過表達解偶聯蛋白2抑制氧化應激減輕糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷

丁佳慧 吳建江 程虎 朱闊 于文彬 王江

糖尿病是心肌梗死最常見的危險因素，糖尿病患者更容易發生心肌缺血性功能障礙，包括心肌缺血再灌注損傷（IRI）。糖尿病患者急性心肌梗死或冠狀動脈搭橋術后的死亡率是非糖尿病患者的2 倍[1]。心肌IRI 是包括氧化應激、炎癥反應、線粒體功能損傷、鈣超載、細胞自噬和凋亡等機制的多因素過程[2]。越來越多的證據表明，糖尿病會使心肌IRI 加重和復雜化[3]，高血糖會顯著誘導IRI 后的心功能障礙和心肌超微結構的破壞[4]，而氧化應激反應的加劇可能導致糖尿病心肌IRI 加重[5]。糖尿病時多種信號通路受損，也會導致大部分干預措施對糖尿病心肌IRI 作用減弱甚至消失[6]。解偶聯蛋白2（UCP2）是一種質子轉運蛋白，位于線粒體內膜。UCP2 可使H+從線粒體膜間隙滲漏到基質中，減少活性氧（ROS）的產生，發揮抗氧化應激作用[7]。研究表明，UCP2 可以通過減少ROS 的產生，改善線粒體結構，減輕高血糖狀態下腦IRI[8]。本研究探討過表達UCP2 是否可以通過抑制氧化應激對IRI 的糖尿病心肌產生保護作用，以期為改善糖尿病患者預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 小鼠糖尿病模型建立與實驗分組

C57BL 雄性小鼠60 只（8 周齡，20～25 g）購自新疆醫科大學動物實驗中心，所有實驗小鼠均自由進食、飲水，實驗前適應性喂養1 周。本研究經新疆醫科大學第一附屬醫院動物倫理委員會審查批準。

小鼠采用高脂肪飲食（膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、蛋黃粉10%、豬油10%、普通飼料78.8%）喂養6 周，第7 周禁食不禁水12 h 后，腹腔注射45 mg/（kg·d）脲佐菌素（STZ）溶液（STZ 溶于冰浴的0.1 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液，避光，現用現配），每天1 次，連續5 次，腹腔注射于30 min 內完成，第8 周第2 天及第5 天檢測空腹血糖，空腹血糖大于11.1 mmol/L 的小鼠確定為糖尿病模型構建成功。采用隨機數字表法將糖尿病小鼠分為5 組：假手術組（Sham 組）、缺血再灌注組（I/R 組）、UCP2 抑制劑組（Genipin 組）、空載9 型腺相關病毒（AAV9-NC）組（AN 組）、攜帶UCP2 基因的AAV9（AAV9-UCP2）組（AU 組），每組12 只。

1.2 AAV9-UCP2腺相關病毒的構建和干預

依據NCBI 數據庫檢索得到的小鼠UCP2基因序列（NM_011671.5），將編碼區序列構建至9 型腺相關病毒（AAV9）載體中，包裝完整病毒，構建UCP2過表達的腺相關病毒。小鼠高脂喂養2 周時，AU 組每只小鼠尾靜脈注射AAV9-UCP2 5×1011vg，AN 組每只小鼠尾靜脈注射AAV9-NC 5×1011vg。

1.3 心肌缺血再灌注損傷模型的建立

第9 周時所有糖尿病小鼠稱重備皮，2%七氟烷吸入麻醉后，用20G 穿刺針行氣管插管，插管后連接小動物呼吸機行機械通氣，潮氣量0.8～0.9 mL，呼吸頻率120 次/min，吸呼比1 ∶1。Sham組僅切開皮膚后縫合，其余4 組均在胸骨左側第三肋間隙剪開皮膚及皮下組織，鈍性分離肋間肌進入胸腔，切開心包暴露心臟，使用6-0 線從左心耳根下1～2 mm 處穿入，從肺動脈錐左側邊緣穿出，結扎冠狀動脈左前降支?？p合方向平行于左心耳下緣，當左心室前壁及心尖周圍心肌運動減弱、顏色變白時，提示結扎成功。缺血60 min 后，解除結扎，再灌注120 min。Genipin 組于缺血前14 h 腹腔注射Genipin（美國MCE 公司，貨號：HY-17389）100 mg/kg。

1.4 酶聯免疫吸附試驗檢測血清樣本

小鼠再灌注120 min 時腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg，抽取腹主動脈血，4 ℃時1 200×g離心10 min，取上清液，酶聯免疫吸附試驗（南京建成生物工程研究所）檢測血清肌鈣蛋白I（cTnI）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，具體操作步驟見說明書。

1.5 流式細胞儀檢測心肌ROS產生情況

充分研磨組織，收集細胞懸液離心留沉淀，加入濃度為10 μmol/L 的2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），37 ℃孵育，洗滌重懸，在最佳激發波長488 nm、發射波長525 nm 下使用流式細胞儀檢測細胞懸液的熒光強度，以Sham 組作為參照，分析各組的熒光強度。

1.6 透射電鏡觀察心肌超微結構的變化

采血結束后立即處死小鼠，取心臟，分離左心室，取1 mm3左心室組織，4 ℃固定于戊二醛電鏡固定液中24 h，室溫脫水后包埋聚合，60～80 nm超薄切片，2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色，清洗后2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色，清洗干燥后透射電鏡觀察。

1.7 Western blot檢測UCP2蛋白的表達

采血結束后立即處死小鼠，取心臟，分離左心室，充分裂解研磨，超聲細胞破碎機破碎，4 ℃離心，取上清，用BCA法進行蛋白定量。取所需蛋白樣品，煮沸變性，取樣品10 μg 于SDS-PAGE 凝膠中電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，Tris-HCl 緩沖鹽溶液（TBST）漂洗。加入兔抗小鼠UCP2 單克隆抗體（1 ∶2 000 稀釋，美國Invitrogen 公司），4 ℃孵育過夜。TBST 漂洗后加入山羊抗兔IgG（1 ∶2 000稀釋，北京中杉金橋生物技術有限公司），室溫孵育2 h，TBST 漂洗，顯影，ImageJ 軟件分析計算蛋白條帶灰度值。

1.8 超聲心動圖檢查

再灌注24 h 時，采用小動物超聲心動圖（visualsonics VEVO 3100 system，加拿大）對小鼠心功能進行評估。通過M 型超聲連續掃描5 個心動周期獲取心功能各項參數：每搏輸出量（SV）、射血分數（EF）、左室短軸縮短率（FS）。

1.9 統計學分析

采用SPSS 26.0 進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌損傷標志物、氧化應激指標比較

與Sham 組相 比，I/R 組、Genipin 組、AN 組及AU 組cTnI 和MDA 水平明顯升高，ROS 產生增多，SOD 水平明顯降低（P＜0.05）；與I/R 組相比，Genipin 組cTnI 和MDA 水平明顯升高，ROS 產生增多，SOD 水平明顯降低（P＜0.05）；與I/R 組相比，AU 組cTnI 和MDA 水平明顯降低，ROS 產生減少，SOD 水平明顯升高（P＜0.05）；AN 組與I/R 組cTnI、ROS、MDA 及SOD 水平的差異無統計學意義。見表1。

表1 5組小鼠血清cTnI、ROS、MDA、SOD水平的比較(n＝8)

2.2 心肌超微結構的變化

Sham 組肌絲排列有序，無明顯溶解或斷裂，閏盤完整；線粒體形態完整，排列有序；I/R 組心肌結構嚴重受損，肌絲溶解甚至斷裂，肌漿網擴張；線粒體腫脹，排列紊亂，嵴間隙增寬破裂；Genipin 組心肌結構損傷較I/R 組更嚴重，心肌結構破壞更明顯，細胞廣泛壞死，肌絲明顯溶解斷裂，線粒體顯著腫脹破裂；AN 組心肌及線粒體損傷程度與I/R 組相仿；AU 組肌絲有序排列，部分肌絲和肌節間隙增寬溶解，閏盤基本完整，大部分線粒體形態完整，嵴清晰可見，部分線粒體輕微腫脹。見圖1。

圖1 5組小鼠電鏡下心肌超微結構圖（2%醋酸鈾飽和酒精+2.6%枸櫞酸鉛染色，×6 000）

2.3 UCP2表達水平的比較

與Sham 組（0.55±0.16）相比，I/R 組UCP2表達水平（1.27±0.36）明顯增加（P＜0.05）；與I/R 組相比，Genipin 組UCP2 表達水平（0.58±0.15）明顯降低，AU 組UCP2 表達水平（2.01±0.57）明顯增加（P＜0.05），AN 組與I/R 組UCP2 表達水平（1.28±0.039）的差異無統計學意義。見圖2。

圖2 小鼠心肌組織UCP2的表達情況

2.4 心功能的比較

與Sham 組相比，I/R 組、Genipin 組、AN 組及AU 組SV、EF、FS 明顯降低（P＜0.05）；與I/R組相比，Genipin 組SV、EF、FS 明顯降低（P＜0.05），AU 組SV，EF、FS 明顯升高（P＜0.05），AN 組與I/R 組SV，EF、FS 的差異無統計學意義。見表2。

表2 5組小鼠超聲心動圖檢測心功能指標的比較（n＝4）

3 討論

本研究根據文獻[9]，結扎糖尿病小鼠冠狀動脈左前降支建立小鼠心肌IRI 模型。本研究結果顯示，與Sham 相比，其他4 組cTnI、MDA 水平明顯升高，SOD 水平明顯降低，ROS 產生增多，心肌結構受損，肌絲溶解甚至斷裂，線粒體腫脹，排列紊亂，嵴間隙增寬破裂，SV、EF、FS 明顯降低，提示心肌IRI 模型制備成功。本研究參照文獻[10]，經尾靜脈注射AAV9-UCP2 制備UCP2 過表達小鼠模型，Western blot 結果顯示，與I/R 組相比，AU 組UCP2 表達水平明顯升高，提示UCP2 過表達小鼠模型制備成功。

糖尿病心肌IRI 加重的機制尚未完全闡明，但繼發于高血糖的較高水平的氧化應激，可能會增加糖尿病時心肌對IRI 的易感性[11]。糖尿病患者心肌氧化應激的增加主要由于內源性抗氧化系統受損，內源性自由基清除酶如SOD、過氧化氫酶等活性降低，ROS 清除受阻，破壞了ROS 產生和清除之間的平衡，這種不平衡的加劇可能影響糖尿病患者IRI 的嚴重程度[12]。ROS 是氧化應激水平的主要標志物，在缺血時生成增加，再灌注時激增，被認為是再灌注損傷的主要介質，介導缺血期的細胞損傷和再灌注期的細胞凋亡[13]。線粒體是細胞ROS的主要來源。UCP2 是ROS 產生的負向調節因子，可通過介導質子漏，降低線粒體膜電位，抑制ROS生成，發揮抗氧化應激作用[14]。此外，UCP2 與谷胱甘肽結合后以非活性狀態存在，UCP2 激活后不僅可以減少應激細胞中ROS 的產生，其釋放出來的谷胱甘肽還可降低已產生的ROS[15]。有研究表明，UCP2過表達后可減少ROS 的產生，減輕炎癥反應，改善膿毒癥引起的心肌損傷[16]。

本研究結果顯示，與Sham 組相比，I/R 組UCP2 表達水平明顯增加，Genipin 組UCP2 表達水平明顯降低；且與I/R 組相比，Genipin 組cTnI、MDA 水平明顯升高，SOD 水平明顯降低，ROS產生增多，心肌結構破壞更明顯，細胞廣泛壞死，線粒體顯著腫脹破裂，SV、EF、FS 明顯降低。提示糖尿病小鼠心肌IRI 后會刺激UCP2 表達增加以對抗心肌損傷，然而，在Genipin 抑制UCP2 的表達后，ROS 釋放進一步增加，氧化應激反應增強，心肌組織以及線粒體損傷加重，心功能進一步下降。同時，本研究用AAV9-UCP2 轉染心肌，上調心肌UCP2的表達，結果顯示，與I/R 組相比，AU 組cTnI、MDA 水平明顯降低，SOD 水平明顯升高，ROS產生減少，心肌結構明顯改善，線粒體形態完整，腫脹減輕，嵴清晰可見，SV、EF、FS 明顯升高。以上研究結果均提示UCP2 過表達可以抑制ROS 產生，降低糖尿病小鼠心肌IRI 后的氧化應激水平，恢復線粒體的超微結構，減輕心肌損傷，改善心功能。

綜上，本研究通過建立糖尿病小鼠心肌IRI 模型，發現糖尿病小鼠心肌發生IRI 時，可刺激UCP2上調；用AAV9-UCP2 轉染小鼠心肌時，過表達的UCP2 可以抑制ROS 產生，降低氧化應激水平，減輕糖尿病心肌IRI。