大豆黃酮影響青春期小鼠乳腺發育的潛在機制

謝娜娜,黃心河,張亞鋒,張源淑,韓正康

(南京農業大學動物醫學院/農業農村部動物生理生化重點開放實驗室,江蘇 南京 210095)

乳腺是一個上皮器官,由導管和小葉間腺泡形成分支網絡。乳腺的發育主要是在出生后完成,經歷了胚胎期、青春期、妊娠期、泌乳期和干奶期幾個不同的階段。在青春期,乳腺組織的初級上皮導管樹開始進入分支形態形成的過程,利于形成初級導管網絡和末端芽。導管分支增殖并伸入乳腺導管上皮細胞中,間質脂肪細胞消失,為妊娠期乳腺發育奠定基礎[1];末端芽在上皮-間充質轉化起主導作用,有利于腺泡芽的發展。而腺泡的形成及泌乳的啟動主要發生于妊娠期和哺乳期[2]。因此青春期乳腺的發育直接決定妊娠期導管延伸和泌乳期腺泡細胞的數量,是動物乳腺發育歷程中的重要過程。

乳腺的生長發育、泌乳和排乳均受到神經、內分泌的調節,激素起主要調控作用。雌激素,特別是雌激素—1,7-β-雌二醇(E2)是卵巢分泌的類固醇激素之一,是哺乳動物自身合成的雌激素中活性最高,也是青春期乳腺細胞的重要“有絲分裂原之一”[3]。Bocchinfuso 等[4]研究發現E2具有促進乳腺腺泡形成、調節導管形態發生、促進乳腺上皮細胞(mammary epithelial cell,MEC)增殖的作用。有研究表明,切除卵巢的大鼠持續應用E2,可使乳腺的DNA含量增加到接近妊娠18～20 d的水平[5];E2可使空懷的山羊和牛乳腺小葉腺泡增加[5]。提示E2對促進乳腺發育具有重要作用。

大豆黃酮(daidzein,DZ)是一種天然的植物雌激素,主要從大豆中提取而來。DZ的化學結構類似哺乳動物的雌激素,其通過取代或阻礙雌激素及相應的受體而發揮作用[6]。研究表明,DZ可以延緩女性絕經過程,促進乳腺發育,發揮雌激素樣活性[7],還能發揮抗炎、抗溶血和抗氧化等非雌激素樣作用[8]。也有研究證實,植物雌激素DZ與乳腺發育有關。1946年,Bennetts首次發現奶牛食用三葉草后,可促進乳腺發育,提高奶產量,提示植物雌激素可促進乳腺發育[9]。1995年,張榮慶等[10]研究發現去卵巢大鼠皮下注射DZ后可增加乳腺質量,提高RNA和DNA的含量,顯著促進乳腺發育。2021年,Chen等[11]研究發現,黃酮類物質黃芩苷可促進青春期小鼠乳腺導管的延長。劉春龍等[12]和Tsugami等[13]先后證明了DZ可促進牛和小鼠乳腺上皮細胞的增殖,對體外誘導小鼠乳腺細胞成導管和腺泡均具有促進作用。本實驗室前期試驗證實,DZ通過促進細胞周期進展從而上調細胞周期蛋白D1(cyclinD1)和D3(cyclinD3)的表達,促進牛乳腺上皮細胞的增殖[14]。以上研究提示,DZ具有促進青春期小鼠乳腺發育的潛力。但DZ作為植物雌激素中的重要一員,目前有關其在調節乳腺發育中的作用研究較少,具體的分子機制仍不清楚。

本研究以青春期C57BL/6雌性小鼠為研究對象,以DZ處理并以雌激素作為陽性對照,通過檢測小鼠體重、采食量、乳腺指數、血液和乳腺組織中E2的含量等基礎指標,觀察乳腺組織形態結構變化和核增殖抗原蛋白(PCNA)的表達情況,并結合細胞周期蛋白的變化等,闡明DZ對青春期小鼠乳腺發育的影響,為大豆黃酮及其他植物雌激素類在畜牧生產和臨床上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑和儀器大豆黃酮(DZ)由南京農業大學韓正康教授贈送;E2(純度≥99%)購自ALfa Aesar;鼠源E2 ELISA檢測試劑盒購自建成生物工程研究所。組織/細胞裂解液RIPA購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白酶抑制劑—苯甲基磺酰氟(PMSF)和細胞周期蛋白D1(cyclinD1)一抗均購自巴傲德科技有限公司;核增殖抗原蛋白(PCNA)購自Proteintech;細胞周期蛋白B1(cylinB1)、雌激素受體β(ERβ)一抗均購自Affinity;β-ACTB一抗、羊抗鼠IgG二抗(AS003)和羊抗兔IgG二抗(AS014)均購自武漢愛博泰克科技有限公司;ECL顯色液購自上海翊圣生物科技有限公司。

儀器：POWER-PAC 300電泳儀(美國BIO-RAD)、POWER-PACHC轉印儀(美國BIO-RAD)、Tanon-3900全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)、BS223S精密電子天平(德國Ssrtorius)、Tecan Spark多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)、Servince高速組織研磨儀(武漢賽維爾)等。

1.1.2 試驗動物2周齡青春期SPF級C57BL/6雌性小鼠購自河南斯克貝期生物科技股份有限公司,許可證號SCXK(浙)2019-0002。飼養于南京農業大學動物實驗中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組及處理小鼠適應1周后,按體重相近原則,隨機均分為3組：對照組(CON組)、大豆黃酮組(DZ組)和雌二醇處理組(E2組),每組16只。飼養環境溫度(22±2)℃、相對濕度50%～60%、光暗周期12 h,自由采食和飲水。每日08：30,DZ組腹腔注射大豆黃酮(100 mg·kg-1);E2組腹腔注射E2(0.2 mg·kg-1),CON組注射等量的無菌PBS。連續注射14或21 d,每7 d稱重1次,每日統計小鼠飼料重,并計算采食量。每2～3 d更換1次墊料。每天觀察小鼠精神狀態,并做記錄。

1.2.2 樣品采集血樣采集：飼養至21、28 d時,所有小鼠禁食12 h,眼球采血,3 000 r·min-1離心獲得血清,-20 ℃保存備用。乳腺組織采集：頸椎脫臼處死小鼠,剖開皮膚,摘取所有乳腺,稱重并拍照。取腹部第5對左側乳腺組織置于固定液,剩余的乳腺組織-80 ℃保存。

1.2.3 血液和乳腺組織中E2含量測定將制備的血清用樣本稀釋液稀釋2倍后備用,用預冷的PBS(0.01 mol·L-1,pH7.4)沖洗組織,去除殘留血液,稱重后將組織剪碎。稱取30 mg剪碎的組織加入270 μL的PBS,并在PBS中加入蛋白酶抑制劑,勻漿機勻漿。ELISA法檢測血液和組織液中E2含量。具體步驟按試劑盒說明書進行。用酶標儀在450 nm波長下測定D450值。按公式計算樣品濃度：Y=39.57x-5.04。式中：Y為樣品濃度(pmol·L-1);x為樣品D450值。

1.2.4 乳腺指數的測定取出所有乳腺稱重并記錄。按公式計算乳腺指數：Y=m/M×100%。式中：Y為乳腺指數(%);m為乳腺濕重(g);M為小鼠體重(g)。

1.2.5 乳腺組織的HE染色參照Pai等[15]的方法,將固定24 h以上的乳腺組織經過脫水、透明、透蠟、包埋、切片與展片和染色等步驟,顯微鏡下觀察并拍照。乳腺導管的量化以乳腺導管數量為指標,利用Image J軟件統計每組5個視野中乳腺導管的數量。

1.2.6 乳腺組織PCNA的免疫組化(IHC)檢測參照吳海琴[16]的方法。具體步驟：石蠟切片脫蠟處理,對切片進行復水,放入抗原修復液水浴15 min;自然冷卻,PBS清洗;將切片放入3%過氧化氫中去除非特異性過氧化物酶;清洗后擦干,5%封閉液封閉90 min;吸去血清,滴加兔源PCNA抗體,孵育過夜;PBS清洗后加羊抗兔二抗IgG,37 ℃溫箱孵育1 h;PBS清洗后滴加SABC孵育1 h;清洗后DAB 顯色,蒸餾水清洗;切片脫水、透明、封片、拍攝及分析。利用Image J軟件統計每組10個視野中陽性細胞數量。

1.2.7 細胞周期相關蛋白和雌激素受體β(ERβ)的Western blot檢測檢測各組小鼠乳腺組織中cyclinD1、cyclinB1和ERβ的表達變化。參照Cohick[17]的方法,稱取乳腺組織30 mg置于EP管中,加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF后勻漿,4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min,收集上清液。加入蛋白上樣緩沖液,使終濃度為1 mg·mL-1。120 g·L-1分離膠、50 g·L-1濃縮膠進行SDS-PAGE電泳,濕法轉印,孵育一抗(cyclinD1、cyclinB1和ERβ一抗均按1∶1 000稀釋),4 ℃振搖過夜。TBST漂洗,cyclinD1加入 1∶10 000 的山羊抗鼠IgG二抗,cyclinB1和ERβ加入1∶10 000稀釋的山羊抗兔IgG二抗,室溫孵育2 h,TBST漂洗,ECL化學發光液處理,凝膠成像系統中曝光拍照。ImageJ軟件檢測各蛋白條帶灰度值,以 β-actin 作內參,目的條帶與其相比得到目的蛋白的相對表達量,然后對數值進行歸一化處理。

1.3 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 大豆黃酮對青春期小鼠體重和采食量的影響

2.1.1 小鼠體重變化從圖1可知：試驗起始階段各組小鼠體重大致相近;從21 d開始,DZ和E2處理組小鼠平均體重均極顯著高于對照組(P<0.01);28 d時DZ和E2處理組小鼠的體重顯著增加;體重增加由高到低依次為E2組、DZ組、對照組。

圖1 大豆黃酮對青春期小鼠體重的影響(n=8)Fig.1 Effects of daidzein on body weight of adolescent mice(n=8) CON：對照組;DZ：大豆黃酮組;E2：雌二醇組。*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下同。CON：Control group;DZ：Daidzein group;E2：1,7-β-estradiol group. *shows significant difference compared with control group(P<0.05);**shows very significant difference compared with control group(P<0.01). The same as follows.

2.1.2 小鼠采食量變化由圖2可知：試驗剛開始階段,采食量基本相同;隨著時間的推移,與對照組相比,DZ處理組小鼠的采食量增加;3組小鼠采食量由高到低的處理依次為DZ組、E2組、對照組。

圖2 DZ對青春期小鼠日采食量的影響(n=8)Fig.2 Effects of daidzein on daily food intake of adolescent mice(n=8)

2.2 大豆黃酮對青春期小鼠血清和乳腺組織中E2含量的影響

血清結果見表1。與對照組相比,飼養21 d DZ處理組血清中E2含量增加,但未有顯著性差異,E2處理組E2含量顯著增加(P<0.05);飼養28 d DZ和E2處理組血清中E2含量極顯著增加(P<0.01)。

表1 DZ對青春期小鼠血清和乳腺組織中E2水平的影響(n=8)Table 1 Effect of daidzein on E2 level in serum and mammary gland of adolescent mice(n=8) pmol·L-1

乳腺組織中E2水平結果見表1。與對照組相比,飼養21 d,DZ處理可增加乳腺組織中E2含量,但未有顯著性差異(P>0.05),E2處理組略有降低;飼養28 d DZ處理組和E2處理組與21 d E2含量變化具有相同的趨勢,均極顯著增加了E2含量(P<0.01)。

2.3 DZ對青春期小鼠乳腺組織及乳腺指數的影響

2.3.1 乳腺指數與對照組相比,DZ處理組青春期小鼠乳腺指數略增加,但未達到顯著水平;E2處理組具有相同的趨勢(圖3-A)。與對照組相比,DZ處理組青春期小鼠乳腺指數顯著增加(P<0.05),E2處理組具有相同的趨勢,且DZ處理組乳腺指數的增量略高于E2處理組(圖3-B)。

圖3 DZ對青春期小鼠乳腺指數的影響(n=8)Fig.3 Effects of daidzein on mammary index of adolescent mice(n=8)A. 飼養21 d乳腺指數變化;B. 飼養28 d乳腺指數變化。A. The change of breast index on the 21 day of feeding;B. The change of breast index on the 28 day of feeding.

2.3.2 乳腺組織HE染色結果飼養至21 d,乳腺組織形態學變化見圖4-A,與對照組相比,DZ組乳腺小葉間導管的數量極顯著增加(P<0.01);E2組具有類似的趨勢。DZ處理組優于E2處理組(P<0.05)。

圖4 DZ對青春期小鼠乳腺組織導管數量的影響(n=5)Fig.4 Effects of daidzein on bud numbers in breast tissue of adolescent mice(n=5) A.飼養21 d乳腺組織導管數變化;B. 飼養28 d乳腺組織導管數變化。AC：脂肪細胞;A：腺泡;CT：結締組織;ID：小葉間導管。A. Changes of the bud number in breast tissue on the 21 day of feeding;B. Changes of the bud number in breast tissue on the 28 day of feeding. AC：Adipose cell;A：Alveolar;CT：Connective tissue;ID：Interlobular duct.

飼養至28 d,乳腺組織形態學變化見圖4-B。運用Image J統計每個視野中乳腺小葉內導管的數量,以直方圖形式表示。與對照組相比,DZ組乳腺小葉間導管的數量極顯著增加(P<0.01),E2組具有類似的趨勢(P<0.01)。E2處理組優于DZ處理組。

2.3.3 IHC檢測乳腺組織PCNA變化運用Image J軟件,利用閾值分割法統計每組10個視野中PCNA陽性細胞數,以直方圖形式表示。飼養至21 d,PCNA陽性細胞數變化結果見圖5-A。與對照組相比,DZ組PCNA陽性細胞的數極顯著增加,E2組具有相同的趨勢。

圖5 DZ對青春期小鼠乳腺組織PCNA蛋白表達的影響(n=10)Fig.5 Effect of daidzein on PCNA protein expression in breast tissue of adolescent mice(n=10) A.飼養21 d乳腺組織PCNA陽性細胞數變化;B.飼養28 d乳腺組織PCNA陽性細胞數變化。紅色箭頭代表PCNA陽性細胞。A. Changes of the number of PCNA positive cells in breast tissue on the 21 day of feeding;B. Changes of the number of PCNA positive cells in breast tissue on the 28 day of feeding. The red arrows represent PCNA positive cells.

飼養至28 d,PCNA陽性細胞數變化結果見圖5-B。與對照組相比,DZ組PCNA陽性細胞的數極顯著增加,E2組具有相同的趨勢。此結果與2.3.2節結果一致。

2.4 DZ對青春期小鼠乳腺組織細胞周期蛋白和ERβ蛋白表達的影響

2.4.1 DZ對青春期小鼠乳腺組織細胞周期蛋白表達的影響飼養至21 d,細胞周期蛋白變化結果見圖6-A。與對照組相比,DZ處理組cyclinB1的表達上調,但無顯著性差異;E2處理組具有相同的趨勢。與對照組相比,DZ和E2處理均可顯著上調cyclinD1的表達(P<0.05)。飼養至28 d,細胞周期蛋白變化結果見圖6-B。與對照組相比,DZ處理可顯著上調cyclinB1的表達(P<0.05),E2處理組cyclinB1蛋白的表達也顯著上調(P<0.05),且E2與DZ組上調蛋白水平相當。與對照組相比,DZ處理組cyclinD1的表達顯著上調(P<0.05),E2處理組cyclinD1的表達極顯著上調(P<0.01)。E2處理組cyclinD1的蛋白表達水平顯著高于DZ組(P<0.05)。

圖6 DZ對青春期小鼠周期蛋白表達的影響(n=3)Fig.6 Effect of daidzein on cyclin expression in adolescent mice(n=3) A.飼養21 d乳腺組織周期蛋白表達變化;B.飼養28 d乳腺組織周期蛋白表達變化。A. The change of cyclin expression of breast tissues on the 21 day of feeding;B. The change of cyclin expression of breast tissues on the 28 day of feeding.

2.4.2 DZ對青春期小鼠乳腺組織ERβ蛋白表達的影響飼養至21 d,ERβ蛋白表達變化結果見圖7-A。與對照組相比,DZ處理組ERβ蛋白表達上調,但無顯著性差異;E2處理組具有相同趨勢。且E2處理組ERβ蛋白表達水平高于DZ處理組。飼養至28 d,ERβ蛋白表達變化結果見圖7-B。與對照組相比,DZ處理顯著上調ERβ蛋白表達水平(P<0.05),E2處理具有相同趨勢(P<0.05)。

圖7 DZ對青春期小鼠ERβ蛋白表達的影響(n=3)Fig.7 Effect of daidzein on the expression of ERβ protein in adolescent mice(n=3) A.飼養21 d乳腺組織ERβ蛋白表達變化;B.飼養28 d乳腺組織ERβ蛋白表達變化。A. The change of ERβ protein expression in breast tissues on the 21 day of feeding;B. The change of ERβ protein expression in breast tissues on the 28 day of feeding.

3 討論

乳腺是合成乳汁和分泌乳汁的重要外分泌腺,腺泡是分泌乳汁的功能單位。腺泡由乳腺上皮細胞分化而來,乳腺上皮細胞的增殖分化為乳汁的形成奠定良好的基礎。青春期乳腺主要有脂肪組織和結締組織構成,腺體不發達,僅有少量的腺泡和導管。青春期乳腺的發育是由一系列激素和其他因子協調進行的,這些因子促進乳腺導管網絡的延伸,其特征是最前端存在高度增殖的末端芽結構,在不斷分化過程中,導管也逐漸分支,為泌乳期腺泡的發育做準備。導管密度、分支結構、乳腺組織結構變化是乳腺發育過程的重要因素[18]。姜晶晶[9]發現,異黃酮類植物雌激素染料木素和亞麻籽木脂素均能促進青春期大鼠乳腺導管的生長和腺泡發育。Tsugami等[13]研究發現DZ對體外小鼠乳腺細胞誘導成導管、腺泡形成也有一定的促進作用。Chen等[11]最新研究表明,將黃酮類黃芩苷連續給3周齡雌性小鼠注射,直至5和6周齡,均顯著增加乳腺導管的延伸。本研究結果顯示,大豆黃酮連續給藥14和21 d均增加青春期小鼠乳腺導管數量,使腺泡體積變大,脂肪細胞填充減少,與上述的研究結果一致。

乳腺發育主要受雌激素和孕酮的調節,E2可刺激乳腺導管生長和延長,是促進乳腺小葉腺泡發育的基礎。隨著青春期雌激素的分泌增加,腺體增加,導管增多,腺泡增大。在青春期E2在一定水平上可以反映乳腺發育的水平[5]。DZ是一種天然的植物雌激素,為異黃酮類植物雌激素中的重要一員。有研究發現,大豆黃酮可增加泌乳奶牛血液中E2含量,提高雌馬酚水平,促進泌乳[19];朱河水等[20]發現,大豆黃酮可以提高泌乳后期E2水平,間接影響奶牛泌乳性能。本研究結果發現,大豆黃酮可提高青春期小鼠血清和乳腺組織中的E2含量,該研究結果與朱河水等[20]研究結果一致。這提示DZ可能通過上調E2水平來促進青春期小鼠乳腺發育。

cyclinD1/cyclinB1和PCNA在調控細胞增殖過程中發揮最要作用。研究表明cyclinD1可通過結合并激活CDK4/激酶,推動Rb-E2F1復合物解離,促進細胞由G1向S期過渡,到G2期時cyclinD1就會自動降解[21]。因此,cyclinD1是細胞S期穩定表達的周期蛋白。PCNA是一種在DNA損傷和修復中起主要作用的核蛋白,其在細胞S期表達顯著增加[22]。同時,PCNA可作為DNA聚合酶的輔助蛋白,促進DNA的復制[23]。cyclinB1與cyclinD1具有相似的功能,而cyclinB1促進細胞由S期向M期過渡,在M期高表達[24]。Tan等[25]研究表明,異黃酮植物雌激素可顯著增加乳腺的DNA含量,促進乳腺細胞的有絲分裂,從而促進乳腺發育。本研究結果表明,DZ極顯著增加PCNA的陽性細胞數和PCNA的表達,也顯著提高cyclinD1和cyclinB1蛋白的表達水平。

綜上,植物雌激素DZ處理可以通過上調細胞周期和增殖相關蛋白的表達來促進細胞分裂,促進青春期小鼠乳腺發育,這種作用可能與提高內源性E2水平及上調ERβ受體表達有關,相關機制有待進一步研究。