旋毛蟲鈣網蛋白對小鼠巨噬細胞和大鼠PBMC免疫功能的影響

張朝瑩,文兆海,張玥,李嫄,徐立新,陸明敏,宋小凱,李祥瑞,嚴若峰

(南京農業大學動物醫學院,江蘇 南京 210095)

旋毛蟲病(Trichinosis)是由旋毛形線蟲(Trichinellaspiralis)引起的一種食源性人獸共患病,呈全球性分布。主要臨床癥狀是創傷性和免疫學的改變,包括眼瞼水腫、發熱綜合征、腹瀉、肌肉疼痛和嗜酸性粒細胞增多等[1]。旋毛蟲病重癥患者的特征是心血管、肺和中樞神經系統損傷,最終可導致宿主死亡,給動物生產和人類公共衛生安全構成了嚴重威脅。旋毛蟲可感染多種哺乳動物、鳥類和爬行動物等,其中鼠是旋毛蟲病的一種重要的傳染源[2]。當旋毛蟲與宿主建立寄生關系時,會產生各種免疫逃避機制,從而讓其能夠成功寄生[3],因此其逃避宿主免疫系統的機制引起了廣泛關注。盡管現在針對旋毛蟲病有相對安全的藥物,如阿苯達唑等[4],但其耐藥問題已日趨嚴重。故此,研究旋毛蟲與宿主間相互作用、篩選出新的疫苗候選抗原對預防該病具有重要意義[5]。

鈣網蛋白(calreticulin,CRT)是內質網中高度保守的Ca2+結合蛋白[6],在某些情況下其可以從細胞內轉運出來,出現在胞質、胞膜表面、血清、顆粒物等中,或者以可溶性的形式被分泌到體外[7-8]。鈣網蛋白是一種鈣結合伴侶,參與一系列細胞過程,在免疫反應中具有多種功能。在內質網中,鈣網蛋白促進主要組織相容性復合體(MHC)I類分子及其組裝因子的折疊,從而影響向細胞毒性T細胞的抗原呈遞[9]。研究表明鈣網蛋白也可在細胞表面表達[10],并與細胞的吞噬攝取和免疫原性相關。然而,研究rTs-CRT對宿主免疫細胞功能的影響卻少有報道。

本研究團隊前期從旋毛蟲外泌體蛋白質譜分析結果中鑒定到鈣網蛋白,但其對宿主免疫功能的影響尚不清楚。本文根據NCBI上發布的鈣網蛋白核苷酸序列進行了克隆表達,并對重組蛋白的免疫調節功能開展了初步研究,以期為深入了解蟲體與宿主間的相互作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物與蟲體旋毛蟲為中國河南豬分離株,國際編號ISSS534,由本研究團隊傳代并保存。健康6周齡SPF級雄性SD大鼠(約200 g)購自北京維通利華實驗動物公司。

1.1.2 主要試劑與材料大腸桿菌DH5α、BL21菌種,pET-28a(+)載體,小鼠巨噬細胞系(RAW264.7)均由本實驗室保存;大鼠淋巴細胞分離液、抗凝真空采血管為天津灝洋公司產品;DNA回收試劑盒為Omega公司產品;PrimeSTAR Max DNA Polymerase、限制性內切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)、Ligation mix 為TaKaRa公司產品;ToxinEraserTM內毒素去除試劑盒為金斯瑞公司產品;RPMI-1640培養基、內毒素去除柱、青鏈霉素雙抗、HRP 標記抗大鼠IgG、胎牛血清(FBS)、RIPA 裂解液為Thermo Fisher公司產品;總NO檢測試劑盒、CCK-8檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒為碧云天公司產品;RNA isolater、HiScript Ⅲ反轉錄試劑、qPCR試劑盒為南京諾唯贊公司產品;DAB顯色試劑盒為天根生物公司產品;引物由通用生物公司合成。

1.2 TsCRT基因的克隆與表達

1.2.1 引物設計與合成根據NCBI中TsCRT的CDS序列(XM_003379455.1)設計引物,選擇酶切位點EcoRⅠ和XhoⅠ,引物如下所示,下劃線部分的序列表示酶切位點。CRT F/R：5′-CGGAATTCGAGGTTTA-TTTGAAAGAAACGTTC-3′/5′-CCCTCGAGTTAAAGTTCGTCGTCAGCATG-3′。

1.2.2 目的基因的擴增與原核表達質粒的構建根據TRIzol試劑說明書提取旋毛蟲肌肉幼蟲蟲體總 RNA,將其反轉錄為cDNA,再通過PCR擴增目的基因。按照凝膠回收試劑盒(OMEGA)說明書回收PCR產物,用EcoRⅠ和XhoⅠ將回收產物與pET-28a(+)質粒分別進行雙酶切,并在25 ℃水浴條件下連接酶切產物,時間為30 min。將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中,置于37 ℃搖床中培養12～16 h,收集重組菌,進行雙酶切與測序鑒定。陽性質粒命名為pET-28a-TsCRT。

1.2.3 重組旋毛蟲鈣網蛋白(rTsCRT)的表達及純化將pET-28a-TsCRT轉化至大腸桿菌BL21,挑取單菌落37 ℃、180 r·min-1振蕩培養約3 h,加入IPTG至其終濃度為1 mmol·L-1,繼續振蕩培養5 h,用120 g·L-1十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白分布情況。用鎳柱純化重組蛋白,再用PEG20000濃縮蛋白,并使用試劑盒去除內毒素。

1.2.4 旋毛蟲感染血清的制備用7 000條旋毛蟲肌幼蟲經口感染SD大鼠,35 d后經腹主動脈采血并分離得到純化的抗重組CRT蛋白(rTsCRT)血清,分裝后保存于-20 ℃備用。

1.2.5 rTsCRT的Western blot分析SDS-PAGE電泳后將重組蛋白轉印PVDF,在37 ℃條件下用50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h,再使用50 g·L-1脫脂奶粉按1∶100(體積比)稀釋一抗(感染旋毛蟲的大鼠血清與未感染的大鼠血清),4 ℃孵育過夜;加入 50 g·L-1脫脂奶粉按1∶5 000(體積比)稀釋的山羊抗大鼠IgG,37 ℃避光孵育1 h。將 ECL滴加于PVDF膜上,使用全自動化學發光圖像分析系統曝光成像。

1.3 rTsCRT對小鼠巨噬細胞功能的影響

1.3.1 rTsCRT對小鼠巨噬細胞增殖的影響將傳代培養的小鼠巨噬細胞濃度調整為5×105mL-1,以每孔100 μL加入96孔細胞培養板,分別向每孔加入不同濃度的rTsCRT(0、5、10、20、40、80 μg·mL-1),另設空培養基的空白孔。置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養 48 h,根據CCK-8 檢測液說明書檢測增殖結果。

1.3.2 rTsCRT對小鼠巨噬細胞分泌NO的影響將傳代培養的小鼠巨噬細胞濃度調整為1×106mL-1,將細胞加入24 孔細胞板,每孔1 mL。用不同濃度的rTsCRT(5、10、20、40、80 μg·mL-1)處理巨噬細胞;同時設置PBS空白組。每組設3個重復。置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養48 h。收集細胞,2 000 r·min-1離心10 min,收集上清液,按照總NO檢測試劑盒的步驟檢測每組的NO分泌水平。

1.3.3 rTsCRT對小鼠巨噬細胞凋亡的影響將傳代培養的小鼠巨噬細胞濃度調整為1×106mL-1,將細胞加入24 孔細胞板,每孔1 mL。用不同濃度的rTsCRT(5、10、20、40、80 μg·mL-1)處理巨噬細胞,同時設PBS 空白組。置于培養箱內培養24 h,每組至少3個重復。根據凋亡試劑盒說明書檢測凋亡結果,試驗獨立重復3次。

1.4 rTsCRT對大鼠PBMC轉錄因子和細胞因子轉錄水平的影響

1.4.1 rTsCRT對大鼠PBMC不同類型Th細胞關鍵轉錄因子轉錄水平的影響將新鮮分離的大鼠PBMC培養在含1%青(鏈)霉素雙抗和10% FBS的RPMI-1640中,濃度調整為1×106mL-1,然后將細胞鋪于12孔細胞培養板,每孔2 mL,分別加入不同濃度(10、20、40和80 μg·mL-1)的rTsCRT和PBS,每組設3個重復。置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h。24 h后使用TRIzol法分別提取各孔細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA,再進行實時熒光定量PCR(qPCR),最后試驗結果采用2-ΔΔCT法計算,分析各組轉錄因子mRNA的水平變化。qPCR反應體系：cDNA模板1 μL,上、下游引物各0.2 μL,ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL,2×GS AntiQ qPCR SYBR Master Mix 5 μL,ddH2O 3.4 μL,總反應體積為10 μL。反應程序：95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s,65 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,40個循環;熔解曲線程序：95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃15 s。qPCR引物序列見表1。

表1 本試驗中qPCR所用引物Table 1 The primers for qPCR in this test

1.4.2 rTsCRT對大鼠PBMC細胞因子轉錄水平的影響具體步驟同1.4.1節。實時熒光定量PCR引物序列見表1。

1.5 數據的處理與分析

使用SPSS 22.0統計軟件分析數據,采用One-way ANOVA法對數據進行方差分析和差異顯著性檢驗(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001),采用GraphPad Prism 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 CRT基因的克隆與表達

瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增產物,結果顯示在1 152 bp處有單一條帶(圖1-A);雙酶切鑒定重組質粒pET-28a-CRT,在相應位置分別觀察到載體與目的基因條帶(圖1-B);重組蛋白主要分布于上清液(圖1-C),蛋白純化效果良好,相對分子質量約為46×103(圖1-D)。

圖1 CRT基因的克隆表達及蛋白的表達和純化Fig.1 CRT gene cloning and expression and protein purification A.CRT基因PCR擴增(M.DNA標準 DL2000;1.PCR產物);B. pET-28a-CRT的雙酶切鑒定(M.DNA標準 DL10000;1.重組質粒經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切);C.重組CRT蛋白的分布情況(M.蛋白標準;1.CRT在上清液的分布;2.CRT在包涵體的分布);D.重組蛋白CRT的純化(M.蛋白標準;1. CRT的純化結果)。A. PCR amplification of CRT gene(M. DNA Marker DL2000;1. PCR product);B. Identification of pET-28a-CRT digested by restriction endonuclease(M. DNA marker DL10000;1. The recombinant plasmid was digested by EcoRⅠand XhoⅠ);C. Distribution of recombinant protein CRT(M. Protein marker;1. Distribution of CRT in supernatant;2. Distribution of CRT in inclusion bodies);D. Purification of recombinant proteins CRT(M. Protein marker;1.Purification results of CRT).

2.2 rTsCRT的Western blot分析

Western blot結果顯示,在相對分子質量為46×103左右有一特異性條帶,而陰性對照無條帶(圖2),說明該重組蛋白具有良好的反應原性,能夠被感染旋毛蟲大鼠陽性血清識別。

圖2 重組蛋白CRT(rTsCRT)的Western blot分析Fig.2 Western blot analysis of recombinant proteins CRTM.蛋白標準品;1.rTsCRT與大鼠陽性血清;2.rTsCRT與大鼠陰性血清。M. Protein marker;1. Recombinant proteins CRT with rat positive serum;2. Recombinant proteins CRT with rat negative serum.

2.3 rTsCRT對小鼠巨噬細胞增殖的影響

細胞增殖指數(試驗組吸光值/對照組吸光值)如圖3所示：與空白對照組相比,5、10、20、40、80 μg·mL-1的rTsCRT均能夠促進小鼠巨噬細胞的增殖。

圖3 rTsCRT對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.3 The impacts of rTsCRT on RAW264.7 cells proliferation***P<0.001.The same below.

2.4 rTsCRT對小鼠巨噬細胞分泌NO的影響

從圖4結果可知：與空白對照組相比,5、10、20、40、80 μg·mL-1的rTsCRT均能夠促進小鼠巨噬細胞細胞分泌NO,且在重組蛋白濃度為10和20 μg·mL-1時,刺激效果最顯著。

圖4 rTsCRT對RAW264.7細胞NO分泌的影響Fig.4 The impacts of rTsCRT on RAW264.7 cells NO production

2.5 rTsCRT對小鼠巨噬細胞凋亡的影響

使用流式細胞儀對Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶(PI)雙染后的細胞進行檢測。結果如圖5所示,與空白對照組相比,不同濃度的rTsCRT均能夠抑制小鼠巨噬細胞的凋亡,且在重組蛋白濃度為20 μg·mL-1時,抑制程度最顯著。

圖5 rTsCRT對RAW264.7細胞凋亡影響的流式細胞檢測(A)和凋亡率統計(B)Fig.5 Flow cytometry detection(A)and apoptosis rate statistics(B)of the impacts of rTsCRT on RAW264.7 cells apoptosis

2.6 不同濃度rTsCRT對大鼠PBMC不同類型Th細胞關鍵轉錄因子轉錄水平的影響

結果如圖6所示：與陰性對照組相比,rTsCRT對T-bet、Gata-3、PU.1都具有顯著抑制作用(P<0.05),其中重組蛋白濃度在10 μg·mL-1時對T-bet和Gata-3的抑制效果最明顯。該蛋白能夠顯著刺激Foxp3和Ahr(P<0.05)的表達,其中對Ahr的刺激效果最為明顯。重組蛋白在10 μg·mL-1時能顯著刺激RORγt和Bcl-6(P<0.05)的轉錄,而在濃度20、40 和80 μg·mL-1時與陰性對照組相比無顯著差異。

圖6 rTsCRT對大鼠PBMC轉錄因子轉錄水平的影響Fig.6 Effects of rTsCRT on the transcription factor transcription levels in rat PBMC

2.7 不同濃度rTsCRT對大鼠PBMC細胞因子轉錄水平的影響

結果如圖7所示：與陰性對照組相比,rTsCRT對IFN-γ、IL-17、IL-10、IL-9和IL-22的表達都具有顯著刺激作用(P<0.05),其中對IL-17和IL-22的刺激效果最明顯。重組蛋白濃度在20和40 μg·mL-1時能顯著刺激TGF-β(P<0.05)的表達。該蛋白能夠顯著抑制IL-21的轉錄水平(P<0.05),且對IL-21的抑制作用隨蛋白濃度的升高而減弱。同時該蛋白在10和20 μg·mL-1能顯著抑制IL-4的轉錄(P<0.05),但濃度為80 μg·mL-1時能顯著刺激其轉錄。

圖7 rTsCRT對大鼠PBMCs細胞因子轉錄水平的影響Fig.7 Effects of rTsCRT on the cytokines transcription levels in rat PBMC

3 討論與結論

巨噬細胞是機體免疫反應中的一種重要免疫細胞,參與大部分先天性免疫和獲得性免疫反應,在炎癥和宿主防御中起著重要作用[11]。病原體感染宿主,巨噬細胞能夠通過吞噬作用及分泌不同的細胞因子和釋放NO等發揮免疫功能。因此,本試驗通過測定小鼠巨噬細胞增殖、凋亡和NO分泌這些免疫指標,從而明確rTsCRT與宿主免疫細胞之間的作用關系。細胞增殖對機體免疫反應非常重要,能夠幫助細胞參與宿主防御病原體的入侵過程。細胞凋亡通常在發育和衰老過程中發生,以維持組織中細胞群的穩[12]。本研究結果顯示,rTsCRT在與小鼠巨噬細胞共孵育后能夠極顯著促進其增殖功能及NO的釋放,并抑制其凋亡功能。這表明該蛋白能通過多種機制調節宿主免疫細胞發揮功能,有利于機體排出或殺死旋毛蟲。

外周血單個核細胞(PBMC)是一類包含淋巴細胞、單核細胞和樹突狀細胞在內的混合細胞,在免疫系統中起重要作用[2]。PBMC收集與分離方法較為成熟,被廣泛運用于多種試驗研究中[13]。本試驗前期結果已初步表明CRT對小鼠巨噬細胞具有一定的影響,而旋毛蟲入侵宿主過程復雜,且多種免疫細胞均參與其中,因此選用大鼠PBMC繼續探究CRT對其的影響能夠更好地模擬旋毛蟲在感染宿主過程中對宿主免疫系統產生的影響。

幼稚CD4+T細胞分化為不同的Th細胞亞群取決于諸多因素,特定的刺激條件能夠影響轉錄因子的表達,決定T細胞將遵循的分化程序,從而影響細胞因子的生產。Th1亞群需要IL-12的刺激而進行分化,產生IFN-γ作為其標志性細胞因子,受轉錄因子T-bet調節,對細胞內病原體的免疫很重要;Th2亞群需要IL-4的刺激而進行分化,受轉錄因子Gata-3調節,介導針對細胞外病原體的免疫應答;Th17亞群需要IL-21進行分化,產生IL-17作為其標志性細胞因子,受轉錄因子RORγt調節;調節性T細胞亞群需要TGF-β的刺激而進行分化,受轉錄因子Foxp3調節,對于維持自我耐受和調節免疫至關重要。研究表明,缺乏T-bet和GATA3表達的Treg細胞能夠上調RORγt表達并獲得產生IL-17的能力;且T-bet和Gata-3的動態表達以及T-bet、Gata-3、RORγt和Foxp3之間的交叉調節對于維持Treg功能非常重要[14]。本研究中,與PBS組相比,rTsCRT能夠顯著下調T-bet和GATA-3表達,同時產生更高水平的轉錄因子Foxp3和RORγt,與先前報道[14]結果類似。

細胞因子的表達模式表征了單Th細胞亞群,并決定了它們在宿主防御中的功能[15]。當寄生蟲感染發生時,細胞介導的免疫對于阻止寄生蟲的寄生有著很重要的作用[16]。旋毛蟲在感染早期,可誘導宿主中Th1/Th2免疫應答[17]。IFN-γ是Th1細胞和CD8+T細胞的關鍵細胞因子[18]。它可以激活巨噬細胞和樹突狀細胞,刺激MHC-肽復合物的表達增加,并防御細胞內感染[19]。IL-4以自分泌的方式促進Th2細胞分化,其轉錄水平可反映Th2型免疫應答。先前研究發現旋毛蟲感染期間Th17和Treg反應的相互發展對于免疫保護和免疫病理學的平衡很重要,增加的TGF-β可能有助于Th17的早期增加[20],而由此產生的IL-17通過介導空腸肌肉的收縮,幫助蠕蟲排出[21]。本研究中,與PBS組相比,rTsCRT在與大鼠PBMC共孵育后,能產生更高水平的Th1類細胞因子(IFN-γ)、Th17類細胞因子(IL-17)、Treg類細胞因子(IL-10和TGF-β)、Th9類細胞因子(IL-9)以及Th22類細胞因子(IL-22),表明rTsCRT能夠刺激大鼠產生Th1、Th17、Treg、Th9、Th22等多種類型的免疫反應。rTsCRT能顯著抑制Tfh類細胞因子(IL-21)的表達,且在蛋白濃度為10和20 μg·mL-1時,顯著抑制了Th2類細胞因子(IL-4)的表達。這表明rTsCRT可以抑制Th2和Tfh免疫反應。除此之外,PBMC細胞因子轉錄水平變化情況還顯示,IL-17一直處于較高的轉錄水平,且TGF-β的轉錄水平也上調,這表明rTsCRT在宿主體內可能會通過引起宿主空腸肌肉的收縮來達到排除蟲體的效果。

綜上所述,本研究證實旋毛蟲鈣網蛋白(TsCRT)主要通過刺激巨噬細胞活化、增殖,抑制其凋亡來發揮免疫作用;rTsCRT可顯著促進大鼠IFN-γ、IL-17、IL-10、TGF-β、IL-9、IL-22等細胞因子的表達,抑制IL-4、IL-21等表達,結果說明TsCRT可刺激宿主產生Th1、Th17、Treg、Th9、Th22等多種類型的免疫反應,抑制Th2和Tfh免疫,對宿主免疫調節作用復雜。