妊娠及圍產因素對子代臍帶血CD34+造血干細胞的影響分析

仝曉鑫，李惠敏，翟青梅，張璐涵，丁桂鳳

子代臍帶血中的造血干細胞具有強大的造血重建能力， 目前臍帶血造血干細胞已在臨床上廣泛應用，可用于治療免疫缺陷性疾病、血液病、代謝類疾病等[1，2]。 臍帶血的質量直接關乎于干細胞移植治療效果[3]。 研究表明，有核細胞總數和白細胞分化抗原34+（cluster differentiation 34+，CD34+） 造血干細胞數量是反映臍帶血質量的重要指標[4]，其數量主要與移植機體接受速度、患者生存期長短和中性粒細胞恢復顯著相關。 因此臍帶血庫應優先選擇有核細胞總數和CD34+造血干細胞數量較高的臍帶血，具體標準應由各個臍帶血庫因具體情況制定。筆者探究妊娠及圍產期因素對子代臍帶血CD34+造血干細胞的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇烏魯木齊市婦幼保健院2021 年5 月至2022 年5 月收治的無先天性疾病的健康孕婦120例，采取其分娩新生兒的臍帶血作為研究對象，其中男性60 例，女性60 例；新生兒體質量2500 ～4000 g。 所有入組孕婦均簽署知情同意書，該研究已獲筆者所在醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 臍帶血采集

子代臍帶血由固定護士在醫院手術室或者產房收集120 份， 在新生兒斷臍后10 s 內進行臍帶血采集，每份大約2 ～3 mL。采集子代臍帶血時，穿刺位置選取距離胎盤斷端約5 ～8 cm 的位置， 用碘伏消毒2 遍后，用穿刺針頭呈小角度或斜頭朝下刺入，出血后沿血管壁順行1 ～2 cm，采集子代臍帶血。 采集完成后用止血鉗夾閉穿刺位置雙端的血管，采血過程中進行混勻以防血液凝固，記錄好樣品基本信息，暫時儲存于4 ℃冰箱中，盡快在24 h 內進行檢測。

1.2.2 有核細胞計數

采用XE-2100 全自動血液分析儀對子代臍帶血中的有核細胞進行計數。每個樣本進行3 次及以上測量，取平均值作為數據。

1.2.3 流式細胞術檢測CD34+造血干細胞

采用流式細胞分析儀（美國，DxP Athena）進行檢測。 流式細胞術至少需要約2×106個細胞進行上機操作，因此，首先使用細胞計數儀對樣品進行計數，計算出樣品所需量。 向樣品中加入20 μL 藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記CD34（CD34-PE）和10 μL多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質復合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PercP）標記CD45（CD45-Per-CP），用渦旋振蕩儀進行振蕩混勻， 避光條件下靜置10 min。 在1000 g 條件下離心5 min，吸棄上清液，加入1 mL 磷酸鹽緩沖溶液重懸細胞，之后上機檢測。用Flow Jo 軟件對數據進行分析，若CD34 陽性、CD45 弱陽性、 前向角散射較淋巴細胞較大的細胞則判定為CD34+細胞，計算CD34+細胞的占比，則為CD34+細胞占有核細胞的比例。 CD34+細胞數量則為有核細胞總數×CD34+細胞占有核細胞比例。

1.2.4 信息采集與分析

收集新生兒及產婦的臨床資料，主要包括孕母年齡、孕母血型（A 型/B 型/O 型/AB 型）、孕母身體質量指數（body mass index，BMI）、孕母過敏史、妊娠期糖尿?。ㄓ?無）、妊娠期高血壓（有/無）、分娩方式（剖宮產/順產）、產次（1/2/3）、孕周（＜37 周/＞37 周）、新生兒性別（男/女）、新生兒體質量、胎盤質量、胎膜早破（有/無）、羊水污染（有/無）、臍帶繞頸（有/無）等信息。其中妊娠期因素由筆者所在醫院產科醫生進行診斷，圍產期因素由產科醫生和新生兒科醫生共同診斷。

1.3 統計學方法

所有數據采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。正態分布計量資料以均值± 標準差，組間采取成組t檢驗，非正態分布計量資料采用中位數表示，組間采用Kruskal-Wallis H 檢驗。 皮爾遜卡方檢驗則描述兩個連續變量之間的相關性。 P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 妊娠期因素對臍帶血CD34+造血干細胞的影響

調查的妊娠期因素主要有孕母年齡、 孕母血型、孕母BMI、孕母過敏史、妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓、分娩方式、產次和孕周。 其中孕母平均年齡為30 歲，因此將孕母年齡按照30 歲進行分組，相關性分析發現孕母年齡和臍帶血中有核細胞數和CD34+細胞數呈正相關， 即孕母年齡＞30 歲時， 臍帶血的CD34+細胞數較多；另外，孕周也與臍帶血的有核細胞數和CD34+細胞數呈正相關。而其他妊娠期因素與臍帶血的有核細胞數和CD34+細胞數比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。 見表1。

表1 妊娠期因素與臍帶血中有核細胞數和CD34+造血干細胞數的關系[M（P25，P75）]Tab.1 Relationship between pregnancy factors and number of nucleated cells and CD34+hematopoietic stem cells in umbilical cord blood[M(P25,P75)]

2.2 圍產期因素對臍帶血CD34+造血干細胞的影響

圍產期因素主要包括新生兒性別、 新生兒體質量、胎盤質量、胎膜早破、羊水污染、臍帶繞頸。其中新生兒體質量和胎盤質量分別按照平均值進行分組比較，其他因素則為定性資料。經相關性分析發現，圍產期因素與臍帶血的有核細胞數和CD34+造血干細胞數均無關。 見表2。

表2 圍產期因素與臍帶血中有核細胞數和CD34+造血干細胞數的關系[M（P25，P75）]Tab. 2 Relationship between perinatal factors and number of nucleated cells and CD34+hematopoietic stem cells in umbilical cord blood[M(P25,P75)]

3 討論

臍帶血造血干細胞的首次成功移植是在1988 年由Gluckman E 等[5]對范科尼貧血患兒進行的治療。目前臍帶血在臨床上應用廣泛，從臍帶血中獲得的造血干細胞已治愈許多例血液系統惡性腫瘤或其他影響造血功能的遺傳性疾病[6～8]。 子代臍帶血已成為替代骨髓的造血干細胞的重要來源。 臍帶血具有多種優點，例如可簡單快速獲得、可長期保存、被外界環境污染的發生率低、排異反應發生率較低、被移植患者的生存質量高等[9～11]。 目前，中國多地已構建有臍帶血庫， 其很大程度上促進了造血干細胞移植的發展，增強了其移植成功率和覆蓋面，且降低了治療費用。 因此，在各方面提高收集到的子代臍帶血治療具有重要意義[12]。

筆者研究分析妊娠因素和圍產因素對子代臍帶血中有核細胞數和CD34+造血干細胞數的影響，以進一步提高臍帶血庫收集樣品的質量。有研究報道產婦年齡與CD34+造血干細胞數無明顯的相關性，但賀晶等[13]研究發現孕母年齡與臍帶血的CD34+造血細胞計數呈正相關關系， 筆者研究得出結果與之一致，據此分析，可能孕母年齡越大、體內自由基較多，則刺激臍帶血產生造血干細胞則較多。 另外，多項研究表明妊娠期高血壓或糖尿病等并不會影響臍帶血的有核細胞數和CD34+造血干細胞數[14]。 影響臍帶血造血干細胞的妊娠期因素據報道還有分娩方式等，有研究表明剖宮產患者的臍帶血CD34+造血干細胞數多于順產，但也有研究得出相反的結論[15]，或者得出生產方式并不影響臍帶血造血干細胞的結果[16]。 在筆者研究中，調查結果表明生產方式等其他因素并不影響臍帶血造血干細胞數量，這與部分研究結果一致。另外，筆者研究發現孕周越大，則有核細胞數和CD34+造血干細胞數越多，分析其原因可能是隨著孕周的增加胎兒的血液循環發育愈發完善。 另一方面，筆者研究發現圍產期因素包括新生兒性別、新生兒體質量、胎盤質量、胎膜早破、羊水污染、臍帶繞頸均不影響臍帶血的有核細胞數和CD34+造血干細胞數量，這與部分研究結果一致[17]，但也有研究表明新生兒體質量與CD34+造血干細胞數呈正相關[18]，還有研究表明臍帶繞頸的新生兒的CD34+造血干細胞數更多[19]。 分析不同研究得出不一致的原因有收樣規模和樣品之間存在個體差異性，筆者研究中納入新生兒發生臍帶繞頸的例數較少，且大多數僅繞頸1 周，很少可以引起臍帶壓迫，也因此很少引起臍帶血的血流動力學的改變。筆者研究仍存在一些不足，納入樣本量較少，另外還有很多其他影響因素例如胎齡[20]、單雙胎[21]、胎盤形態、受孕方式、孕母煙酒史、分娩時間等未納入研究。

綜上所述，筆者研究發現臍帶血中CD34+造血干細胞數量隨孕母年齡和孕周增加而增多，這為提高臍帶血庫的樣品質量提供了理論依據。因此臍帶血庫在篩選臍帶血造血干細胞提供者時，也可將孕周和孕母年齡納入作為考量因素。