H9N2 AIV滅活疫苗免疫SPF雞攻毒后肺組織免疫相關基因表達變化研究

李麗,蔣作儀,李茵婧,常麗鳳,辛震東,平繼輝,蘇娟

(南京農業大學動物醫學院,江蘇 南京 210095)

禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)屬于正黏病毒科、流感病毒屬、有包膜的RNA病毒[1]。H9N2 AIV是禽流感病毒的主要亞型之一,在世界多地廣泛分布。H9N2 AIV是一種低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV),然而,與其他病原體混合感染可使患病禽病情加重,導致病死率增加進而給養殖業造成嚴重的經濟損失[2-3]。

在家禽養殖業中通常使用滅活疫苗控制H9N2 AIV感染,盡管體液免疫是禽類抵抗AIV感染的主要保護性免疫,但疫苗接種并不能帶來完全理想的效果,疫情仍持續發生[4]。

由CD4+T和CD8+T細胞介導的細胞免疫反應是抗流感病毒免疫的重要組成部分[5]。CD8+T細胞是主要效應細胞,可殺死受到流感病毒感染的細胞,而CD4+T細胞則產生適應性免疫反應所需的細胞因子[6-7]。流感病毒感染后,活化的CD4+T細胞分化成多種Th細胞亞群,例如Th1、Th2、Th17等[8]。Th1細胞分泌細胞因子IFN-γ、TNF、IL-2等和Th2細胞產生細胞因子IL-4、IL-5、IL-13等參與細胞免疫反應[9-11]。已有研究表明,小鼠經皮膚接種cGAMP佐劑多價流感mRNA疫苗利于平衡Th1/Th2型反應,增加脾臟中IFN-γ、IL-4分泌細胞和病毒特異性CD8+T細胞以及肺中CD4+常駐記憶T細胞(TRM)數量,并對同源毒株提供完全保護[12]。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和自然殺傷細胞(NK)通過穿孔素/顆粒酶和Fas-FasL途徑誘導靶細胞凋亡進而發揮免疫調節的作用[13]。雞T細胞已被證明在抵抗病毒感染、提供持久和交叉保護方面發揮關鍵作用,并具有開發通用疫苗的潛力[14]。

然而目前關于已免疫動物受同源病毒攻擊后肺組織中免疫相關基因表達變化的研究報道較少。因此,本研究基于H9N2 AIV疫苗免疫后再次發生病毒感染,機體仍向體外排毒這一重要臨床現象,通過探究在H9N2 AIV滅活疫苗免疫情況下,H9N2 AIV感染SPF雞后排毒情況、呼吸道器官的形態學變化以及肺組織中免疫相關因子的表達水平差異,以期了解H9N2 AIV滅活疫苗在肺組織中發揮免疫作用及不能有效抑制H9N2流感感染的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組處理

36只3周齡SPF雞購自濟南賽斯家禽科技有限公司。SPF雞隨機分為對照組(Con)、攻毒組(Flu)、免疫后攻毒組(Vac+Flu)3組。免疫后攻毒組,以A/chicken/Anhui/BRI-99/2017(H9N2)(簡稱：Anhui/99 H9N2)毒株制備的油乳劑滅活疫苗在每只雞頸背部皮下免疫接種0.4 mL,對照組和攻毒組雞免疫無菌PBS。3周后,通過滴鼻點眼的方式用同源病毒Anhui/99進行攻毒,攻毒劑量為每只1×106EID50。對照組用等量PBS滴鼻點眼。攻毒后觀察各組SPF雞臨床癥狀并做好記錄。

1.2 樣品采集及處理

在攻毒后1、3、5和7 d,對每組SPF雞采集喉頭和泄殖腔拭子,分別置于含1 mL樣品保存液(含青、鏈霉素)的2 mL離心管中,-80 ℃保存。采集血液樣品,靜置30 min,3 000g離心10 min后取血清,-20 ℃保存備用。同時每組3只雞通過頸動脈放血處死,采集氣管、肺臟,其中一部分放入液氮速凍,后轉入-80 ℃冰箱保存,另一部分置于4%多聚甲醛中固定。

1.3 血凝抑制(HI)抗體測定

在96孔V型血凝板的1～12孔分別加入25 μL滅菌PBS緩沖液,吸取25 μL待檢血清加至第1孔,反復吹打混勻。依次從前一個孔中吸取25 μL液體加至下一個孔,進行倍比稀釋,至第11孔時棄去 25 μL 液體,最后1個孔為對照孔,然后,每孔加入8單位抗原25 μL,混勻后室溫靜置30 min。隨后每孔加入50 μL 1%的雞紅細胞懸液,室溫靜置30 min。結果判定：傾斜血凝板,從背面觀察,當對照孔的結果成立時,觀察被測樣品孔紅細胞有無呈淚滴狀流淌,記錄紅細胞未發生凝集的最高稀釋倍數。

1.4 SPF雞排毒情況分析

喉頭和泄殖腔拭子樣品經反復擠壓后棄去棉拭子,4 ℃、12 000g離心10 min后取上清液。每個拭子樣品經尿囊腔接種3枚10日齡雞胚,置于37 ℃溫箱培養48 h。48 h后收集每個雞胚的尿囊液,檢測雞胚尿囊液HA效價,分析各組SPF雞的呼吸道和泄殖腔排毒情況。

1.5 RT-PCR法檢測肺組織中流感病毒M基因的表達

稱取20 mg肺組織,加入液氮后快速研磨均勻,用RNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司)提取總RNA。測定總RNA濃度后用DEPC水將其稀釋為500 ng·μL-1,利用反轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司)將RNA反轉錄為cDNA。PCR反應體系：TaqMix 12.5 μL,雙蒸水8.5 μL,cDNA 2 μL,上、下游引物各1 μL。以H9N2 AIV的M基因序列設計PCR擴增引物,并以GAPDH為內參基因。引物序列見表1。PCR擴增結束后,瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增結果。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of the target genes

1.6 HE染色觀察氣管、肺臟組織的病理變化

氣管和肺組織經4%多聚甲醛固定48 h后,修剪出適當大小的組織塊,放入梯度濃度乙醇中脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片(厚度為5 μm)。蘇木精-伊紅(HE)染色,脫水透明后用中性樹膠封片。最后利用光學顯微鏡(尼康,日本)觀察并拍照。

1.7 免疫組織化學染色檢測病毒抗原

將制備好的石蠟切片進行脫蠟、水化,再放入3%H2O2溶液封閉,置于0.01 mol·L-1檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中(pH6.0)進行抗原修復,滴加BSA封閉液并于37 ℃溫箱中封閉40 min。棄封閉液,切片上滴加一抗(鼠源流感病毒核蛋白抗體,1∶1 000稀釋)并置于4 ℃過夜,陰性對照用PBS替代一抗。第2天,PBS緩沖液沖洗后用HRP標記抗鼠IgG(Proteintech,USA)在室溫孵育0.5 h。滴加DAB顯色工作液50～100 μL,室溫孵育5～10 min。蒸餾水潤洗15 s以終止顯色;蘇木素復染2 min,蒸餾水潤洗5 min。置于梯度濃度乙醇中脫水,放入二甲苯2 min后,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。結果判定：在顯微鏡下視野中細胞核/或細胞質出現棕黃色染色為病毒陽性反應。

1.8 RT-qPCR法檢測肺臟中免疫相關基因mRNA相對表達水平

提取肺臟組織RNA并反轉錄為cDNA,步驟同1.5節。用SYBR Green酶(南京諾唯贊生物科技公司)進行熒光定量PCR,體系為10 μL,包括SYBR Green 5 μL,上、下游引物各0.5 μL,雙蒸水3 μL,cDNA 1 μL。以GAPDH為內參基因,每個樣品3次重復。用熒光定量PCR儀(Roche)按照擴增程序進行擴增反應。結果用2-ΔΔCT法進行相對定量分析。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

1.9 數據處理與結果統計

2 結果與分析

2.1 攻毒后各組SPF雞臨床癥狀

H9N2 AIV感染后,對照組和免疫后攻毒組SPF雞均未出現臨床癥狀,精神狀況、采食狀況良好。感染后,攻毒組SPF雞出現精神沉郁,食欲下降,咳嗽、打噴嚏等輕度呼吸系統癥狀。說明SPF雞提前接種滅活疫苗可改善H9N2 AIV引起的輕微臨床癥狀。

2.2 各組SPF雞HI抗體水平

通過血凝抑制試驗監測SPF雞免疫H9N2 AIV滅活疫苗后攻毒對血清抗體水平的影響。結果如圖1所示,對照組SPF雞血清中抗H9N2 AIV的HI抗體為陰性。攻毒組在感染后第1、3天未檢測到HI抗體,在第5天檢測到HI抗體,抗體滴度(log2)平均值為4.5。在第9天,攻毒組中抗體滴度(log2)平均值為8.3。免疫后攻毒組在試驗期間抗體滴度都大于6,第9天的抗體滴度(log2)平均值為11。感染后第5、9天,免疫后攻毒組的HI抗體滴度均極極顯著高于對照組、攻毒組(P<0.001),感染后第7天,免疫后攻毒組HI抗體滴度與攻毒組差異不顯著(P>0.05)。從整體來看,SPF雞接種H9N2 AIV后可產生較高的H9N2亞型AIV抗體效價。

圖1 H9N2 AIV滅活疫苗免疫后攻毒在不同時間 點SPF雞體內HI抗體水平Fig.1 HI antibody levels in SPF chickens at different time points after immunization with H9N2 AIV inactivated vaccine and followed by viral infectionCon、Flu、Vac+Flu分別代表對照組、攻毒組和免疫后攻毒組。下同。Con,Flu and Vac+Flu represent the control group,the challenge group and the immunization followed challenge group,respectively. The same below.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. The same below.

2.3 滅活疫苗免疫并攻毒后不同臟器中的病毒水平檢測與鑒定

2.3.1 咽喉/泄殖腔的病毒水平咽喉/泄殖腔的病毒水平如表2所示,在感染后的第3、5天,攻毒組在咽喉、泄殖腔中均能檢測到病毒,其中咽喉的排毒率最高;而免疫后攻毒組在感染后第3、5天,只有在咽拭子中檢測到病毒。SPF雞提前接種滅活疫苗,病毒感染后仍能檢測到機體排毒,說明H9N2 AIV滅活疫苗不能提供完全免疫保護。

表2 SPF雞接種H9N2 AIV滅活疫苗并攻毒后的排毒情況Table 2 The virus shedding of SPF chickens after inoculation with H9N2 AIV inactivated vaccine and followed by viral infection

2.3.2 肺組織中的病毒檢測研究表明流感病毒感染可對肺組織造成損傷,因此,本研究對攻毒后第1、3、5和7天肺組織中的流感病毒M基因表達進行測定。如圖2所示：在感染后第3、5天,攻毒組在肺組織中均能檢測到流感病毒M基因的表達;免疫后攻毒組肺臟組織中僅在感染后第5天檢測到流感病毒M基因的表達。以上結果表明H9N2滅活疫苗免疫可以明顯抑制流感病毒在肺臟組織中的復制,但不能完全抑制。

圖2 H9N2 AIV滅活疫苗免疫并攻毒后在不同時間點SPF 雞肺臟組織中流感病毒M基因表達情況Fig.2 The expression of influenza virus M gene in lung tissues of SPF chickens at different time points after immunization with H9N2 AIV inactivated vaccine and followed by viral infection

2.4 滅活疫苗免疫并攻毒后氣管、肺臟組織病理變化

免疫H9N2 AIV滅活疫苗后病毒感染對SPF雞氣管以及肺組織形態學變化的影響結果如圖3所示。對照組SPF雞氣管黏膜比較完整,無脫落,肺組織有散在的少量紅細胞、炎性細胞。感染后第3天,攻毒組氣管有黏膜層脫落現象,免疫后攻毒組無明顯病變。感染后第5天,攻毒組氣管黏膜層炎性細胞增多,免疫后攻毒組氣管有輕微的黏膜層脫落現象。感染后第7天,攻毒組和免疫后攻毒組氣管未見明顯病變。在感染后第3天,攻毒組和免疫后攻毒組肺臟組織可見散在大量紅細胞和少量炎性細胞。在感染后第5、7天,攻毒組中可見肺臟組織結構損傷加劇,大量炎癥細胞聚集,肺泡間隔明顯增厚。免疫后攻毒組肺臟組織紅細胞、炎性細胞數量相較對照組明顯增多,但損傷程度輕于攻毒組。以上結果表明,免疫后攻毒組中SPF雞氣管、肺組織損傷輕于攻毒組;疫苗免疫可以有效減輕H9N2亞型流感病毒對SPF雞氣管、肺組織的損傷。

圖3 H9N2 AIV滅活疫苗免疫后攻毒在不同時間點對SPF雞氣管、肺臟組織形態的影響Fig.3 The effect of immunization with H9N2 AIV inactivated vaccine and followed by viral infection on the morphology of trachea and lung in SPF chickens at different time points 黃色箭頭示氣管黏膜層脫落,黑色箭頭示肺組織中散在的大量紅細胞,紅色箭頭示肺組織中聚集的炎性細胞。The yellow arrow indicates the detachment of the tracheal mucosal layer,the black arrow indicates a large number of scattered red blood cells in the lung tissue,and the red arrow indicates the accumulation of inflammatory cells in the lung tissue.

2.5 滅活疫苗免疫并攻毒后氣管和肺組織病原學觀察

通過免疫組織化學方法來檢測病毒感染后SPF雞氣管和肺臟組織中流感病毒抗原核蛋白(NP)的表達情況。結果如圖4所示：在感染后第3天,攻毒組和免疫后攻毒組氣管中均可檢測到大量NP蛋白存在,攻毒組肺臟組織中有大量NP蛋白存在,而免疫后攻毒組肺臟組織中基本無NP蛋白存在。在感染后第5天,攻毒組氣管和肺臟組織有大量NP蛋白存在,免疫后攻毒組氣管、肺臟組織可見少量NP蛋白存在。在感染后第7天,攻毒組及免疫后攻毒組氣管中僅見少量NP蛋白存在,肺臟組織中均未見NP蛋白存在。以上結果表明,疫苗免疫可以明顯抑制流感病毒在氣管、肺臟組織中的復制。

圖4 H9N2 AIV滅活疫苗免疫后攻毒在不同時間點SPF雞氣管和肺組織中NP蛋白表達情況Fig.4 The expression of NP protein in trachea and lung tissues of SPF chickens after immunization with H9N2 inactivated AIV vaccine and followed by viral infection at different time points箭頭表示NP抗原陽性。Arrows indicate NP antigen positivity.

2.6 滅活疫苗免疫并攻毒后肺組織中CD4和CD8分子基因表達的變化

白細胞表面分化抗原CD4和CD8在宿主免疫應答中發揮著重要作用[15],因此,本試驗檢測了SPF雞免疫H9N2 AIV滅活疫苗后再感染流感病毒對肺組織中CD4和CD8表達的影響。結果如圖5所示：感染后第5天,免疫后攻毒組雞肺臟中CD4 mRNA表達量與對照組相比顯著升高(P<0.05),與攻毒組相比略有升高但差異不顯著(P>0.05);感染后第7天,攻毒組雞肺臟中CD8 mRNA表達量極顯著高于對照組、免疫后攻毒組(P<0.01)。以上結果表明,先免疫后病毒感染能夠促進肺組織中CD4分子基因的表達,而病毒感染能促進肺組織中CD8分子基因的表達。

圖5 H9N2 AIV滅活疫苗免疫后攻毒不同時間點肺組織中CD4、CD8基因的表達Fig.5 The expression of CD4 and CD8 genes in lung tissue at different time points after immunization with H9N2 AIV inactivated vaccine and followed by viral infection

2.7 滅活疫苗免疫并攻毒后對肺組織Th1/Th2細胞分化特異性轉錄因子及細胞因子基因表達的影響

GATA3和T-bet分別是Th2和Th1細胞特異性轉錄因子,IL-4、IL-13為Th2細胞標志性細胞因子,IFN-γ、TNF-α為細胞毒性Th1細胞標志性細胞因子[9-10]。以上因子可調節T細胞分化、參與細胞免疫反應,本試驗檢測了SPF雞免疫H9N2 AIV滅活疫苗后再感染流感病毒對肺組織中上述因子表達的影響。結果如圖6所示：感染后第5天,免疫后攻毒組GATA3 mRNA表達量顯著高于對照組(P<0.05),極顯著高于攻毒組(P<0.01)。感染后第7天,攻毒組T-betmRNA表達量極顯著高于對照組(P<0.01)。雖然攻毒組T-betmRNA表達量高于免疫后攻毒組但差異不顯著(P>0.05)。感染后第5天,免疫后攻毒組IL-4 mRNA表達量極顯著高于對照組和攻毒組(P<0.001);感染病毒后,雞肺組織中IL-13 mRNA表達量在各組之間差異均不顯著(P>0.05)。感染后第3天,免疫后攻毒組TNF-αmRNA表達量極顯著高于攻毒組(P<0.01),也高于對照組但差異不顯著(P>0.05);感染后第7天,攻毒組與免疫后攻毒組中TNF-αmRNA表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。感染后第5天,攻毒組IFN-γmRNA表達量極顯著高于對照組、免疫后攻毒組(P<0.01);感染后第7天,免疫后攻毒組IFN-γmRNA表達量極顯著高于對照組、攻毒組(P<0.001)。以上結果表明,疫苗免疫后病毒感染促進了SPF雞肺組織中Th2細胞轉錄因子及Th1、Th2相關細胞因子的表達以增強細胞免疫反應,而未免疫雞感染病毒則主要促進肺組織中Th1細胞轉錄因子及相關細胞因子的表達進而增強細胞免疫反應。

圖6 H9N2 AIV滅活疫苗免疫后攻毒不同時間點肺組織Th1、Th2細胞分化特異性轉錄因子及細胞因子基因的表達Fig.6 The expression of Th1,Th2 cell differentiation specific transcription factor and cytokines in lung tissue at different time points after immunization with H9N2 AIV inactivated vaccine and followed by viral infection

2.8 滅活疫苗免疫并攻毒后肺組織中細胞毒性相關基因表達的變化

本試驗檢測了SPF雞免疫H9N2 AIV滅活疫苗后再感染流感病毒對肺組織中穿孔素/顆粒酶和Fas和FasL兩種相互作用的細胞溶解途徑相關基因表達的影響。結果如圖7所示：感染后第3天,與對照組相比,攻毒組PerforinmRNA表達量顯著升高(P<0.05),免疫后攻毒組PerforinmRNA表達量極顯著升高(P<0.01)。感染后第7天,攻毒組PerforinmRNA表達量極顯著高于對照組(P<0.01),高于免疫后攻毒組但差異不顯著(P>0.05)。感染后第3天,攻毒組GranzymemRNA表達量極顯著高于對照組(P<0.001),免疫后攻毒組GranzymemRNA表達量極顯著高于對照組(P<0.001)、攻毒組(P<0.01)。感染后第7天,攻毒組GranzymemRNA表達量與對照組相比極顯著升高(P<0.01),與免疫后攻毒組相比顯著升高(P<0.05)。感染后第1天,免疫后攻毒組FasLmRNA表達量顯著高于對照組(P<0.05),高于攻毒組但差異不顯著(P>0.05)。感染后第5天,免疫后攻毒組FasLmRNA表達量顯著高于攻毒組(P<0.05)。感染后,FasmRNA表達量在各組之間差異不顯著(P>0.05)。以上結果表明,流感病毒在肺臟組織中可能主要通過促進穿孔素/顆粒酶途徑相關基因的表達引發細胞毒性反應進而引起T細胞介導的流感病毒在肺組織中被清除。

圖7 H9N2 AIV滅活疫苗免疫后攻毒不同時間點肺組織中細胞毒性相關基因的表達Fig.7 The expression of cytotoxicity related genes in lung tissue at different time points after immunization with H9N2 AIV inactivated vaccine and followed by viral infection

3 討論

H9N2 AIV感染對家禽養殖業影響巨大,而疫苗接種仍然是控制和預防AIV在家禽中傳播的最有效方法。目前,大多數商用禽流感疫苗是全病毒滅活疫苗[16]。但滅活疫苗只能刺激體液免疫,無法有效抑制禽流感病毒在群體中的復制和傳播[8]。禽流感滅活疫苗免疫后血清中HI抗體滴度是反映免疫效果的重要指標。本研究結果表明SPF雞接種滅活疫苗后10 d內HI抗體效價就可達到6以上。H9N2 AIV在禽類之間可通過消化道或呼吸道傳播[17-18]。有研究發現,SPF雞提前接種H9N2 AIV滅活疫苗或HA突變體滅活苗,流感病毒感染后仍能在口咽、泄殖腔中檢測到不同程度的病毒脫落[19]。本研究結果表明,對SPF雞提前進行免疫保護可減少病毒感染后經咽喉、泄殖腔的排毒,但仍不能完全阻斷排毒。

有研究發現,提前接種H9N2滅活疫苗的雞再感染AIV后,仍引起輕度肺炎,并在肺臟組織中檢測到H9基因的表達[20]。本試驗中,免疫后攻毒組的SPF雞肺間質有少量紅細胞和炎性細胞聚集,但與攻毒組相比氣管、肺組織結構破壞較輕,說明H9N2 AIV滅活疫苗能減輕流感病毒感染后導致的氣管、肺臟組織結構損傷。本試驗結果與先前的研究一致：免疫后再攻毒通過RT-PCR能檢測到肺組織中流感病毒M基因的表達。免疫組化與RT-PCR結果一致,免疫后再攻毒在肺組織中出現病毒特異性抗原NP陽性信號。這可能與接種滅活疫苗后不產生IgA和IgM,僅出現高水平的IgG,且IgG不能轉運到肺部有關[21]。

已有研究表明,疫苗免疫后促進外周血淋巴細胞(PBL)中CD4+T細胞百分比的增加,而沒有促進CD8+T細胞百分比的增加[16]。本試驗中,只病毒感染促進肺組織中CD8 mRNA表達量的上調,而免疫后病毒感染則促進肺組織中CD4 mRNA表達量的上調。說明在肺組織中,疫苗免疫更易誘導CD4+T細胞反應。Th1、Th2細胞及其產生的細胞因子對調節細胞內外病原體引起的免疫應答反應至關重要[13]。本研究發現,免疫后攻毒能夠增加肺組織中Th2細胞轉錄因子及Th1、Th2相關細胞因子的表達,而只攻毒僅增加肺組織中Th1細胞轉錄因子及相關細胞因子的表達,對Th2細胞轉錄因子及相關細胞因子的表達未產生明顯影響。因此,明確疫苗免疫后攻毒對SPF雞肺組織免疫相關細胞因子表達的影響對完善H9N2滅活疫苗的免疫效果提供研究思路及方向。

有研究者發現,在巨噬細胞中,H9N2感染10 h后FasL基因表達量上調25.1倍[22]。本試驗中,攻毒組雞肺臟中FasL基因表達量與對照組相比未出現顯著差異。有研究者通過全基因組宿主基因表達分析,發現雞感染H5N1病毒會引起肺組織中與炎癥和免疫反應相關基因表達水平的強烈變化,但是在感染H9N2病毒的雞肺組織中大多數這些基因的表達水平保持不變[23]。由此可見,病毒毒株的強弱、檢測樣本或取樣時間點的不同可能會導致結果出現差異。本研究發現,病毒感染后雞肺組織Perforin和Granzyme基因表達量均顯著上調,免疫后攻毒組中肺組織FasL基因表達量顯著上調,而Fas基因表達量在各組肺組織中無顯著差異變化。以上結果提示,病毒感染肺臟后,病毒主要通過穿孔素/顆粒酶途徑引起細胞毒性反應介導流感病毒在肺組織中的清除。

綜上,SPF雞接種滅活疫苗后再進行H9N2 AIV感染,易引起肺組織中Th2、Th1細胞因子的產生,以促進抗體的產生,誘導體液免疫應答。但是免疫后攻毒組SPF雞肺組織在前期通過穿孔素/顆粒酶途徑引起細胞毒性反應能力較強,后期減弱,這可能是導致滅活疫苗免疫保護不足的部分原因。這些發現進一步解釋了H9N2 AIV滅活疫苗在肺組織中發揮免疫作用的機制及可能導致免疫保護不足的原因,但是疫苗免疫對T細胞分化通路的具體影響仍需進一步研究。