巨型艾美耳球蟲Th1類細胞因子刺激性分子EmARM-β對雞PBMC和T細胞亞群免疫功能的影響

蒲響林,潘仰棟,相權珈,孫曉婷,陸明敏,嚴若峰,徐立新,李祥瑞,宋小凱

(南京農業大學動物醫學院,江蘇 南京 210095)

雞球蟲病是由艾美耳球蟲感染引起的一種腸道疾病[1]。雞球蟲侵襲宿主腸道的不同部位[2],破壞腸上皮細胞,導致飼料轉化率降低、體重下降、血便等癥狀,甚至導致宿主死亡,同時還會抑制宿主免疫系統,引起繼發感染,給養禽業帶來了巨大經濟損失[3-6]。目前,雞球蟲病主要以藥物防治為主[7],但耐藥性、藥物殘留、防治費用高等問題限制了藥物的使用[8-10]。雖然傳統球蟲活疫苗如CocciVac和Immucox等在世界范圍內已經投入使用[4,11],但其價格昂貴,難以推廣,且具有導致球蟲病暴發的風險[12-13]。因此,開發安全有效的雞球蟲病新型疫苗迫在眉睫。

CD4+T細胞和CD8+T細胞可釋放相關細胞因子,在抗雞球蟲感染過程中發揮重要作用。而相關研究表明,Th1類細胞因子IFN-γ在雞球蟲保護性免疫中發揮著主導作用[11,14],IFN-γ可作為細胞因子佐劑增強抗原免疫力[15],接種含有IFN-γ的DNA疫苗能提高雞腸道免疫力水平并對雞球蟲病有保護作用[16]。用重組IFN-γ處理雞胚成纖維細胞后,柔嫩艾美耳球蟲在細胞內的發育受到了抑制[17]。體內接種重組IFN-γ后可有效減少堆型艾美耳球蟲卵囊產量并增加雛雞體重[18]。IFN-γ還可以刺激巨噬細胞的吞噬作用以及NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的殺傷作用,從而在調節抗球蟲免疫反應過程中發揮重要作用[19]。因此發現能刺激Th1類細胞因子分泌的分子是研發雞球蟲病新型疫苗的理想候選抗原。

Armadillo/β-catenin樣重復序列蛋白(ARM-β)為果蠅體節極性蛋白Armadillo的同源物[20],含有一個大約42個氨基酸的重復偶聯序列[21-22],在動物界普遍存在,其在信號傳導、發育、細胞黏附和遷移以及腫瘤轉移等方面發揮作用[23]。對頂復門原蟲研究發現其可激活宿主免疫反應,具有作為疫苗候選抗原的潛力。如Udonsom等[24]發現犬新孢子蟲ARM蛋白能被速殖子陽性牛血清所識別,具有顯著的特異免疫反應性,提示其可作為防控犬新孢子蟲病良好的疫苗候選抗原或藥物靶標。Chen等[25]發現EmARM-β免疫雛雞后,可抵抗巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima,E.maxima)感染。

本課題組前期從E.maxima子孢子cDNA表達文庫中篩選到了EmARM-β,發現其能刺激雞體Th1類細胞因子的分泌,為進一步探究其對雞免疫細胞功能的影響,將其分別與雞PBMC、CD8+T細胞及CD4+CD25-T細胞進行共孵育,觀察其對上述細胞增殖能力及免疫相關功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質粒和試驗動物E.maximapET-28a-arm-β的菌種及重組質粒保存于南京農業大學獸醫寄生蟲病實驗室。海蘭白雛雞飼養在經滅菌、消毒的無雞球蟲卵囊雞舍中;自由飲水和采食;飲水及飼料均不含任何抗球蟲藥物。

1.1.2 主要試劑及儀器His標簽蛋白純化柱為GE Healthcare產品;人外周血淋巴細胞分離液購于天津灝洋公司;Total RNA Extraction Reagent及HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)購于Vazyme公司;PerfectStartTMGreen qPCR Super Mix(+DyeⅡ)購于Transgen;ToxinEraserTMEndotoxin Removal Kit為GenScript產品;小鼠抗雞CD4和小鼠抗雞CD8α抗體購于Southernbiotech公司;Anti-PE MicroBeads,Anti-FITC MultiSort MicroBeads和磁珠分選系統購于Miltenyi Biotec;CCK-8試劑購自碧云天公司;細胞培養箱、酶標儀和水平離心機購于Thermo Scientific;熒光定量PCR儀為ABI公司產品。

1.2 方法

1.2.1 EmARM-β重組蛋白(rEmARM-β)的表達及純化用含有pET-28a-arm-β質粒的菌種表達EmARM-β重組蛋白,超聲破碎菌體,獲取蛋白樣品。將蛋白樣品依次用0.8、0.45和0.22 μm的濾器過濾后,使用His標簽蛋白純化柱純化蛋白,再進行SDS-PAGE凝膠電泳以確定其純化效果。用內毒素去除試劑盒去除蛋白樣品中的內毒素,然后用0.22 μm的濾器過濾除菌,最后用BCA蛋白測定法測定重組蛋白濃度。

1.2.2 rEmARM-β的Western blot驗證以E.maxima感染雞血清(未感染雞血清作為陰性對照)或His-tag小鼠單克隆抗體作為一抗,HRP標記的山羊抗雞IgG或HRP標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗,對重組蛋白進行Western blot驗證。按如下操作,用SDS-PAGE凝膠電泳分離rEmARM-β,將其轉印至PVDF膜。50 g·L-1脫脂奶粉對PVDF膜進行封閉后將其分別與感染雞血清(1∶100稀釋)和His-tag小鼠單克隆抗體(1∶8 000 稀釋)4 ℃孵育過夜,然后將其分別與HRP標記的山羊抗雞IgG(1∶5 000稀釋)和HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h,滴加ECL發光液,在全自動發光成像系統中顯影,觀察結果。

1.2.3 雞PBMC的分離及培養用無菌采血管(含4%枸櫞酸鈉)給健康雛雞心臟采血,將抗凝血與無菌PBS按1∶1比例(體積比)輕柔混合,將5 mL稀釋雞血沿管壁緩慢加入含有5 mL淋巴細胞分離液的 15 mL 離心管中,室溫下500g離心20 min。吸取第2層乳白色淋巴細胞層,并轉移至新的15 mL離心管中,用無菌PBS洗滌2次。最后用含有10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640完全培養基重懸細胞,計數細胞,調整細胞密度為1×106mL-1。

1.2.4 雞CD8+T細胞的磁珠分選分離雞PBMC,用含有0.5% BSA、2 mmol·L-1EDTA的PBS調整細胞密度為1×108mL-1(PBS使用前需4 ℃預冷),每1 mL加入40 μL藻紅蛋白(Phycoerythrin,PE)標記的小鼠抗雞CD8α熒光抗體,均勻混合后于4 ℃避光孵育30 min。每1×108個細胞加入10～20 mL的PBS,混勻后300g離心10 min,洗去未結合的抗體。根據Anti-PE MicroBeads說明書加入二抗磁珠,于4 ℃避光孵育15 min,將1×108個細胞加入10～20 mL的PBS,混勻后300g離心10 min,洗去未結合的抗體。用PBS重新調整細胞密度為1×108mL-1,根據磁珠分選系統說明書進行細胞磁珠分選,留在分選柱上的細胞為雞CD8+T細胞,向分選柱中加入5 mL PBS,并用針芯推盡液體,獲得陽性細胞。

1.2.5 雞CD4+CD25-T細胞的磁珠分選將分離好的雞PBMC用PBS調整細胞密度為1×108mL-1,每 1 mL 加入40 μL FITC標記的人抗雞CD25熒光抗體,均勻混合后于4 ℃避光孵育30 min,再加入預冷的PBS,混勻后300g離心10 min,洗去未結合的抗體。根據Anti-FITC MultiSort Kit說明書加入Anti-FITC MultiSort MicroBeads,于4 ℃避光孵育15 min,用PBS洗去未結合的抗體。用PBS調整細胞密度為1×108mL-1,根據磁珠分選系統說明書進行細胞磁珠分選,留在分選柱上的細胞為雞CD25+細胞,流出細胞為雞CD25-細胞。用PBS將流出細胞調整細胞密度為1×108mL-1,根據說明書將PE標記的小鼠抗雞CD4熒光抗體和Anti-PE MicroBeads二抗磁珠依次與細胞孵育后進行細胞磁珠分選,獲得雞CD4+CD25-T細胞。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞分選純度將空白細胞、分選前細胞和分選后細胞制成細胞懸液,用流式細胞儀對細胞懸液進行流式檢測,檢驗細胞分選純度。

1.2.7 rEmARM-β對細胞增殖能力影響用RPMI 1640完全培養基將分離的雞PBMC以及分選后的雞CD8+T細胞和CD4+CD25-T細胞調整細胞密度為1×106mL-1,然后鋪到96孔細胞培養板上,每孔100 μL。將rEmARM-β以不同質量濃度(10、20、40和80 μg·mL-1)與上述細胞共孵育,并設置PBS陰性對照組和 3 μg·mL-1ConA或2 μg·mL-1LPS陽性對照組。將細胞培養板置于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中培養 24 h,每孔加入10 μL的CCK-8試劑,繼續避光培養4 h。同時設置只加入10 μL CCK-8試劑的RPMI 1640完全培養基作為對照組調零。將細胞培養板置于酶標儀,測定450 nm波長處的吸光值。細胞增殖指數以陰性對照組D450值為100%進行計算。

1.2.8 qPCR檢測rEmARM-β對雞PBMC相關細胞因子mRNA表達水平影響將分離的雞PBMC調整細胞密度為1×106mL-1,鋪于12孔細胞培養板,每孔2 mL。將不同質量濃度的rEmARM-β(10、20、40和80 μg·mL-1)與雞PBMC共孵育6 h,并設置PBS陰性對照組和2 μg·mL-1LPS陽性對照組。收集細胞,采用Trizol法提取細胞總RNA,利用反轉錄試劑獲取cDNA。用于qPCR的細胞因子特異性引物由NCBI的Primer-BLAST設計,并以β-actin作為內參基因。特異性引物及其相關信息見表1。根據說明書配制總體系為10 μL 的qPCR反應體系,包括2×PerfectStartTMGreen qPCR Super Mix(+Dye Ⅱ)5 μL,cDNA模板1 μL,上、下游引物各0.2 μL,Rnase-free ddH2O 3.6 μL。反應程序為94 ℃預變性30 s;循環反應：94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環;熔解曲線建立程序：95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT法計算細胞因子mRNA相對表達水平,分析rEmARM-β對雞PBMC細胞因子mRNA表達水平的影響。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for the quantitative real-time PCR

1.2.9 qPCR檢測rEmARM-β對雞CD8+T細胞和CD4+CD25-T細胞細胞因子mRNA表達水平影響將20 μg·mL-1rEmARM-β與3 μg·mL-1ConA共刺激雞CD8+T細胞或CD4+CD25-T細胞,并設置ConA+PBS陰性對照組和ConA+2 μg·mL-1LPS陽性對照組。于5% CO2細胞培養箱中37 ℃培養6 h,收集細胞,采用Trizol法提取細胞總RNA,反轉錄為cDNA,進行qPCR檢測。采用2-ΔΔCT法計算細胞因子mRNA相對表達水平,分析rEmARM-β對雞CD8+T細胞和CD4+CD25-T細胞相關細胞因子mRNA表達水平的影響。特異性引物及其相關信息見表1。

1.2.10 qPCR檢測rEmARM-β對雞CD8+T細胞介導細胞殺傷相關基因mRNA表達水平影響操作步驟同1.2.9節,將收集到的細胞用Trizol法提取細胞總RNA,反轉錄為cDNA,進行qPCR檢測。采用2-ΔΔCT法計算介導細胞殺傷相關基因mRNA相對表達水平,分析rEmARM-β對雞CD8+T細胞介導細胞殺傷相關基因mRNA表達水平的影響。特異性引物及其相關信息見表1。

1.3 數據的統計分析

使用SPSS 23.0系統軟件進行統計和分析,采用one-way ANOVA Duncan’] s法對各組進行組間差異分析。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白EmARM-β的表達、純化及Western blot驗證

對重組蛋白EmARM-β進行表達,其表達情況如圖1-A所示,重組蛋白為可溶性蛋白,且隨著時間的延長,其表達量越來越高。用His標簽蛋白純化柱對rEmARM-β進行純化,將純化前及純化后蛋白樣品進行SDS-PAGE,結果如圖1-B。從圖中可以看出：rEmARM-β在相對分子質量25×103左右出現單一清晰的目的條帶,與預期蛋白相對分子質量一致,表明蛋白純化效果良好。

圖1 rEmARM-β的表達、純化及Western blot驗證Fig.1 The expression,purification,and Western blot identification of rEmARM-β A. rEmARM-β的表達(M. 標準分子質量蛋白;1～2. pET-28a誘導表達0和5 h后產物;3～8. rEmARM-β誘導表達0～5 h后產物)。B. rEmARM-β的純化(M. 標準分子質量蛋白;1. rEmARM-β純化前;2. rEmARM-β純化后)。C. rEmARM-β的Western blot驗證(M. 標準分子質量蛋白;1. E.maxima感染雞血清識別rEmARM-β;2. 陰性雞血清識別rEmARM-β;3. His-tag小鼠單克隆抗體識別rEmARM-β)。A. The expression of rEmARM-β(M. Standard protein molecular marker;1-2. pET-28a induced by IPTG for 0 and 5 h;3-8. EmARM-β induced by IPTG for 0-5 h). B. The purification of rEmARM-β(M. Standard protein molecular marker;1. rEmARM-β before purification;2. Purified rEmARM-β). C. The Western blot identification of rEmARM-β(M. Standard protein molecular marker;1. The recognition of rEmARM-β by chicken anti-E.maxima serum;2. The recognition of rEmARM-β by negative chicken serum;3. The recognition of His-tag in rEmARM-β by His-tag mouse monoclonal antibody).

分別使用巨型艾美耳球蟲感染雞血清和His-tag小鼠單克隆抗體識別rEmARM-β,從Western blot結果(圖1-C)可以看出：感染雞血清識別出1條相對分子質量為25×103左右的條帶(泳道1),這與rEmARM-β的相對分子質量一致;同時His-tag小鼠單克隆抗體也識別出1條相對分子質量為25×103左右的條帶(泳道3);作為對照,未感染雞血清并沒有識別出rEmARM-β(泳道2)。

2.2 雞CD8+T細胞和CD4+CD25-T細胞的磁珠分選

如圖2所示：分選前CD8+T細胞占總外周血單個核細胞的比例為16.34%(A2),細胞分選后,比例提高為93.01%(A3);分選前CD4+CD25-T細胞占總外周血單個核細胞的比例為12.14%(B2),細胞分選后,比例提高為88.88%(B3),基本符合后續細胞共孵育試驗。

2.3 rEmARM-β對細胞增殖能力的影響

細胞增殖能力檢測結果如圖3所示：與陰性對照PBS組相比,陽性對照ConA組能顯著促進雞PBMC、CD8+T細胞及CD4+CD25-T細胞的增殖能力(P<0.05)。80 μg·mL-1rEmARM-β能顯著促進雞PBMC的增殖能力(P<0.05);rEmARM-β在各濃度均能顯著促進雞CD8+T細胞及CD4+CD25-T細胞的增殖(P<0.05),且增殖能力隨濃度的增加而逐漸加強。

圖3 rEmARM-β對雞PBMC和T細胞亞群增殖能力的影響Fig.3 Effects of rEmARM-β on proliferation of PBMC and T cell subsets PBS：陰性對照組;ConA(LPS)：陽性對照組。采用one-way ANOVA Duncan’] s法對各組進行組間差異分析,字母不相同表示差異顯著(P<0.05)。下同。PBS：Negative control group;ConA(LPS)：Positive control group. Differences among groups were analyzed by one-way ANOVA Duncan’] s method;the different letters indicate significant difference(P<0.05). The same below.

2.4 rEmARM-β對雞PBMC細胞因子mRNA表達水平的影響

如圖4所示：與陰性對照PBS組相比,rEmARM-β均可以顯著上調雞PBMCifn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-10、il-17a和tgf-β1 mRNA表達水平(P<0.05)。

圖4 rEmARM-β對雞PBMC Th1、Th2、Treg類以及促炎性細胞因子mRNA水平的影響Fig.4 Effects of rEmARM-β on the mRNA levels of Th1,Th2,Treg and proinflammatory cytokines in chicken PBMC

2.5 rEmARM-β對雞CD8+T細胞和CD4+CD25-T細胞細胞因子mRNA表達水平的影響

如圖5所示：與陰性對照PBS+ConA組相比,rEmARM-β可以顯著上調雞CD8+T細胞ifn-γ、il-2和tnf-αmRNA表達水平(P<0.05)(圖5-A),顯著上調雞CD4+CD25-T細胞ifn-γ、il-2和tgf-β1 mRNA表達水平,顯著下調il-4和il-10 mRNA表達水平(P<0.05)(圖5-B)。

圖5 rEmARM-β對雞CD8+T細胞(A)和CD4+CD25-T細胞(B)細胞因子mRNA水平的影響Fig.5 Effects of rEmARM-β on the mRNA levels of cytokines in chicken CD8+T cells(A) and CD4+CD25-T cells(B)PBS+ConA：陰性對照組Negative control group;LPS+ConA：陽性對照組Positive control group.

2.6 rEmARM-β對雞CD8+T細胞介導細胞殺傷相關基因mRNA表達水平的影響

結果如圖6所示：與陰性對照PBS+ConA組相比,rEmARM-β可以顯著上調雞CD8+T細胞穿孔素(pf)、fasl和fas基因mRNA表達水平(P<0.05),對顆粒酶A基因(gram-a)mRNA表達水平差異不顯著(P>0.05)。

圖6 rEmARM-β對雞CD8+T細胞介導細胞 殺傷相關基因mRNA水平影響Fig.6 Effects of rEmARM-β on the mRNA levels of mediated cell killing genes in chicken CD8+T cells

3 討論

雞球蟲病嚴重威脅家禽的生產福利,對家禽養殖業造成了巨大的經濟損失[5,26]。在抗雞球蟲感染過程中,細胞免疫發揮著主導作用[27-28],細胞免疫主要由T淋巴細胞、NK細胞等介導,而CD4+輔助性T細胞(Th細胞)和CD8+細胞毒性T細胞(CTL)均參與宿主抗雞球蟲感染免疫反應并發揮著重要的作用[29],通過其細胞增殖試驗或細胞亞群比例可以初步確定雞球蟲病疫苗的免疫保護效果。CD4+T細胞可通過分泌細胞因子激活NK細胞和巨噬細胞以及自身分泌IFN-γ以抵抗艾美耳球蟲感染[30];激活的CD8+T細胞可通過細胞殺傷作用以及分泌IFN-γ和TNF-α等在球蟲感染過程中起作用[11,31]。給雛雞注射抗CD8單克隆抗體后再感染Eimeriatenella和Eimeriaacervulina,發現卵囊排出量明顯增加[32]。用抗CD4單克隆抗體處理雛雞后再感染球蟲,同樣出現卵囊排出量大幅增加,病變加重等現象[27]。本研究將rEmARM-β分別與雞PBMC、CD8+T細胞及CD4+CD25-T細胞進行共孵育,發現上述細胞增殖能力均得到顯著促進,說明EmARM-β可以有效激活免疫反應。CTL可以通過FasL/Fas和穿孔素/顆粒酶兩條途徑介導細胞殺傷,而rEmARM-β可以顯著上調雞CD8+T細胞穿孔素(pf)、fasl和fas基因mRNA表達水平,說明其還可以有效促進雞CD8+T細胞介導的細胞殺傷功能。

Th1類細胞因子主要由活化的CD4+Th1細胞和CD8+T細胞分泌[19,33]。在雞球蟲感染過程中,NK細胞分泌IFN-γ及樹突狀細胞(DC)和巨噬細胞分泌IL-12,從而誘導Th1細胞分化,Th1細胞進一步分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子介導細胞免疫,抵抗球蟲感染[11,19,34-35]。因此Th1類細胞因子及其介導的Th1型免疫反應被認為在抵抗雞球蟲感染中起主要作用[36-37]。在雞球蟲感染過程中,Th2、Th17以及Treg型等免疫反應在腸道免疫反應中也發揮著重要作用[14,38]。IL-4主要由Th2細胞分泌,可以促進Th2細胞的分化[39]。除此之外,促炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-17A等可以招募炎性細胞,參與炎癥反應,并促進Th17細胞的分化,參與Th17型免疫反應,有助于機體對球蟲做出反應并消除蟲體[40-43]。本研究中,rEmARM-β可以顯著促進雞PBMC、CD8+T細胞及CD4+CD25-T細胞Th1類細胞因子ifn-γ和il-2 mRNA表達水平,可以顯著促進雞PBMC促炎性細胞因子(il-1β、il-6和il-17a)mRNA表達水平,證實了其刺激Th1類細胞因子和促炎性細胞因子分泌的作用。

CD4+T細胞由Th1、Th2、Th9、Th17、Treg(調節性T細胞)和Tfh(濾泡輔助性T細胞)等亞型細胞組成,每種亞型細胞都可以分泌不同類型的細胞因子來幫助機體應對病原體的侵犯[44]。而輔助性T細胞一般指不表達CD25分子的CD4細胞,即CD4+CD25-T細胞。雞體內的CD4+CD25+T細胞是一種調節性T細胞,其功能為具有免疫抑制作用的免疫細胞,同哺乳動物一樣,這些細胞分泌大量的IL-10和TGF-β等Treg類分子[45]。研究表明,低水平的IL-10會增強宿主抵抗病原體的能力[46-47],高水平的IL-10可抑制CD8+T細胞和CD4+T細胞的活化與增殖[48-49]。在本研究中,利用免疫磁珠分選技術消除掉CD25+細胞,將rEmARM-β與CD4+CD25-T細胞共孵育后,發現CD4+CD25-T細胞的增殖受到促進,il-10 mRNA表達水平受到抑制的現象。有些原蟲感染可能已經進化到刺激Treg細胞高分泌IL-10,進一步抑制IFN-γ介導的T細胞反應和巨噬細胞分泌NO,從而抑制宿主抵抗原蟲感染[50-53]。rEmARM-β與CD4+CD25-T細胞共孵育后,顯著促進了ifn-γ和il-2等Th1類細胞因子的mRNA表達水平而抑制了il-10 mRNA表達水平,進一步驗證了其刺激Th1類細胞因子分泌的作用。

本研究證實EmARM-β能有效促進雞PBMC和T細胞亞群免疫功能,具有研發雞球蟲病新型疫苗候選抗原的潛力。