基于流式量子點微球技術的甲乙型流感病毒抗原檢測方法的建立和初步應用分析

夏成靜，李寶花，郭燕妳，周小合，張潤玲，牛英波[.深圳光明區人民醫院（西）檢驗科，廣東深圳 5806；.南京諾唯贊醫療科技有限公司，南京 0033]

呼吸道病毒引起的感染和防治是全世界普遍面臨的公共衛生挑戰。近幾年發生的新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）大流行，讓全世界的公眾和公共衛生機構、政策制定者更加重視呼吸道病毒引起的傳染病[1-2]。由于不同呼吸道病毒及同一病毒不同亞型的治療方式和防控措施可能不同，快速精確地鑒定這些病毒及其亞型不僅可以為疾病診斷、治療提供充足的依據，也可為流行病學調查、疫情防控提供堅實的基礎[3-4]。因此，尋找一種快速、靈敏、多重檢測呼吸道病毒的方法是非常必要的。而液相蛋白芯片由于可以快速、高通量、平行化的檢測多個病毒蛋白（抗原或抗體），在多重檢測領域有著獨特的優勢[5-7]。液相蛋白芯片的核心原理是利用不同標記微球上聯接的特異性分子去識別對應的檢測物，因此如何制備信息種類豐富的編碼微球成為此技術能否實現高通量、高靈敏、多重性檢測的關鍵所在。目前，市場上的編碼微球主要由Luminex，Bangs Laboratories 等歐美公司壟斷生產，不僅售價高，而且需要昂貴的多通道檢測儀器進行檢測。而與傳統染料相比，具有吸收光譜范圍寬、激發熒光光譜窄、發光效率高、發光譜隨粒徑大小可調、光穩定性好等優點的量子點（quantum dot，QD）逐漸成為了液相芯片中研究最熱的熒光編碼粒子[8-12]。本研究擬開發一種針對甲型流感病毒（FluA）及乙型流感病毒（FluB）抗原的多重流式檢測方法，利用量子點編碼微球作為反應載體，建立基于流式量子點微球技術的甲乙型流感病毒抗原聯檢方法，為常見呼吸道病毒多重檢測打下基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機收集中國科學院大學深圳醫院（光明）西院區2022年5～8月門診就診的疑似甲乙型流感病毒感染咽拭子，隨機選取81 例，其中男性43 例，女性38 例，年齡1～63 歲?；颊邩颖揪褂眉仔?乙型抗原檢測試劑盒（膠體金法）進行了流感病毒感染的臨床診斷，并將剩余咽拭子樣本凍存于-80℃。納入標準：具有呼吸道病毒感染臨床癥狀表現的患者。排除標準：采樣前一個月內服用過抗流感藥物者。本研究已通過中國科學院大學深圳醫院（光明）倫理委員會評審通過。

1.2 儀器與試劑 流式細胞儀（Beckman 公司）；實時熒光定量PCR 儀（Life Technologies 公司）；酶標儀（BioTek 公司）。FluA/FluB 核蛋白（nucleoprotein，NP）抗原及其配對抗體對（南京諾唯贊醫療科技有限公司）。熒光編碼微球（Bangslabs 公司）；聚苯乙烯微球（蘇州納微科技股份有限公司）；N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide，sulfo-NHS)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]，2-嗎啉乙磺酸（MES）均購自Sigma 公司；樣本稀釋液及清洗液由磷酸緩沖液、Tween-20 和牛血清清蛋白配制而成，所用試劑均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；生物素標記試劑盒（Thermo fisher 公司）；CdSe/ZnS 量子點納米晶體（武漢珈源量子點技術開發有限責任公司）；FITC donkey anti-mouse IgG（Jackson 公司）；鏈霉親和素-藻紅蛋白染料（SA-PE,BD 公司）；96 孔過濾板（Millipore 公司）；qPCR 試劑及配套耗材（廣州達安基因股份有限公司）；甲/乙型流感病毒抗原檢測試劑盒（膠體金法，廣州萬孚生物技術股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 量子點編碼微球檢測體系構建

1.3.1.1 量子點編碼微球制備：首先對聚苯乙烯微球進行溶脹，然后在溶脹體系中加入不同濃度的CdSe/ZnS 量子點對其進行熒光染色，染色完成后將微球從有機相溶脹體系中轉移到水相保存體系中。通過調整量子點和聚苯乙烯微球的濃度比例，獲得不同亮度的多峰量子點編碼微球。由于聚苯乙烯微球表面具有羧基修飾，因而可以用于后續的抗體偶聯。

1.3.1.2 抗體與微球的偶聯：采用EDC/Sulfo-NHS方法活化羧基微球后再與FluA/FluB-NP 配對單抗進行偶聯。具體步驟為：將106個微球使用50 mmol/L MES 緩沖液洗滌數次后，加入0.2mg sulfo-NHS，0.2mg EDC，迅速渦旋混勻，室溫翻轉孵育20min。對活化后的微球進行洗滌后，加入包被抗體，迅速渦旋混勻，室溫翻轉孵育2h。對偶聯后的微球進行洗滌、濃度測定、產率計算、偶聯確認。為了后續最優抗體對組合的篩選測試，將不同克隆號的FluA/FluB-NP 單抗（Clone：FluA6，FluA8，FluB15，FluB66，FluB79）均進行偶聯。

1.3.1.3 生物素標記抗體的制備：按照Thermo fisher生物素標記試劑盒說明書進行抗體標記，使用酶標儀對生物素標記抗體進行濃度測定并通過HABA 分析法（harmonic analysis based on approximation，基于諧波分析的近似方法）測定結合在抗體上的生物素的濃度，計算生物素與抗體蛋白摩爾比（Biotin/Protein,B/P）。

1.3.2 FluA 和FluB 抗原單檢的性能測試：基于量子點編碼微球的FluA 和FluB 抗原多重檢測方法的開發，需要先進行FluA 和FluB 單檢方法的建立和驗證，然后將該單檢方法進行聯檢測試。單檢測試主要包括以下步驟：①校準品的制備：將FluA/FluB 的NP 抗原母液以等比稀釋的方式稀釋為一系列濃度：1 000 000，250 000，62 500，15 625，3 906.3，976.6，244.1，61.0 和15.3pg/ml；②免疫反應：在96 孔過濾板中依次加入稀釋液、校準品/樣本、生物素標記的檢測抗體、包被抗體偶聯的捕獲微球，避光震蕩孵育2.5h 后，加入鏈霉親和素-藻紅蛋白（SA-PE），避光震蕩孵育0.5h 后，使用真空抽濾裝置進行抽濾，使用清洗液進行清洗后再次抽濾，使用清洗液將微球重懸收集等待上機測試；③上機與數據處理：使用流式細胞儀對各收集管進行上機采集數據，將獲得的中值熒光強度（median fluorescence intensity，MFI）數據導入到Graphpad Prism 9.0 軟件中進行分析；④以校準品的一系列MFI 值與校準品的濃度繪制校準曲線，利用校準曲線方程計算樣本的濃度。單檢方法的初步性能評估主要包括測量范圍和交叉反應。通過觀察不同濃度校準品在校準曲線上的分布，確定該方法針對FluA和FluB 抗原濃度的測量范圍。

1.3.3 FluA 和FluB 抗原聯檢的性能測試：甲乙型流感病毒抗原聯檢測試，是在單檢測試的基礎上，在同一個反應體系中，直接加入FluA 和FluB 抗原的兩種捕獲微球以及FluA 和FluB 抗原的兩種生物素標記的檢測抗體，以同時促成FluA 和FluB 抗原檢測夾心的分別形成，并最終通過編碼微球作為信號傳遞媒介，在流式細胞儀上輸出FluA 和FluB 微球的檢測熒光信號，進而獲得校準曲線和樣本濃度的結果，見圖1。參照相關文獻的描述[12-13]，對量子點微球的聯檢方法進行性能評估，包括檢出限、測量范圍、交叉反應。

圖1 基于量子點編碼微球的甲乙型流感病毒抗原多重檢測的原理示意圖

1.3.4 基于流式量子點微球技術的FluA 和FluB 聯檢平臺對臨床樣本的驗證和方法學比對：將-80℃保存的臨床咽拭子樣本放置在室溫下解凍30min后，置入500μl 提取液中沿管壁旋轉約10 次，使標本盡可能溶解入提取液中。將提取好的樣本液一分為二，一份用于本方法進行抗原檢測，另一份使用qPCR 進行核酸檢測（具體操作嚴格按照儀器廠家和試劑說明書進行）。本方法以FluA 和FluB抗原檢測的檢出限作為陰陽性判斷的臨界值，與qPCR 檢測的陰陽性結果進行對比，分析其臨床靈敏度和特異度。

1.4 統計學分析 應用SPSS17.0 統計軟件進行配對計數資料的Kappa 系數檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。當Kappa＞0.75，表示一致性較強；0.75＞Kappa ＞0.4 表示一致性一般；Kappa ≤0.4，表示一致性較弱。使用GraphPad Prism 9.0 軟件繪制標準曲線，均使用五參數logistic 模型{Y=d+(a-d)/[1+(X/c)b]g}。兩種方法的比對采用四格表形式進行統計，計算靈敏度和特異度。

2 結果

2.1 試劑原料制備 通過溶脹嵌入法，本研究制備了一組基于量子點編碼的熒光微球。流式細胞儀分析結果表明熒光微球分群性能良好，見圖2。理論上可以實現6 種分析物的同時檢測。為了證明抗體偶聯的可行性，使用上述制備的量子點編碼微球分別與FluA-NP 和FluB-NP 單抗進行偶聯，同時使用種屬特異性的熒光標記抗體（FITC Donkey antimouse IgG）對偶聯后的微球進行標記，對相關表征參數進行了測定，抗體偶聯后的微球回收率＞80%，和抗體偶聯均勻度CV＜25%，與以往報道的偶聯結果一致[14-15]。生物素標記抗體的標記前后總體回收率為55%～70%，B/P 為4～6，這與文獻報道的理想標效果相一致[16]，證明這些試劑可以基本滿足后續測試的需求。

圖2 6 種亮度的量子點編碼微球的熒光強度直方圖

2.2 FluA 和FluB 抗原單檢的初步性能評估 在研究早期，為了探索FluA 和FluB 抗原單檢技術可行性，先進行了量子點編碼微球FluA/FluB 單檢系統初步的性能建立，對抗體濃度、SA-PE 染料用量、孵育時間、孵育步驟等參數進行了優化，并對其測量范圍、交叉反應等分析性能進行了初步研究。這些研究成果奠定了微球多重免疫檢測法的技術基礎。初步研究表明FluA 和FluB 的測量范圍為15.3～250 000pg/ml。FluB 捕獲微球在250 000pg/ml 的FluA-NP 抗原濃度下產生的交叉反應率為0.022%。FluA 捕獲微球在250 000pg/ml 的IBVNP 抗原濃度下產生的交叉反應率為0.006%。量子點編碼微球的單檢系統檢測FluA 抗原的空白限為10.5pg/ml，檢測FluB 抗原的空白限為2.9pg/ml。上述結果表明該方法可以用于對FluA 和FluB 抗原進行同時檢測。

2.3 FluA 和FluB 抗原聯檢的分析性能 在上述初步研究基礎上，本研究建立了基于量子點編碼微球的甲乙流病毒抗原的聯檢方法，并進行了系統的靈敏度、測量范圍研究。圖3所示為FluA 和FluB 抗原聯檢的校準曲線圖。使用量子點編碼微球的多重檢測系統，檢測FluA 抗原的檢出限為26.1pg/ml，驗證后的測量范圍為15.3～250 000 pg/ml。檢測FluB 抗原的檢出限為10.7 pg/ml，驗證后的測量范圍為15.3～250 000 pg/ml。

圖3 甲乙型流感病毒抗原流式熒光檢測校準曲線

2.4 量子點編碼微球的多重檢測方法與qPCR 法結果比對 在上述分析性能研究的基礎上，本研究開展了與qPCR 的FluA 和FluB 核酸檢測結果的比對。收集的81 例樣本中，qPCR 結果為54 例FluA陽性，Ct值在25.59～39.12 范圍，27 例FluA 陰性，Ct值＞40?；诹孔狱c編碼微球的FluA 抗原檢測結果顯示，31 例FluA 抗原陽性，濃度分布在33.8～83 019.1 pg/ml 區間，50 例樣本FluA 抗原陰性，檢出濃度小于26.1pg/ml。根據以上結果，兩種方法一致性一般（Kppa 值為0.47，P＜0.05）。以qPCR 結果為金標準，計算得到陽性符合率（靈敏度）57.4%，陰性符合率（特異度）100%，總符合率71.6%。優于目前臨床常用的膠體金抗原檢測試劑，如萬孚的陽性符合率56.49%，陰性符合率99.75%（摘自試劑說明書）。在81 例樣本檢測中，qPCR 的FluB 陽性1 例，Ct值為36.5，此樣本的多重方法檢測結果也為陽性，FluB 抗原濃度為261.2 pg/ml，qPCR 檢測其余80 例樣本均為 FluB 陰性與多重方法結果一致，靈敏度和特異度均為100%。

3 討論

本研究開發了針對甲型、乙型流感病毒抗原的量子點編碼微球流式免疫檢測方法，成功制備了多峰量子點編碼微球、抗體偶聯的編碼微球、生物素標記抗體，對甲乙型流感病毒抗原檢測的靈敏度、測量范圍、交叉反應等分析性能進行了研究，確認了該聯檢方法可用于臨床樣本的測試，經與qPCR比較雖然靈敏度有所欠缺，但特異度好，并可以定量檢測，最重要的是可以用于呼吸道病毒的多重檢測，可以提高臨床檢測的效率和節約成本，同時也可以利用此平臺對其他目標物進行多重檢測，不僅可以為臨床診斷、治療應用提供依據，而且也可以為流行病學調查提供及時的數據。針對開發和測試過程中遇到的量子點滲漏、熒光強度波動等問題，通過對溶劑體系、保存條件、表面修飾的優化，獲得了具有長期穩定性的量子點編碼微球，這些問題也是長期以來困擾量子點臨床使用的技術瓶頸，通過對這些技術的優化，有希望打開量子點作為熒光標記的臨床應用之路。

在對81 例臨床樣本的測試中，利用此方法測得FluA 陽性樣本31 例，陰性樣本50 例。與qPCR結果比對，陰性符合率為100%，陽性符合率為57.4%。表明本方法可以有效避免假陽性結果的出現，但是對于假陰性結果，提示免疫檢測方法與核酸檢測方法在檢測靈敏度上存在的固有差別[3,17-18]，這得益于qPCR 擴增檢出極低量的核酸序列的能力，也可能與此方法還需要不斷進行條件優化以提高靈敏度有關。后續的條件優化可參考Luminex 多重微球的方案[19]，通過減少微球和樣品的初始孵育體積、增加初始孵育時間、減少與微球偶聯的捕獲抗體量來提高靈敏度，也可篩選具有更高親和力的抗體作為捕獲抗體或檢測抗體來達到靈敏度提高的目的。另一方面，qPCR 是對病毒核酸序列的測定，對無活性病毒也可能產生陽性檢測結果，也存在一定比例的假陽性。本研究建立的定量免疫學檢測方法通過標準曲線的建立，可以定量的對活性病毒進行檢測，可以更加有效地評估病毒的活性狀態與病毒量的變化，并且有更少的假陽性結果，因而不僅在診斷，而且在判斷病情嚴重程度和預后方面都有重要價值。此項研究的另一個背景是，采用的臨床樣本是已經進行了一次提取液洗脫的咽拭子樣本進行的二次洗脫液，因而其檢測結果相對于qPCR 可能存在更大可能的假陰性，與第一次洗脫后用膠體金免疫法檢測相比，此方法也超過了膠體金免疫法的靈敏度和特異度，也證明了此方法的優越性，后續的研究工作中，需要對真實的咽拭子樣本的抗原濃度進行評價，以獲得更加完整的性能研究數據。同時由于FluB 陽性樣本數量過少，此方法對FluB 的靈敏度評價有待獲取更多陽性標本進行驗證，但特異度與PCR 比較也達到100%，與FluA 一致，證明了此方法在多重檢測方面的可行性。此方法最大的優勢是可以利用流式檢測平臺對呼吸道病毒進行多重檢測，也是我們下一步研究的方向。

總之，本研究證明了使用量子點納米晶體嵌入的編碼微球進行甲乙型流感病毒聯檢的可行性，此后將繼續致力于多種呼吸道病毒的多重免疫檢測方法的開發，并借助量子點納米晶體編碼微球的獨特優勢，開發成可以用于即時檢測的快速診斷技術平臺，不僅用于即時檢驗（POCT）的臨床診斷，甚至可以使家庭使用場景成為現實，讓呼吸道病毒快速檢測更加經濟、易用、普及。