高效液相色譜法測定橘紅枇杷片中柚皮苷的含量

張 燕

(楚雄技師學院，云南 楚雄 675000)

橘紅枇杷片成份為化橘紅、陳皮、枇杷葉、桔梗、紫蘇子、甘草六味藥材，采用現代制劑工藝技術精心研制而成，具有止咳嗽、祛除咳嗽時痰多的功效。橘紅枇杷片收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》[1]中藥成方制劑第四冊(標準編號：WS3-B-0866-91)，無含量測定項。本文以柚皮苷為指標性成分，采用HPLC法測定控制橘紅枇杷片含量，該法簡便、快速、準確可靠。

1 儀器與試藥

Agilent HP-1100型高效液相色譜儀(帶四元泵，DAD檢測器，自動進樣裝置，在線真空脫氣設備，智能控制柱溫箱及HP化學工作站)。

乙腈為色譜純，所用水為二次重蒸餾水，其余試劑試藥均為分析純。

含量測定指標成分柚皮苷對照品購于中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用(采用面積歸一法，進行對照品純度檢查，純度為100%)；橘紅枇杷片為市售產品。

2 色譜條件

參考《中華人民共和國藥典》2020年版一部化橘紅項下柚皮苷的含量測定方法[2]，取柚皮苷對照品溶液進行紫外掃描，在 283 nm 處有最大吸收，故選擇 283 nm 為檢測波長。

Agilent ZORAX-C18色譜柱(φ4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸 (體積比20∶80)為流動相；檢測波長 283 nm；流動相流速設定為 1.0 mL/min，進樣量為 10 μL[3]；色譜柱溫度 25 ℃。

3 溶液的配制

3.1 對照品(柚皮苷)溶液的配制

取柚皮苷對照品，放入減壓干燥器干燥至恒重，取適量，精密稱定其質量，加入甲醇，配制成 55 μg/mL 的溶液作為對照品溶液。

3.2 樣品溶液(橘紅枇杷片)的配制

取待測樣品(橘紅枇杷片)10片，去除表面包裹的糖衣，放入研缽中，用研缽研成粉末。取樣約 1 g，精密稱定其質量，放入帶玻璃塞的 100 mL 錐形瓶中，用移液管精密加入甲醇 25 mL，塞上玻璃塞，稱定整個錐形瓶的質量，記錄數據。把錐形瓶放入電熱套中，調節合適的功率加熱回流 1 h，取出放冷至室溫，再次稱定具塞錐形瓶質量。加入甲醇補足在加熱回流過程中減失的質量，蓋上玻璃塞，輕輕搖動錐形瓶使其混合均勻，用有機相微孔濾膜進行濾過，取續濾液作為樣品溶液。

4 方法與結果

4.1 系統適用性

將對照品溶液與樣品溶液按上述色譜條件進樣。圖1為對照品(柚皮苷)色譜圖，圖2為樣品色譜圖。結果顯示，柚皮苷色譜峰的理論塔板數大于2000。

圖1 對照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

4.2 提取方法的考察

取本品10片，除去糖衣，研細，制成2份樣品。分別取約 1 g，精密稱定其質量，放入帶玻璃塞的錐形瓶中。用移液管精密加入甲醇 25 mL，塞上玻璃塞，稱定整個錐形瓶的質量，記錄數據。1份超聲處理 60 min，1份加熱回流提取 60 min[4]，取出放冷至室溫，再次稱定具塞錐形瓶質量。加入甲醇補足在加熱回流過程中減失的質量，輕輕搖動錐形瓶使其混合均勻，用有機相微孔濾膜進行濾過，放入自動進樣器進樣測定，結果見表1。

表1 提取方法考察表

從表1看出，樣品溶液選用加熱回流提取方法進行處理，樣品溶液中柚皮苷含量明顯較采用超聲提取方法進行樣品處理的含量高，故選擇回流提取對樣品進行處理，同時根據檢測結果確定樣品取樣量為 1 g。

4.3 線性關系

精密稱取柚皮苷對照品適量，加甲醇分別制成7.237、 14.47、28.95、57.90、86.85、115.8 μg/mL 的溶液作為樣品溶液。放置自動進樣器上，設置進樣量 10 μL，按確定的色譜條件進行檢測，以柚皮苷對照品進樣量為橫坐標，對照品峰面積為縱坐標，得到標準曲線。統計學處理，得回歸方程，Y=14.52x+3.98，r=0.99994，表明所用對照品柚皮苷在0.072～1.16 μg 范圍內呈良好的線性關系。

4.4 精密度試驗

取制備好的對照品溶液，按含量測定的方法連續進樣6針 (進樣量 10 μL)，以峰面積計算，RSD為0.50% (n=6)。

4.5 重復性試驗

取同一批號樣品照含量測定方法項下樣品溶液的制備方法同時制成6份供試液，進樣測定，以峰面積計算含量，RSD為0.85% (n=6)。

4.6 中間精密度試驗

取樣品，在同一試驗室由不同人員按含量測定項下的方法試驗，使用不同儀器進行含量測定，以峰面積計算含量，RSD為0.63% (n=6)。

4.7 穩定性試驗

取樣品照樣品測定項下的方法制成樣品溶液，按照上述色譜條件分別于0、4、8、12、24 h 進樣檢測，考察其穩定性，結果表明樣品在 24 h 內穩定，RSD為0.62% (n=5)。

4.8 回收率試驗

本試驗采用加樣回收法，精密稱取柚皮苷對照品，加入適量甲醇溶解后，制備得到每 1 mL 含對照品柚皮苷 600 μg 的溶液。用移液管精密量取對照品溶液 1 mL，放置于六個錐形瓶中，蒸干；取已測知含量的樣品，研細，取約 0.5 g，精密稱定，分別稱取6份樣品，放入帶有玻璃塞的錐形瓶中；按3.2項制得樣品溶液后，分別放入液相色譜自動進樣器上，進樣測定，計算回收率，結果表明平均回收率為98.68%，RSD為0.77%(n=6)。詳見表2。

表2 加樣回收率試驗結果(n=6)

4.9 陰性及空白對照試驗

按照橘紅枇杷片處方中各藥材配比，除去化橘紅藥材，其余藥材按制備工藝自配陰性樣品，并按本文3.2項確定的樣品溶液制備方法，進行陰性對照樣品溶液的制備，進樣檢測，記錄色譜圖(圖3為橘紅枇杷片陰性對照色譜圖，圖4為空白對照色譜圖)。結果表明陰性及空白無干擾。

圖3 橘紅枇杷片陰性對照色譜圖

圖4 空白對照色譜圖

5 樣品測定

取5批市售橘紅枇杷，分別按上述方法操作。在上述色譜條件下，樣品溶液與對照品溶液分別進樣 10 μL，測定，記錄色譜圖。以外標法測定計算樣品中有效成分(柚皮苷)的含量，結果見表3。

表3 橘紅枇杷片中柚皮苷的含量測定結果(n=5)

6 結語

橘紅枇杷片的現行質量標準依據的是《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方制劑第四冊(質量標準編號：WS3-B-0866-91)，無含量測定項?；偌t是方中君藥，始于明萬歷年間的《高州府志物產》?！侗静菔斑z》中記載，化痰止咳、風寒咳嗽為橘紅的首要功效，無論寒咳或干咳，服用橘紅均可見效。柚皮苷是化橘紅中的指標性成分，用其控制橘紅枇杷片質量合理可行。

本試驗采用高效液相色譜法，能快速準確地測定橘紅枇杷片中柚皮苷的含量，方法簡便、可靠，為橘紅枇杷片的質量監控和生產控制提供了保證。