其消化吸收功能顯著增強。腸道上皮細胞之間通過緊密連接蛋白 （ZO-1、Occludins 和Claudin-1 等）連接，而緊密連接蛋白與腸道通透性及屏障結構密切相關［33］。 郝賀［34］從某雞場污水中成功分離得到了1 株長尾烈性沙門菌噬菌體， 通過實驗證明噬菌體能夠阻止沙門菌對雛雞小腸絨毛的正常結構形態損傷， 促進十二指腸和空腸緊密連接蛋白表達， 從而抑制沙門菌對腸道的感染。 唐路瑤［35］配制噬菌體雞尾酒作為飼料添加劑飼喂肉雞， 研究發現飲用過噬菌體雞尾酒的肉雞腸道上皮細胞的ZO-1 和Claudin-1 蛋白表達量顯著上調。黏蛋白MUC-2 是主要覆蓋于腸道表面黏液層的一種大分子糖蛋白， 可以保護和潤滑腸道，在唐璐瑤［35］的試驗中噬菌體雞尾酒組與抗生素組相比，肉雞空腸黏液蛋白MUC-2 的蛋白表達量顯著提高， 這說明噬菌體能夠增強腸道物理及化學屏障，維護腸道穩態。 據統計，70%的免疫系統通過腸道來發揮其免疫功能， 改善腸道的微生物多樣性能夠有效降低免疫或炎癥反應，從而防止其對生長性能的影響［36］。在正常情況下，IgA、IgG、IgM 含量增多或者免疫器官指數增加都在一定程度上表明動物免疫體系更強［37］。 葛龍等［38］將噬菌體加入麻雞的基礎飼糧中發現其胸腺指數、 脾臟指數和法氏囊指數與對照組相比均有所提高，葛龍等［39］還將噬菌體制劑加入母豬的基礎飼糧， 結果發現3 種不同劑量的復合噬菌體制劑均能在合理范圍內提高母豬的IgA、IgG 和IgM含量。Hosseindoust 等［40］和曾永娣等［41］同樣嘗試將噬菌體添加到仔豬飼糧中， 結果均表明噬菌體的添加提高了仔豬腸道中的益生菌活性， 并且也都增加了仔豬平均日增重及料重比。

4 噬菌體在畜禽產品生物防控中的應用研究

畜禽產品在到達消費者餐桌之前， 整個食品鏈都易受到各種有害微生物的影響， 當前人們主要利用各種化學性的保鮮劑、 防腐劑等來最大限度避免食品被污染， 然而卻無法完全解決其造成的食品安全檢測難度高和營養成分缺失等問題。研究人員嘗試使用噬菌體在畜禽養殖過程、 鮮奶和肉制品生產過程、 保藏運輸以及銷售等不同階段進行生物防控，并取得了一定的進展。

肉類食品在生產過程中極易受到多種致病菌的污染，從而對人類的健康造成威脅，Hee 等［42］將沙門菌接種于生雞胸肉中，隨后接種混合噬菌體，結果顯示生肉中沙門菌菌量呈顯著降低的趨勢。Zhou 等［43］從養豬場污水中分離出了一株多價廣譜噬菌體EP10，在不同溫度（4 ℃和28 ℃）條件下將該噬菌體接種于受大腸桿菌與沙門菌共同污染的牛奶中， 結果發現在不同溫度條件下噬菌體在牛奶中都能夠有效抑菌。 噬菌體也可以用于食品加工過程和銷售期間的消毒。 加拿大麥克斯特大學的研究團隊研制出了一種可以有效防止細菌污染的新型噬菌體滅菌噴霧， 該噴霧能夠被應用于食品加工、包裝和清潔，在其表面形成一種動態、連鎖的滅菌反應，安全且高效［44］。 到目前為止，國外已經批準產生志賀樣毒素的大腸桿菌、 單核細胞增生李斯特菌和沙門菌的噬菌體等14 種噬菌體產品用于食物的生物防治［45］。 雖然我國在食品領域暫無獲批的噬菌體制劑， 但是國內學者從未停止在食品領域對噬菌體進行研究， 并取得了階段性進展。Wang 等［46］從鴨子養殖場分離出了一株寬宿主譜毒性噬菌體fmb-p1，將其接種于提前注入沙門菌的鴨肉樣品中， 結果發現經噬菌體處理后的鴨肉樣品比未處理的鴨肉中的菌體含量顯著降低， 表明該噬菌體對鴨肉中的沙門菌具有極好的裂解作用。 聶若男等［47］將噬菌體作用于已接種沙門菌的牛肉，研究發現在4 ℃和25 ℃的溫度下沙門菌菌量都有顯著下降， 該噬菌體在食品中表現出了良好的抑菌效果。 在當今提出減抗替抗的背景下，噬菌體這種新型抗菌藥物的研發，為控制食源性病原菌提供新的切入點，極具發展潛力。

5 結語與展望

隨著多重耐藥菌的廣泛流行， 新型抗生素的研發緩慢， 給畜禽業的發展帶來了各種各樣的威脅。目前抗生素的禁用愈發普及，畜禽養殖業和醫療等方面急需新型抗生素替代制劑， 而對噬菌體的研究很好地體現了它在預防及治療細菌性感染疾病方面有巨大潛能，而且能夠作為飼料添加劑提高畜禽的生長性能， 不僅能夠為畜禽健康生長提供保障， 更能滿足人們對畜禽產品的安全性的要求，這無疑使畜牧業的發展迎來了新的曙光。

同時，任何抗菌策略都存在利弊。噬菌體的高度宿主特異性限制了其裂解能力， 現有的研究表明可以通過篩選裂解譜較廣的噬菌體顆粒提高殺菌效果， 噬菌體的宿主范圍與尾絲蛋白有很強的相關性， 由于不同種屬的噬菌體可以相互交換尾纖維基因， 因此可以利用基因工程技術改造噬菌體，從而拓寬其宿主范圍，常見的應對方法還有配制噬菌體雞尾酒來應對細菌的混合感染， 有研究表明這種方法還能夠有效降低耐受菌出現的概率［48］， 雖然前文中提到噬菌體較抗生素產生細菌耐藥的概率極低， 但是在噬菌體對抗細菌耐藥機制的動態過程中同樣也在影響其藥效， 有部分研究人員將目光轉移到了噬菌體裂解酶， 它是一種可特異性降解細菌表面多糖的噬菌體蛋白， 目前尚未發現有目標菌株耐受裂解酶的現象， 說明噬菌體裂解酶較全噬菌體療法能夠更加穩定的發揮功效。 要想使噬菌體順利到達細菌感染部位發揮作用， 還應該考慮到噬菌體制劑的穩定性以及藥代動力學， 首先在篩選時要選擇對溫度敏感性較低、耐酸耐堿度較高的噬菌體，同時要選擇適宜的材質包裝制劑，從而提高噬菌體的穩定性，而藥代動力學是研究機體對藥物處置的動態變化， 同一感染部位使用不同的給藥方式效果就會不同，噬菌體在體內的各個部位的效價和停留時間也不同［49］，因此在應用于臨床之前必須要根據噬菌體的藥代動力學制定一套系統準確的方案， 從而使其達到最好的治療效果。 已有的研究足以表明噬菌體在畜牧業發展中的優勢性， 隨著對噬菌體研究的不斷深入以及基因工程技術的不斷成熟，相信在不久的將來， 國家能夠建立一套成熟的噬菌體商品化體系， 使這種新型抗生素替代品真正為畜牧業的發展和人類的健康提供有力保障。