ELP-SOD融合蛋白的純化及其脂質體制備

朱月蓉, 陳星宇, 馮嬌燕, 周奔, 樊燕蓉

(1. 東部戰區總醫院檢驗科, 江蘇 南京 210002; 2. 南京理工大學環境與生物工程學院, 江蘇 南京 210014)

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一類廣泛存在于生物界的金屬酶類,根據其活性中心結合的金屬離子不同,主要可分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD,人類的細胞質中以Cu/Zn-SOD為主要種類。SOD具有催化超氧陰離子自由基發生歧化反應,平衡機體內氧自由基的功能,是生物體防御活性氧毒害的關鍵性防線。SOD較強的抗氧化特性使其在抗輻射、抗衰老、抑制腫瘤等方面具有獨特的功能[1］,在醫藥[2］、食品[3］和化妝品[4］領域亦有較好的應用前景。

最初生產的SOD蛋白大都源自動植物組織,但存在提取工藝相對復雜、產率低、品質不穩定、生產成本較高、有免疫原性等問題[5-6］。歐洲已從1999年禁止動物源SOD用于人類,這推動了從基因工程菌中獲得重組人源SOD的研究。目前重組人源SOD已成功在大腸埃希菌[7-10］、畢赤酵母[11-12］等表達系統中表達,Lin等[9］將重組人源SOD克隆到表達載體,利用大腸埃希菌進行表達,產量為5.9 mg/L培養基。由于以往重組人源SOD蛋白表達量不高,且純化過程通常需要結合親和層析、分子排阻等系列的層析方法,對純化實驗設備要求高,操作較為復雜,因此,開發高效、可行的生產系統以獲得高產量及高活性的人源SOD受到了廣泛關注。

類彈性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELP)是一種人工合成的基因工程化多肽聚合物,主要是(VPGXG)n五肽重復序列[13］,其中Xaa(X)指除了脯氨酸外的氨基酸[14］,通常為纈氨酸、丙氨酸、甘氨酸等氨基酸,Xaa(X)可以由除了脯氨酸外的單一氨基酸組成,也可以由上述幾種氨基酸以不同比例組成,重復單元n通常為20～120不等。ELP蛋白單獨或與外源蛋白在N端或C端形成融合蛋白表達時具有相轉變特性,即達到一定溫度時ELP蛋白或ELP融合蛋白能發生從溶液到凝聚態的可逆轉變,隨著體系降低到一定溫度,則又能恢復溶液態[15］。因此,利用ELP融合蛋白可逆的溫度相變特性,通過簡單離心就能分離重組蛋白,實現重組蛋白的可逆相變循環(inverse transition cycling,ITC)非色譜純化[16］,這種蛋白純化方法有著經濟高效的顯著優勢,因而廣泛應用于蛋白純化標簽[17-18］。

基于ELP融合蛋白的可逆熱相變性特性,本研究采用基因工程法生產一種由ELP與人源Cu/Zn-SOD連接的ELP-SOD融合蛋白,經過三輪ITC獲得純化人源重組Cu/Zn-SOD,研究了該融合蛋白的穩定性、模擬了體內半衰期和細胞毒性,并且結合脂質體包裹技術,制備了ELP-SOD脂質體,分析了脂質體包裹后ELP-SOD的半衰期及透皮效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 構建質粒pET28a-SOD-ELP40,并導入大腸埃希菌BL21·DE3中進行表達[18］,篩選鑒定陽性表達菌株。

1.1.2 試劑 IPTG、考馬斯亮藍R-250購自生興生物技術有限公司;EGTA、PEG-8000購自生工生物工程股份有限公司;鄰苯三酚購自上海百靈威化學技術有限公司;RPMI細胞培養基、DMEM低糖培養基購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自德國Capricorn公司;卵磷脂、膽固醇購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 試劑配制 PBS(1 L):氯化鈉8 g,氯化鉀0.2 g,十二水合磷酸氫二鈉3.49 g,磷酸二氫鉀0.2 g,用超純水溶解并定容至1 L,用0.1 mol/L鹽酸調pH至7.4;LB培養基(1 L):氯化鈉5 g,胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,用超純水溶解補水至1 L。大腸埃希菌裂解液(1 L):20 mL PBS(pH 7.2),29.2 g氯化鈉,2.5 mL Tween-20,0.7 mL β-巰基乙醇,20 mL EDTA(0.5 mol/L,pH 8.0),20 mL EGTA(0.5 mol/L,pH 7.0),用超純水溶解并定容至1 L。

1.1.4 儀器與設備 超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司;凝膠成像系統購自上海天能生命科學有限公司;多功能酶標儀購自瑞士TECAN公司;紫外分光光度計購自上海美析儀器有限公司;二氧化碳培養箱購自日本SANYO公司;熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司;旋轉蒸發儀購自上海市愛朗儀器有限公司;納米粒度儀ZS90購自馬爾文儀器有限公司;TP-6透皮擴散儀購自天津市精拓儀器科技有限公司。

1.2 重組人源SOD的表達及鑒定[18］

委托南京金斯瑞生物科技有限公司提前合成ELP[H33V7] 40基因預先插在pET28a載體的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ之間;其中,ELP[H33V7] 40的N端含有N10,C端含有R9,形成pET28a-N10-ELP40-R9(pET28a-ELP40)載體。

委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成SOD(Cu/Zn-SOD,EC 1.15.1.1,GenBank:AY049787)的PCR引物(內有NdeⅠ或BamH Ⅰ酶切位點)。PCR條件為95 ℃預變性5 min;95 ℃變性25 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸25 s,循環30次;72 ℃延伸10 min,10 ℃保溫。PCR引物序列上游:5′-CGCCATATGGCGACGAAGGCCGTGTGCG-3′,下游:5′-CGCGGATCCCTGCGCAATACCGATAACGCCG-3′。

分別將SOD基因的PCR產物與pET28a-ELP40載體通過NdeⅠ和BamH Ⅰ雙酶切和試劑盒純化,按照NEB公司的M2200S Quick ligation kit說明書分別連接SOD的PCR酶切產物和含有ELP[H33V7] 40的pET28a-ELP40載體的雙酶切產物,按照試劑盒說明書連接,通過導入DH5α感受態,37 ℃卡那霉素抗性平板菌落培養,挑取單克隆菌落于3 mL含有終濃度為50 μg/mL的卡那霉素的普通LB培養液37 ℃搖菌過夜,PCR鑒定單克隆菌陽性后,用質粒提取試劑盒提取表達質粒,酶切鑒定陽性后,質粒為pET28a-ELP40-SOD。

提取質粒,轉導到大腸埃希菌表達菌BL21·DE3感受態,挑取單克隆菌,在15 mL試管中加入3 mL含有終濃度為50 μg/mL的卡那霉素的普通LB培養液37 ℃搖菌過夜;然后在50 mL試管中加入10 mL含有終濃度為50 μg/mL的卡那霉素的普通LB培養液,加入0.5 mL菌液37 ℃搖菌2～3 h,當光密度(D)值達到0.4～0.6時,加入1 mmol/L的IPTG 37 ℃搖菌表達4 h,或先將菌液降溫至15 ℃,再加入1 mmol/L的IPTG 15 ℃搖菌表達16 h。分別收集1 mL表達菌,8 000 r/min離心5 min,加入100 μL電泳緩沖液,超聲破碎,100 ℃加熱10 min,離心,分別收集全菌液、沉淀和上清液。SDS-PAGE電泳鑒定表達菌中ELP-SOD融合蛋白表達分子量和表達量。

1.3 ELP-SOD融合蛋白的純化及酶活性測定

取200 μL攜帶目的蛋白基因(質粒為pET28a-ELP40-SOD)的高表達大腸埃希菌(-80 ℃冷凍)接種于500 mL LB培養基中,37 ℃、140 r/min搖床培養20 h,以2%的接種量轉接于1 L的LB培養基,37 ℃培養至D(600 nm)達到0.6,加入1 mmol/L的IPTG 37 ℃搖菌表達4 h后收取發酵液。

粗酶液提取:培養好的發酵液以3 000 r/min離心20 min,收集菌泥,加3倍體積的大腸埃希菌裂解液溶解一定時間,進行1次超聲-凍融循環,即超聲一次(750 W,10 min),-80 ℃冷凍,取出溶解,13 000 r/min離心20 min,收集上清液,保存于-80 ℃冰箱。此上清液即為粗酶提取液。

ITC純化蛋白:取適量粗酶液加入1.5 mol/L NaCl,4 ℃冰浴1 h;13 000 r/min、4 ℃離心20 min,取上清液,加20 mg/mL PEG-8000,37 ℃水浴20 min;13 000 r/min、37 ℃離心20 min,棄上清液,沉淀加適量PBS溶解,此為1個循環,總共循環3次。

ELP-SOD純度檢測:對純化的酶液進行SDS-PAGE,通過Tanon3500凝膠成像系統掃描得到電泳圖片,并利用Image studio軟件對電泳圖片進行條帶純度分析。

ELP-SOD酶活性測定:采用改良的鄰苯三酚自氧化法(325 nm法)測定SOD融合蛋白的酶活性。酶活單位定義:在一定條件下,1 mL的反應液中,每分鐘控制鄰苯三酚在325 nm波長處的自氧化速率達50%時的酶量定為一個活力單位,測得數據按下列公式計算酶活性:

A1:鄰苯三酚自氧化速率,單位為D/min;A2:加入SOD酶液后的自氧化速率,單位為D/min;a:鄰苯三酚的用量(mL);b:SOD酶液的用量(mL)。

1.4 ELP-SOD融合蛋白的pH穩定性測定

將10 mmol/L PBS用NaOH或HCl溶液分別調pH至3.0、5.0、7.0、7.4、8.0、9.0、11.0,純化所得的酶液用不同pH的PBS進行10倍稀釋,每個pH梯度設置3個平行,于25 ℃水浴鍋溫育2 h后測定各組酶活[19］,以pH 7.4的PBS稀釋處理的酶液作為初始酶活,得到酶活保留率與溶液pH的關系曲線。

1.5 ELP-SOD融合蛋白的熱穩定性測定

將純化所得的酶液取適量分別于25 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃水浴30 min后[20］,冷卻至室溫,測定各組酶活,每個溫度梯度設置3個平行,以25 ℃水浴30 min的酶液為初始酶活,得到酶活保留率與溫度的關系曲線。

1.6 添加Cu2+/Zn2+后ELP-SOD酶活性測定

將純化的ELP-SOD蛋白與最佳終濃度的Cu2+/Zn2+(Cu2+濃度為0.90 mmol/L、Zn2+濃度為0.45 mmol/L)混合,蛋白的終濃度為0.04 mg/mL,每組設3個平行,4 ℃反應1、2、4、10、16 h時取樣用鄰苯三酚法測定ELP-SOD酶活。之后,取5 mL酶液于透析袋(8 000～14 000 Da)中,冰浴透析,4 h換1次液,同時取透析袋內蛋白溶液0.3 mL,測定蛋白溶液中剩余Cu2+濃度,直至達到標準后停止透析。測定透析前后SOD-ELP的酶活,分析透析過程對SOD-ELP酶活的影響。

1.7 ELP-SOD融合蛋白的模擬體內半衰期[21］

SPF級SD大鼠進行股動脈取血,以大鼠血漿進行模擬體內半衰期實驗。實驗分3組,實驗組為ELP-SOD(0.25 mg/mL),陽性對照組為純化SOD蛋白(購自杭州紐龍生物科技有限公司,0.25 mg/mL),空白對照組為PBS溶液。實驗時每組樣品液含有50%大鼠血漿、40% PBS及10%各自對應的蛋白(空白對照組為PBS補足體積),加入后混勻,靜置于37 ℃恒溫培養箱中培養0、2、4、6、8、10、20、32、48 h后分別取樣測定酶活,并按下式計算半衰期[19］:

t1/2:半衰期(酶活力下降為初始酶活的一半所經歷的連續工作的時間,單位為h);E0:初始酶活;E:t時的酶活力。

1.8 ELP-SOD融合蛋白細胞毒性試驗

利用MTT法檢測ELP-SOD對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和小鼠成纖維細胞(L929)的毒性。HUVEC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基,L929細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基,分別置于37 ℃、5% CO2濃度的培養箱中進行培養。細胞生長至80%～90%時,用0.25%的胰酶進行消化,1 000 r/min離心5 min收集細胞,PBS洗滌2次,然后用相應的培養基配成5×104個/mL的細胞懸液備用。分別將兩種細胞懸液接種于96孔板中,每孔100 μL,于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h。

吸去原培養液,用PBS清洗1次,每孔加入100 μL用培養基(含2.5%胎牛血清)稀釋的ELP-SOD蛋白酶液。分為4個濃度梯度,分別為1.5%、3%、6%、12%(對應酶活性分別為10.5、21.0、42.0、84.0 U/mL),每組設置9孔平行樣,于37 ℃、5% CO2條件下分別培養24、48、72 h。對照組每孔加100 μL RPMI細胞培養基(含2.5%胎牛血清)。

培養結束后,每孔加入10 μL配置好的MTT溶液(5 mg/mL),放入細胞培養箱繼續孵育4 h;吸棄孔內培養液,每孔加入100 μL DMSO,輕輕敲打96孔板框架使其充分溶解,用酶標儀在490 nm處測定D值。增殖抑制率(%)=(空白對照組D值-實驗組D值)/空白對照組D值×100%。

1.9 ELP-SOD融合蛋白脂質體制備及包封率測定

薄膜水化法制備ELP-SOD脂質體:將總膜材濃度為9.6 mg/mL的卵磷脂和膽固醇(質量比為2∶1)溶于一定體積氯仿中,30 ℃旋轉蒸發除去氯仿,在茄形瓶內壁形成一層均勻的脂膜,加入一定體積ELP-SOD融合蛋白(0.25 mg/mL,溶于pH 6.8的PBS中),在37 ℃水浴下水化一段時間,所制得的ELP-SOD脂質體用超聲細胞破碎儀在260 W條件下超聲10 min,接著依次濾過0.45 μm濾器和0.22 μm濾器,4 ℃無菌保存備用。經ZS90納米粒度儀測量ELP-SOD脂質體的平均粒徑、電位和聚合物分散性指數(PDI),以衡量ELP-SOD脂質體的大小、電荷量和均一度。

ELP-SOD脂質體酶活包封率的測定:取一定體積的ELP-SOD脂質體于100 kD超濾管(Amicon,Ultra-4),5 000×g離心20 min,收集濾液并且記錄濾液體積,濾液即為游離的ELP-SOD,測定濾液酶活性。ELP-SOD脂質體用1%的Triton X-100破膜0.5 h,得到破膜的脂質體,經過適當稀釋后測定ELP-SOD的總活性。酶活包封率計算公式如下:

A:ELP-SOD的總活性(U/mL);a:超濾時加的ELP-SOD脂質體體積(mL);B:超濾得到的濾液活性(U/mL);b:超濾得到的濾液體積(mL)。

ELP-SOD脂質體蛋白包封率的測定:按上述方法用超濾管分離游離的ELP-SOD,實驗采用BCA試劑盒法(美國THERMO公司)測定濾液的蛋白濃度,并按照下式計算ELP-SOD脂質體的蛋白包封率:

a:超濾時加的ELP-SOD脂質體體積(mL);C1:ELP-SOD脂質體總蛋白濃度(mg/mL);b:超濾得到的濾液體積(mL);C2:濾液蛋白濃度(mL)。

1.10 ELP-SOD脂質體的模擬體內半衰期

以大鼠血漿進行模擬體內半衰期實驗。實驗分3組,實驗組為ELP-SOD脂質體,陽性對照組為同法制備的SOD脂質體(SOD蛋白購自杭州紐龍生物科技有限公司),空白對照為PBS溶液。實驗時每組樣品液體積中50%大鼠血漿、40% PBS及10%各自對應的脂質體(陰性對照組為PBS補足體積),加入后混勻,靜置于37 ℃恒溫培養箱中培養0、2、4、6、8、10、20、32、48 h后分別取樣測定酶活,并按照步驟“1.7”給出的公式計算ELP-SOD脂質體的半衰期。

1.11 ELP-SOD脂質體的透皮效應

小鼠離體皮膚的制備:取6只健康SPF級雄性ICR小鼠頸椎脫臼處死,用脫毛劑將小鼠腹部皮膚脫毛處理,用生理鹽水洗凈殘留在小鼠腹部的脫毛劑后,剝下小鼠腹部皮膚,用鑷子刮凈離體皮膚內側的組織,用PBS浸泡離體皮膚備用。

體外透皮實驗:采用TP-6透皮擴散儀進行體外釋放實驗。用Franz擴散池考察ELP-SOD脂質體運載ELP-SOD的透皮效率。Franz擴散池由上下兩個磨口玻璃容器對合而成,分為接收池和供給室,釋藥面積為1.13 cm2,接收池的容積為15 mL。實驗時取15 mL PBS充滿Franz接收池,加入磁性轉子,將小鼠皮膚用不銹鋼夾固定于接收池與供給室之間(內側皮膚朝下,與PBS接觸,且不能有氣泡殘留),供給室分別加入ELP-SOD脂質體0.5 mL和0.25 mg/mL ELP-SOD蛋白溶液0.5 mL,將Franz擴散池置于37 ℃恒溫水池,調節磁力攪拌器轉速為350 r/min,每隔2 h取大約1 mL樣品,然后用等量PBS補足體積,持續24 h,每組設6個平行樣。

分別測定兩組樣品的SOD酶活性(ELP-SOD脂質體組需加Triton X-100破膜,Triton X-100終濃度為0.5%),按照以下公式計算ELP-SOD脂質體的透過率:透過率(%)=(a×b/c×d)×100%;其中,a:Franz擴散池總體積(mL);b:取樣測得的樣品SOD活性(U/mL);c:供給室加入樣品體積(mL);d:加樣前樣品SOD活性(U/mL)。

1.12 統計學分析

2 結果

2.1 ELP40-SOD的表達量檢測結果

以牛血清白蛋白(BSA)作為測量標準品,GS-900成像儀(SH1WBA10698)進行凝膠透射圖像掃描(圖1),測算SDS-PAGE圖中目的蛋白的表達水平。對比電泳圖上的蛋白標準參照物(Marker)可以看出,目的蛋白ELP40-SOD的分子量在48 kDa左右,在普通LB培養基采用普通搖床進行37 ℃表達4 h,pET28a載體表達的ELP40-SOD量最高是10 mg/L。

1、2分別為牛血清白蛋白標準品1 μg、2 μg;3為未加IPTG誘導樣品全菌裂解液;4、8、9分別為用15 ℃ 16 h表達的全菌裂解液、裂解液上清和沉淀;5、6、7分別為37 ℃表達4 h的全菌裂解液、裂解液上清和沉淀;10、11分別為37 ℃表達4 h的細菌裂解液沉淀和上清。ELP40-SOD的最高表達量(箭頭指示)測定為10 mg/L

2.2 ELP-SOD融合蛋白的純化結果

由圖2可見,經第一輪ITC純化后,蛋白溶液中除了ELP-SOD外還有較多其他雜蛋白,需要繼續純化;粗酶液經三輪ITC純化后,SDS-PAGE蛋白電泳顯示ELP-SOD融合蛋白可以基本達到電泳純。ITC純化蛋白一般循環3～5次,融合蛋白經三輪ITC純化,目的蛋白的純度已經達到95%以上,兼顧蛋白得率考慮,因此ELP-SOD融合蛋白純化進行三輪ITC。圖3為三輪ITC純化后的ELP-SOD,經鄰苯三酚自氧化法沉淀,通過Image studio軟件分析可得純度為97.8%,酶比活達到4 894.5 U/mg,得率為0.96 mg/L,其中純化倍數5.98,恢復率28.5%。說明用三輪ITC法純化ELP-SOD融合蛋白可以基本達到電泳純,純化后的蛋白酶比活較高,且純化過程僅需控溫離心,操作簡便,因此后續實驗所用的ELP-SOD融合蛋白均由三輪ITC法純化。

1:全菌裂解液;2:裂解液沉淀;3:裂解液上清;4:粗酶液一輪ITC純化后樣品;5:三輪ITC純化后樣品

1-4為ITC三輪純化后的4個平行樣品

2.3 ELP-SOD融合蛋白的pH穩定性

將目的蛋白用不同pH的緩沖液進行稀釋,以考察pH對ELP-SOD融合蛋白酶活性的影響。實驗結果見圖4,ELP-SOD在pH 5.0～8.0的范圍內酶活均能保留在90%以上,說明該范圍內的pH對酶活影響較小,蛋白較為穩定。當pH>8.0或者pH<5.0時,酶活下降較快,但是仍保持在80%以上,因此,ELP-SOD融合蛋白在一定pH范圍內能保持較高的穩定性。

圖4 ELP-SOD融合蛋白pH穩定性曲線

2.4 ELP-SOD融合蛋白的熱穩定性

將目的蛋白在不同溫度下保持一定時間,以考察溫度對ELP-SOD融合蛋白酶活性的影響。由圖5可見,當溫度低于60 ℃時ELP-SOD的活性較為穩定,溫度超過60 ℃后酶活急劇下降,到80 ℃時ELP-SOD融合蛋白幾乎完全失活。因此,ELP-SOD在溫度小于60 ℃的環境下有較好的穩定性。

圖5 ELP-SOD融合蛋白溫度穩定性曲線

2.5 外源添加Cu2+和Zn2+提高ELP-SOD酶活性

外源添加Cu2+和Zn2+可以有效提高ELP-SOD的酶活性,其酶活隨作用時間的變化曲線如圖6所示,在1 h之內酶活迅速升高,已經達到初始酶活的416%,之后的16 h內酶活沒有顯著提升(t檢驗結果顯示各點沒有顯著性差異),因此酶液與Cu2+/Zn2+混合液于4 ℃反應1 h即可達到穩定,酶活達到8 281 U/mg。該蛋白混合液于透析袋中冰浴透析72 h后,溶液中殘留的Cu2+和Zn2+濃度小于10 ppm,符合中國藥典對于SOD中重金屬含量的標準,透析后的酶活為7 291.2 U/mg,是透析前酶活的88%。

圖6 外加Cu2+/Zn2+混合液提高ELP-SOD酶活隨時間的變化曲線

2.6 ELP-SOD融合蛋白的模擬體內半衰期實驗結果

由圖7可以看出,隨著孵育時間的延長,ELP-SOD融合蛋白和SOD純品都具有較好的穩定性,例如在37 ℃孵育48 h后,空白對照組酶活僅為初始酶活的53.4%,SOD組酶活為初始酶活的78.4%,而ELP-SOD組仍保留了84.1%。此外,ELP-SOD融合蛋白的半衰期為(59.00±5.95)h,SOD的半衰期為(49.80±6.92)h,差異有統計學意義(t=6.965,P<0.05)。由此可見,融合蛋白中ELP的加入不僅簡化了蛋白純化過程,而且能夠有效保留酶活性,延長酶在體內的模擬半衰期。

圖7 ELP-SOD在血漿中的酶活保留率隨時間的變化

2.7 ELP-SOD融合蛋白細胞毒性實驗結果

如圖8及圖9所示,含有不同濃度ELP-SOD的培養基分別與HUVEC和L929細胞孵育,在24 h內對細胞增殖有一定的促進作用;在孵育48 h后,ELP-SOD對于HUVEC增殖沒有明顯的促進或者抑制作用,而在低濃度下對于L929細胞仍存在一定的促進作用;當含有ELP-SOD的培養基與細胞共孵育72 h時,對于HUVEC細胞在高濃度下(42、84 U/mL)出現一定的抑制作用,而對L929細胞的增殖仍然沒有顯著抑制和促進作用。實驗結果表明,低濃度的ELP-SOD對于細胞增殖有促進作用,當濃度較高(84 U/ml)且孵育時間夠長時(72 h)才開始表現出一定的增殖抑制(<30%),因此可以說明ELP-SOD有較好的生物安全性。

*:P<0.05

圖9 不同濃度ELP-SOD對L929細胞增殖的影響

2.8 ELP-SOD融合蛋白脂質體制備

經ZS90納米粒度儀測量,ELP-SOD脂質體的粒徑分布情況如圖10所示,脂質體的粒徑分布呈現單峰的正態分布,平均粒徑小于200 nm(124.8 nm),PDI小于0.3(0.137),說明該脂質體的均一度好,粒徑較小且分布均勻。脂質體表面所帶的電荷接近20 mV(-19.7 mV),這使脂質體保持較為穩定的形態,不易發生聚集。ELP-SOD脂質體的蛋白包封率為80.8%±3.42%,活性包封率為81.5%±2.17%,都高于80%,說明該脂質體能夠對ELP-SOD融合蛋白進行有效的包裹。

圖10 ELP-SOD脂質體的粒徑分布圖

2.9 ELP-SOD脂質體的模擬體內半衰期實驗結果

如圖11所示,隨著孵育時間的增加,以ELP-SOD融合蛋白或SOD制備的脂質體都具有較好的穩定性,但ELP-SOD脂質體的半衰期達到(73.90±1.69)h,高于SOD脂質體(63.40±6.61)h,兩組差異有統計學意義(t=4.333,P<0.05),且ELP-SOD融合蛋白的半衰期(59.00±5.95)h與ELP-SOD脂質體的半衰期相比也有統計學差異(t=14.189,P<0.001)。結果表明ELP-SOD融合蛋白制備成脂質體后可以有效延長其在血漿中的半衰期。

圖11 ELP-SOD脂質體在血漿中的酶活保留率隨時間的變化

2.10 ELP-SOD脂質體的透皮實驗結果

如圖12所示,與ELP-SOD融合蛋白相比,其脂質體能夠很快透皮擴散入接收池中,8 h達到最高29.93%。之后雖稍有下降,在24 h最低仍然可達到20%左右,高于ELP-SOD融合蛋白,說明脂質體包裹ELP-SOD融合蛋白能夠加強其透皮效率。

圖12 ELP-SOD脂質體透皮實驗結果

3 討論

ELP具有逆向溫度相變特性,其作為標簽制備的融合蛋白能隨溶液溫度或鹽濃度改變從可溶性狀態變為不溶性狀態,因此融合蛋白可用離心、超濾等簡單、快速、經濟的方法進行融合蛋白分離,尤其便于規?；苽?。此外,ELP標簽不改變融合蛋白二級結構及酶活,ELP融合蛋白能增加蛋白溶解性,維持其生物活性和物理性質;ELP標簽增加蛋白穩定性主要包括提高酶的熱穩定性、化學穩定性、抵御酶失活和延長酶的半衰期[22］。本研究將人源SOD與ELP進行融合表達,目的就是在保留蛋白酶活的同時簡化純化工藝和降低成本。本實驗利用重組大腸埃希菌表達ELP-SOD融合蛋白,結果提示在37 ℃誘導4 h表達量最高,而且目的蛋白主要在菌液裂解液上清中,最高表達量為10 mg/L。為了提高純化效率,本實驗通過對ITC純化方案中的一些條件進行優化,經過三輪ITC純化得到該目的蛋白,其最終純度為97.8%,酶比活為4 894.5 U/mg。而且ELP-SOD融合蛋白在pH在5.0～8.0的范圍、溫度低于60 ℃有較好的穩定性。以大鼠血漿對ELP-SOD進行模擬體內半衰期實驗,結果顯示ELP的接入對于SOD的半衰期有一定的延長作用。細胞毒性實驗證明ELP-SOD對HUVEC和L929細胞的增殖影響較小,有較好的生物安全性。

針對ELP-SOD作為生物大分子在實際應用中可能存在的生物利用率低、易被蛋白酶分解等問題,本實驗結合脂質體包裹技術,制備了ELP-SOD脂質體,平均粒徑為124.8 nm,電位-19.7 mV,包封率達到80%以上,且模擬體內半衰期實驗表明脂質體能進一步有效延長ELP-SOD融合蛋白的半衰期。并且ELP-SOD脂質體的透皮效率明顯高于ELP-SOD融合蛋白,說明脂質體的包裹促進了ELP-SOD的透皮效應,有助于該融合蛋白進入皮膚發揮作用,提高生物利用度,這在皮膚科局部外用藥物、日用化妝品等方面將會有很好的發展前景。

本實驗采用基因工程法構建了ELP-SOD融合蛋白,利用其可逆熱相變性簡化了純化步驟,降低了純化成本,解決了SOD來源的問題。后續研究中還可以對大腸埃希菌的發酵條件進行優化,提高ELP-SOD的產量;也可以通過實驗在大腸埃希菌培養基中直接添加一定濃度和比例的Cu2+、Zn2+,來進一步提高ELP-SOD融合蛋白的初始酶活,為重組人源SOD在醫療、保健、化妝品等領域的應用奠定基礎。