用于炎癥治療的磷脂酰絲氨酸修飾胞外囊泡納米遞藥系統的初步構建與評價

閆潔, 常恬, 章竟, 葛廣榮, 陳九源, 霍強, 程秀

(蚌埠醫學院藥學院, 安徽 蚌埠 233030)

炎癥是機體對抗各種有害刺激的自我保護反應。當炎癥反應過度或不適當時會導致多種疾病的發生,如慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病等[1-2］。槲皮素(quercetin,Que)是一種廣泛存在的天然黃酮類化合物,可以減輕炎癥癥狀、抑制炎癥反應的發生發展,具有潛在的治療效果[3］。研究表明[4］,Que能夠抑制巨噬細胞向促炎M1型極化,同時減少炎性因子TNF-α、IL-6的分泌,從而抑制炎癥的發展。但因其難溶于水,在體內易分解導致生物利用度低,限制了Que的應用[5］。通過納米載體系統遞送Que能夠有效地改善這些不良性質,提高藥物的療效和穩定性,成為改善Que類天然藥物的重要策略[6-7］。但是傳統的納米遞送系統還存在著易被免疫系統清除、毒性等問題。鑒于這些缺陷,越來越多的研究者開始利用源自細胞膜材料或細胞分泌的胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)構建天然納米遞送載體[8-9］。作為天然生物材料,細胞及其衍生物具有良好的生物相容性和相應的生理功能(如長循環、主動趨化能力等),為載體靶向遞送帶來了新的轉機。巨噬細胞作為機體重要的免疫細胞,在炎癥反應部位會被大量招募,并通過自身的極化以及分泌的各種細胞因子調節炎癥[10-11］。因此,利用巨噬細胞來源的EVs遞送Que,有利于巨噬細胞對藥物的同源攝取。磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)是一種負電荷磷脂,一般存在于細胞膜內側,當細胞發生凋亡時,細胞會生成凋亡小體,同時PS外翻,釋放凋亡信號,促進炎癥部位招募巨噬細胞的攝取吞噬[12-13］。在本研究中,通過將PS修飾到EVs的表面模擬凋亡小體,促進EVs被巨噬細胞吞噬攝取。因此,本研究通過PS修飾的EVs遞送Que(PS-EVs@Que)提高藥物的穩定性和生物利用度,旨在為炎癥治療方面的制劑開發提供新的參考與建議。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

RAW264.7巨噬細胞(上?？茖W院);胎牛血清(美國Gibco公司);DMEM培養基(大連美侖生物科技有限公司);BCA蛋白定量試劑盒、青霉素-鏈霉素溶液、DiO熒光染料、脂多糖(LPS)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、ELISA試劑盒(江蘇碧云天生物技術公司);兔抗TSG101、鼠抗CD81、鼠抗CD63(Proteintech Group生物技術有限公司);兔抗iNOS單克隆抗體(美國Abcam公司);PS和Que(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 細胞培養

巨噬細胞(RAW264.7)培養于含10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素溶液DMEM培養基中,置于37 ℃,5%的CO2細胞培養箱中培養。

1.3 提取RAW264.7細胞的EVs

RAW264.7細胞生長至70%～80%融合度時,更換培養基為無血清培養基,繼續培養48 h后收集細胞上清液,上清液在4 ℃條件下,300×g離心10 min、2 000×g離心20 min、10 000×g離心30 min、100 000×g離心70 min。舍棄上清液,用PBS重懸沉淀得到巨噬細胞來源的EVs溶液,-80 ℃冰箱保存備用。

1.4 RAW264.7細胞來源EVs的表面標志物鑒定

提取的EVs與上樣緩沖液混勻,95 ℃加熱5 min使蛋白變性。將樣品和蛋白標準參照物按順序依次緩慢加入含有預先配置的凝膠加樣孔中,進行電泳(75 V、30 min,100 V、90 min)電泳結束后,取出凝膠,將蛋白轉移至PVDF膜上。然后加入待檢測蛋白對應的一抗(抗TSG101、CD81、CD63),4 ℃孵育過夜。洗膜后,室溫條件下分別孵育對應的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG二抗2 h,再次洗膜后與發光劑反應并使用化學發光成像系統曝光并拍照。

1.5 PS-EVs@Que的制備

離心管內加入100 μL EVs溶液(1 mg/mL),再向管中加入100 μL PBS稀釋后的Que(1 mg/mL)甲醇溶液。將上述離心管懸浮在超聲儀中進行脈沖式間隔超聲(120 W,30 s),超聲載藥后取出置于冰上冰浴10 min。重復3次,將離心管放入37 ℃恒溫水浴鍋內,孵育1 h以恢復EVs的膜穩定性。將液體轉移至超濾管(截留分子量100 kD)中離心,補充100 μL PBS至超濾管內重懸后反復超濾,最終在上層內管得到EVs@Que。然后將20 μL PS(1 mg/mL)加到EVs@Que中,混勻后在37 ℃恒溫箱中孵育30 min。利用超濾管濾除多余的PS最終得到PS-EVs@Que。

1.6 仿生納米藥物的表征

1.6.1 EVs、EVs@Que、PS-EVs@Que納米顆粒追蹤分析(NTA)檢測 取EVs、EVs@Que、PS-EVs@Que溶液,用PBS稀釋至測量濃度,采用ZetaView納米顆粒追蹤分析儀(德國PMX公司)測量樣品的粒徑,重復3次。

1.6.2 EVs、EVs@Que、PS-EVs@Que透射電鏡(TEM)檢測 制備得到的EVs、EVs@Que、PS-EVs@Que溶液適當稀釋后,分別取5 μL滴加在200目有碳支持膜的銅網上,常溫放置2 h,干燥后用透射電鏡觀察樣品的結構。

1.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

將EVs、EVs@Que、PS-EVs@Que提取蛋白后進行BCA定量,按一定比例與上樣緩沖液混合均勻,95 ℃加熱5 min使蛋白變性。將樣品和蛋白標準參照物按順序依次緩慢加入含有預先配置的凝膠加樣孔中進行電泳(75 V、30 min,100 V、90 min)。結束后取出凝膠,用快速考馬斯亮藍染色液染色30 min,脫色2 h后拍照并分析。

1.8 仿生納米藥物的制劑評價

1.8.1 檢測波長的選擇 稱取一定質量的Que,用甲醇溶液稀釋,用紫外分光光度計進行掃描確定其檢測波長。

1.8.2 Que標準曲線的制備 用甲醇溶解Que配制成1 mg/mL的溶液,稀釋成2.6、4.2、5.7、7.3、8.8、10.4 μg/mL的Que標準工作液。用紫外分光光度計測定標準工作液在369 nm波長處的光密度(D),并繪制標準曲線。

1.8.3 包封率與載藥量的測定 按“1.5”的方法制備出PS-EVs@Que,通過BCA定量確定EVs(1 mg/mL)的量,加入100 μL不同濃度的Que(Que的加入量設為20、40、60、80、100、200、400 μg),超聲載藥處理后將PS加到EVs@Que中,混勻孵育后將所得藥物在超濾管中離心,分離EVs和未被包封的Que,用紫外分光光度計測定下層管中含游離Que溶液D(369 nm)值,根據Que溶液的標準曲線,計算出游離藥物質量。按以下公式計算包封率EE(%)和載藥量DLC(%):

EE(%)=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%

DLC(%)=(Wtotal-Wfree)/Ntotal×100%

式中,Wtotal:Que的投藥量;Wfree:溶液中游離的Que質量;Ntotal:包載Que的納米粒的總質量

1.9 CCK-8實驗檢測Que對巨噬細胞的毒性

將巨噬細胞接種于96孔板中,培養箱培養過夜后加入含不同濃度Que的培養基,繼續培養24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑培養箱孵育1 h,酶標儀檢測450 nm處的D值,空白培養基作為對照組。按以下公式計算細胞活力:

1.10 PS-EVs@Que的細胞攝取實驗

取適量稀釋好的親脂性DiO染料分別添加到載藥修飾的EVs中,置于37 ℃下避光孵育1 h,使用超速離心機在4 ℃下120 000×g離心70 min去除上清液中多余未結合的染料,得到DiO標記的EVs@Que和PS-EVs@Que。RAW264.7細胞接種在共聚焦小皿中,細胞培養箱中過夜使其貼壁,分別向共聚焦小皿中加入DiO標記的EVs@Que和PS-EVs@Que,分別置于細胞培養箱中避光孵育4 h。4%多聚甲醛固定細胞后用Hoechst 33258染細胞核,在激光共聚焦顯微鏡下觀察巨噬細胞對EVs的攝取情況。

1.11 蛋白質印跡法檢測巨噬細胞中極化標志物iNOS的蛋白表達

取對數生長期的RAW264.7細胞種板,將細胞分為對照組、LPS組、LPS+EVs@Que組、LPS+PS-EVs@Que組,除對照組外,其余各組均使用LPS(1 μg/mL)刺激巨噬細胞4 h后,給藥組分別給予EVs@Que、PS-EVs@Que(Que含量20 μmol/L)處理巨噬細胞4 h;更換新的培養基繼續培養12 h,細胞刮收集細胞,PBS洗滌后置于冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min離心30 min。采用BCA法測定蛋白濃度后,取蛋白樣品加入適量上樣緩沖液,于SDS-PAGE分離,然后將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上,室溫封閉后將膜與一抗iNOS抗體4 ℃孵育過夜,洗膜后再加入相應二抗室溫孵育2 h,再次洗膜后與發光劑反應并使用化學發光成像系統曝光并拍照。應用Image J分析軟件檢測并分析條帶的灰度值。

1.12 ELISA法檢測IL-6和TNF-α的濃度

取對數生長期的RAW264.7細胞種板,將細胞分為對照組、LPS組、LPS+Que組、LPS+EVs@Que組、LPS+PS-EVs@Que組,除對照組外,其余各組均使用LPS(1 μg/mL)刺激巨噬細胞4 h后,給藥組分別給予Que、EVs@Que、PS-EVs@Que(Que含量20 μmol/L)處理巨噬細胞4 h;更換新的培養基繼續培養12 h,鋪板干預后收集各組細胞培養上清液,根據說明書應用ELISA試劑盒檢測RAW264.7細胞培養上清液中IL-6和TNF-α的含量。

1.13 統計學分析

2 結果

2.1 RAW264.7細胞EVs的鑒定

透射電子顯微鏡觀察到EVs形態呈圓形或類圓形雙層膜杯狀結構,粒徑大小在100 nm左右。NTA結果顯示EVs粒徑主要分布在(104.06±2.15)nm。使用蛋白免疫印跡法檢測EVs的標志蛋白表達,結果顯示EVs陽性表達標志性蛋白TSG101、CD81和CD63,并且EVs上清液中蛋白表達呈陰性。驗證了RAW264.7細胞來源EVs的成功提取。見圖1。

A:透射電子顯微鏡下觀察EVs結構形態;B:NTA檢測EVs顆粒直徑;C:蛋白質印跡檢測EVs表面標志蛋白TSG101、CD81、CD63

2.2 EVs@Que和PS-EVs@Que的粒徑分布及形態學考察

EVs形態均呈雙層膜杯狀結構,載藥后EVs@Que粒徑為(110.53±1.15)nm,經PS修飾后粒徑增至(118.45±0.97)nm,載藥修飾后EVs的粒徑逐漸增大,形態沒有明顯變化,均呈類圓形。EVs@Que及PS-EVs@Que蛋白染色條帶與EVs染色的蛋白位置相似,顏色基本一致,表明修飾載藥后EVs的基本蛋白被很好地保留下來。見圖2。

A:透射電子顯微鏡下對比超聲處理載藥及修飾前后的EVs結構形態;B:NTA分析超聲載藥及修飾前后EVs顆粒直徑變化;C:考馬斯藍染色對比載藥前后EVs表面蛋白的變化

2.3 PS-EVs@Que的制劑學評價

2.3.1 Que檢測波長的確定 紫外分光光度計掃描200～600 nm波長范圍內紫外吸收,結果如圖3所示,確定其紫外吸收峰在369 nm處。

圖3 Que光密度曲線

2.3.2 Que標準曲線的建立 以Que的濃度為橫坐標,D值為縱坐標,對測定結果做線性回歸曲線,得到Que的標準曲線。如圖4所示,Que的標準曲線為y=0.086 4x+0.014 3,R2=0.999,Que濃度在0～10.4 μg/mL范圍內線性關系良好。

圖4 Que標準曲線

2.3.3 PS-EVs@Que載藥量和包封率的測定 如圖5所示,隨著Que加入量的增加,PS-EVs@Que的載藥量逐漸上升,包封率呈下降趨勢,但由于EVs載藥有限,載藥量增加到一定程度后幾乎不變。設置不同的投藥量,比較不同濃度Que對載藥量和包封率的影響,當Que投藥量為100 μg時,具有較高的包封率和載藥量,分別為(20.08±0.52)%和(8.59±0.16)%,因此選擇此投藥量進行后續實驗。

圖5 PS-EVs@Que載藥量和包封率

2.4 Que對巨噬細胞的毒性作用

如圖6所示,當Que濃度在0～20 μmol/L時巨噬細胞活力較高,當Que濃度在40～200 μmol/L時細胞活力明顯下降(P<0.01)。因此綜合考慮選擇20 μmol/L的Que用于后續實驗。

a:P<0.01,與0 μmol/L比較圖6 Que對巨噬細胞的24 h細胞毒性

2.5 PS-EVs@Que的細胞攝取情況

共聚焦顯微鏡結果顯示(圖7),PS修飾的EVs@Que納米遞藥系統比無修飾的EVs@Que綠色熒光更強(P<0.01),表明PS修飾能增強EVs@Que的被攝取能力。

a:P<0.01,與PS-EVs@Que組比較

2.6 巨噬細胞中極化標志物iNOS的蛋白表達差異

如圖8所示,PS-EVs@Que相比于其他組巨噬細胞的iNOS蛋白表達明顯降低(P<0.01),結果表明PS-EVs@Que對M1型巨噬細胞的抑制作用明顯強于EVs@Que組,顯示出更強的抑制炎癥效果。

a:P<0.01,與LPS+PS-EVs@Que組比較

2.7 巨噬細胞培養基中炎癥因子的表達差異

如圖9所示,PS-EVs@Que組細胞培養上清液中的IL-6和TNF-α表達水平顯著降低。PS-EVs@Que組的炎癥因子的表達明顯低于EVs@Que組(P均<0.01)。結果表明PS-EVs@Que處理組對炎癥因子分泌的抑制作用更強,起到更好的抑制炎癥作用。

a:P<0.01,與LPS+PS-EVs@Que組比較

3 討論

炎癥是人體抵御外源性入侵物或調節機體免疫反應失調必不可少的防御手段。但如果任由炎癥過度發展,則會導致組織向病理性纖維化發展,使正常的組織功能受損[14］。巨噬細胞是免疫細胞中一種關鍵的細胞類型,在炎癥的發展中發揮重要作用。其中,促炎M1型巨噬細胞能快速清除入侵病原體,啟動炎癥反應以保護宿主,但過量也會損害組織再生、影響傷口愈合,造成宿主損傷[15］。因此可以通過調整巨噬細胞極化的表型治療炎癥。例如,減少巨噬細胞向促炎M1型極化。Que作為一種天然黃酮類化合物具有抗炎等生物學效應,能夠抑制巨噬細胞向M1型極化。然而,由于其在體內的半衰期短和生物利用度低,因此在制藥領域的應用受到限制[16］。EVs具有獨特的生物相容性、較好的穩定性、具備物質負載能力和對細胞的高親和力,被視為藥物分子的最佳載體[17］。因此,將載體與Que聯合應用能夠在一定程度上解決Que穩定性不足與生物利用度低等問題。并且,通過表面修飾PS能夠將EVs偽裝成凋亡小體,進一步增強其被巨噬細胞快速識別和吞噬攝取的能力,以提高巨噬細胞對納米粒子的攝取效率[18］。

本研究成功提取了巨噬細胞(RAW264.7)來源的EVs,并且采用超聲技術將Que裝載至EVs中,進而將PS修飾到載有Que的EVs上制備得到PS-EVs@Que。實驗結果顯示,經超聲載藥處理后的囊泡,在形態、標志蛋白表達以及功能上并無明顯變化,并且修飾載藥后粒徑逐漸增大。同時,PS-EVs@Que的藥物載藥量達到了8.59%。攝取結果顯示,PS-EVs@Que的攝取效率明顯高于無修飾EVs@Que。初步證實了經PS修飾的EVs@Que可以增強藥物被細胞攝取的能力。蛋白印跡和ELISA結果表明,PS-EVs@Que顯著抑制了巨噬細胞的M1型極化,降低了促炎因子的表達。

綜上所述,本研究初步構建了納米藥物PS-EVs@Que,證明了PS-EVs@Que能夠更好地被巨噬細胞吞噬攝取,從而抑制巨噬細胞向促炎M1表型轉化、降低其促炎因子的分泌,進而達到更好抑制炎癥的效果。此外,納米載體(PS-EVs@Que)的成功構建為提高Que的穩定性與生物利用度提供了一種有效的策略,同時也為擴展天然化學藥物與天然載體之間聯合應用提供了參考與理論依據。