NDM-5-C208A突變大腸埃希菌的構建及大蒜辣素與NDM-5相互作用位點分析

葉志濱,王曉明,呂茜,劉雨桐,金季賾曉,朱馨藝,黃金虎,王麗平

(南京農業大學動物醫學院,江蘇 南京 210095)

由于抗生素長期在臨床治療和畜禽養殖上的不規范使用,各類細菌的耐藥性日益嚴重,尤其對碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌(carbapenems resistance enterobacteria,CRE)嚴重威脅公共衛生安全,已被世界衛生組織(WHO)列為對人類健康威脅最大的超級細菌以及急需開發新型抗生素的極為重要病原體之一[1-2]。CRE菌株可產生水解β-內酰胺類抗生素的碳青霉烯酶,其中最常見的是新德里金屬-β-內酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase,NDM),其活性中心有2個鋅離子,能廣泛水解除氨曲南之外的β-內酰胺類抗生素,是臨床β-內酰胺類抗生素的頭號威脅[3-4]。NDM自2009年首次在印度新德里發現之后便在全球廣泛流行,極大地限制了碳青霉烯類及其他β-內酰胺類藥物的使用,致使“超級細菌”的威脅日益嚴重[5-7]。迄今為止,NDM已產生了三十多種變體,在人群、動物和環境中分布較為廣泛的是NDM-5[8]。研究證實經典的β-內酰胺酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦等對NDM均無效。開發新型抗耐藥菌藥物難度大、成本高、周期長,因此,篩選NDM酶特異性抑制劑以遏制其對現有抗生素的滅活成為抗碳青霉烯耐藥菌藥物研發的首選方案。

大蒜是藥食兩用植物,已有數千年的應用歷史。研究發現大蒜中的活性成分大蒜辣素(allicin,化學名為二丙烯基硫代亞磺酸酯)具有顯著的抗菌活性[9]。本課題組前期研究發現,大蒜辣素不僅具有直接的抗菌活性,而且大蒜辣素能通過有效抑制NDM活性,恢復碳青霉烯類抗生素對產NDM大腸埃希菌的抑菌活性,但其與NDM酶的互作位點及具體抑制機制尚未闡明。因此,本研究基于分子對接的預測結果,進一步通過定點突變方法研究了NDM-5的Cys208位點對NDM-5活性的影響,以及大蒜辣素聯用美羅培南對NDM野生型和Cys208突變菌株的抑菌作用差異,初步探討大蒜辣素的抑酶活性以及與NDM-5的互作位點,以期為開發和應用大蒜辣素作為金屬-β-內酰胺酶抑制劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株攜帶NDM-5酶表達基因的工程菌株大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5由本實驗室構建并保存,大腸埃希菌ATCC-25922購于中國獸醫藥品監察所。

1.1.2 儀器與試劑PCR儀、核酸電泳槽、蛋白電泳槽和凝膠成像系統均購于美國Bio-Rad公司;Ni-NTA鎳柱購于上海生工生物公司;細胞超聲波破碎儀購于寧波新芝生物科技有限公司;Synergy H1酶標儀購于美國伯騰儀器有限公司;定點突變試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司;LB肉湯、LB瓊脂、MH肉湯均購于青島海博生物技術有限公司;蒜粉(潛在大蒜辣素含量為1.603%)由新疆醫科大學提供;阿莫西林(≥ 98%)、氨芐西林(≥ 98%)、頭孢呋辛(≥ 98%)、頭孢他啶(≥ 98%)、頭孢噻肟(≥ 99.5%)、美羅培南(≥ 98%)購自上海阿拉丁生化科技有限公司;咪唑、苯甲基磺酰氟(PMSF)和異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)購自北京索萊寶科技有限公司;SDS-PAGE快速配膠試劑盒購于雅酶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 分子對接選擇蛋白數據庫中的NDM-5(PDB：6MGY)作為受體,ZINC數據庫中的大蒜辣素(ZINC：1530846)作為配體。在AutoDock中對NDM-5進行去水、加氫處理,對大蒜辣素加氫后進行分析。在軟件中將處理后的NDM-5與大蒜辣素執行剛性蛋白質和柔性配體的標準對接程序,對軟件給出的結合位點進行篩選。

1.2.2 NDM-5突變體工程菌株的構建采用點突變試劑盒對本實驗室前期構建的質粒pET21a-NDM-5進行點突變,具體方法參照說明書。根據堿基變動盡量少的原則設計突變引物,將NDM-5第208位活性位點半胱氨酸(Cys,C)突變為惰性氨基酸丙氨酸(Ala,A)。上游引物設計為NDM-5-C208A-F：5′-TTTGGTGGCGCCCTGATCAAGGACAGCAAGGCC-3′,下游引物設計為NDM-5-C208A-R：5′-ATCAGGGCGC-CACCAAAAGCGATGTCGGTGCC-3′,下劃線處為突變位置。參考說明書優化擴增體系和反應程序,擴增體系包括：25 μL 2×Max Buffer、1 μL dNTP Mix、10 ng DNA、2 μL上游引物、2 μL下游引物、1 μL DNA Polymerase,加ddH2O至50 μL。反應程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 6 min,共18個循環;72 ℃ 5 min。使用DpnⅠ酶特異性識別并消化反應產物中原始的甲基化模板質粒,防止原始質粒干擾形成假陽性克隆。用Exnase Ⅱ酶催化擴增消化產物,將突變位點進行高效重組,實現線性DNA的體外環化。將產物轉入感受態大腸埃希菌BL21(DE3),在氨芐青霉素抗性的LB平板上涂布后于37 ℃靜置過夜培養。次日挑取陽性克隆轉接至氨芐抗性LB肉湯,37 ℃振搖培養8 h后菌液送南京生工生物公司測序。將測序結果正確的轉化子命名為大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5-C208A,甘油保存。

1.2.3 NDM-5突變體轉化子的抗生素表型驗證根據EUCAST推薦的微量肉湯稀釋法[10]測定6種 β-內酰胺類抗生素氨芐西林、阿莫西林、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶和美羅培南對大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5和大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5-C208A的最小抑菌濃度(MIC),大腸埃希菌ATCC25922作為質控菌株。根據EUCAST敏感性折點進行菌株耐藥性評價[11]。各藥物折點分別為氨芐西林<8 μg·mL-1、阿莫西林<8 μg·mL-1、頭孢呋辛<8 μg·mL-1、頭孢噻肟<1 μg·mL-1、頭孢他啶<1 μg·mL-1和美羅培南<2 μg·mL-1。

1.2.4 不同濃度的大蒜辣素對NDM-5野生型和突變體菌株生長的影響將大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5和BL21(DE3)pET21a-NDM-5-C208A接種于LB肉湯中過夜培養后,調整菌液濃度D600值為0.1后均勻加入96孔板,除對照組外,每孔再加入不同梯度終濃度的大蒜辣素,于37 ℃恒溫培養。每隔4 h測定D600,繪制不同菌株的生長曲線。

1.2.5 NDM-5突變體的表達與純化挑選測序與表型結果符合預期的大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5-C208A轉接至LB肉湯中,37 ℃過夜振蕩培養。將過夜培養物按1∶100稀釋至1 L的新鮮LB肉湯中,培養至菌液的D600值為0.6～0.8時,加入終濃度為0.2 mmol·L-1的IPTG,轉入30 ℃搖床中振蕩培養 16 h。12 000g離心30 min后棄上清液,用平衡緩沖液重懸沉淀并加入終濃度為1 mmol·L-1的PMSF以保護蛋白,將重懸混合液在冰浴條件下進行超聲破碎,功率為35 W,破碎5 s,暫停10 s,共超聲15 min。12 000g離心30 min后取上清液,將上清液加至平衡液平衡好的Ni-NTA柱,用梯度濃度(20～500 mmol·L-1)的咪唑緩沖液沖洗柱子并收集各洗脫液,將各洗脫液逐一進行SDS-PAGE驗證。把含有單一目的條帶的洗脫液混合后用截留蛋白相對分子質量為10×103的超濾離心管進行換液和濃縮。SDS-PAGE驗證濃縮液純度后,Nanodrop檢測濃縮液中的蛋白濃度。

1.2.6 NDM-5突變體的酶活性測定為測定所得NDM-5-C208A突變對酶活性的影響,比較相同濃度的NDM-5與NDM-5-C208A對底物美羅培南的水解能力。參考文獻[12]的方法,略作優化后進行測定。水解反應于96孔板中進行,每孔分別加入100 μL稀釋后終濃度為20 nmol·L-1的NDM-5和NDM-5-C208A,接著每孔均加入100 μL終濃度為200 μmol·L-1美羅培南溶液,溫和振蕩96孔板使酶與底物充分接觸,迅速放入酶標儀,于30 ℃檢測D300值的變化,每隔1 min檢測1次,持續檢測30 min。將2組底物美羅培南吸光值的下降量除以各自反應時間分別得到NDM-5和NDM-5-C208A的水解速率vWT和vMT。設定NDM-5的酶活性為100%,則NDM-5-C208A的酶活性為(vMT/vWT)×100%。

1.2.7 大蒜辣素對NDM-5及突變體NDM-5-C208A的抑制活性比較構建反應體系測定大蒜辣素對NDM-5和NDM-5-C208A的酶抑制情況。于96孔板中進行反應,每孔分別加入50 μL終濃度為20 nmol·L-1的NDM-5和NDM-5-C208A,與梯度濃度大蒜辣素(0、2.5、5、10、20和40 μmol·L-1)于30 ℃下孵育30 min。接著加入100 μL終濃度為200 μmol·L-1的美羅培南溶液后立刻放入酶標儀中檢測30 min內D300的變化。計算對照組中酶水解速率(v0),大蒜辣素處理后的酶水解速率(vi),以2組對照組中的酶活性為100%,剩余酶活性為(vi/v0)×100%。

1.2.8 大蒜辣素聯合美羅培南對NDM-5野生型和NDM-5-C208A突變菌株的聯合抑菌活性采用微量肉湯棋盤稀釋法[13]測定大蒜辣素與美羅培南聯合對NDM-5野生型菌株和NDM-5-C208A突變菌株的聯合抑菌活性。反應于96孔板中進行,在6×6范圍內將二倍梯度稀釋的2種藥物分別與2株細菌懸液(1.5×106CFU·mL-1)混合,于37 ℃溫箱中靜置培養18 h。根據公式計算聯合抑菌指數(FICI)：FICI=FICIa+FICIb=MICab/MICa+MICba/MICb。式中：MICa是化合物A單獨的MIC;MICab是聯用藥物時化合物A的MIC;MICb為化合物B單獨的 MIC;MICba是聯用藥物時化合物B的MIC。判讀標準：FICI≤ 0.5為協同作用;0.52為拮抗作用。

1.2.9 不同濃度的大蒜辣素對NDM-5野生型和突變體菌株的時間殺菌曲線將大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5和BL21(DE3)pET21a-NDM-5-C208A過夜培養后,以1∶1 000稀釋于LB肉湯后進行如下藥物處理：對大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5,分別設美羅培南處理組(32 μg·mL-1,1/4MIC)、大蒜辣素處理組(8 μg·mL-1,1/2MIC)、美羅培南(32 μg·mL-1,1/4MIC)+大蒜辣素(8 μg·mL-1,1/2MIC)聯合處理組,以及不加藥的空白對照組;對突變菌株BL21(DE3)pET21a-NDM-5-C208A,分別設美羅培南處理組(0.004 μg·mL-1,1/4MIC)、大蒜辣素處理組(4 μg·mL-1,1/2MIC)、美羅培南(0.004 μg·mL-1,1/4MIC)+大蒜辣素(4 μg·mL-1,1/2MIC)聯合處理組,以及不加藥的空白對照組。處理完畢后于37 ℃振蕩培養24 h,每隔6 h分別吸取100 μL菌液用無菌PBS系列梯度稀釋后進行活菌計數,以時間為橫軸、lgCFU為縱軸繪制時間殺菌曲線。

2 結果與分析

2.1 關鍵結合位點的確認及NDM-5 C208A轉化子的鑒定

經過AutoDock軟件的模擬對接,得到大蒜辣素與NDM-5的結合模式圖(圖1-A)。大蒜辣素與NDM-5有4個可能結合的位點,其中只有Cys208位于酶活性口袋處,推測其對維持酶活性有重要作用,故選擇Cys208為關鍵位點進行突變。對轉化后的突變子疑似陽性克隆進行測序,將測序結果與NDM-5的序列進行比較,結果(圖1-B)顯示已成功將Cys208突變為Ala208,且未發現其他突變,符合后續試驗要求。將成功構建的NDM-5-C208A突變載體命名為pET21a-NDM-5-C208A,菌株命名為大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5-C208A。

圖1 大蒜辣素與NDM-5結合位點預測(A)及NDM-5-C208A轉化子序列鑒定(B)Fig.1 Binding sites prediction of allicin with NDM-5(A)and sequence identification of NDM-5-C208A transformants(B)

2.2 不同抗生素和大蒜辣素對NDM-5-C208A突變菌株和野生型菌株的MIC

通過藥敏試驗檢測轉化子對6種抗生素的敏感性見表1。NDM-5野生型菌株 BL21(DE3)pET21a-NDM-5與NDM-5-C208A突變菌株BL21(DE3)pET21a-NDM-5-C208A均對氨芐西林和阿莫西林表現出耐藥;NDM-5野生型菌株BL21(DE3)pET21a-NDM-5對頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶和美羅培南表現為耐藥,但是NDM-5的Cys208位點突變為Ala后,菌株對頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶和美羅培南則會恢復敏感,表明NDM-5-C208位點對水解頭孢類和碳青霉烯類抗生素非常關鍵。

表1 β-內酰胺類抗生素和大蒜辣素對重組菌株的MICTable 1 MIC of β-lactam antibiotics against recombinant strains

2.3 大蒜辣素對NDM-5菌株突變前后生長曲線的影響

通過測定生長曲線以判斷大蒜辣素對大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5和大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5-C208A的生長是否有影響。從圖2可知,大蒜辣素對大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5的生長有一定的抑制作用,當大蒜辣素濃度為16 μg·mL-1時則可完全抑制其生長。顯示大蒜辣素對NDM-5突變型大腸埃希菌的生長抑制存在劑量-效應關系,當大蒜辣素濃度為4 μg·mL-1時,處理組和對照組無顯著差異(P>0.05),而當大蒜辣素濃度升高至8 μg·mL-1時則能完全抑制其生長。這表明大蒜辣素對野生型和NDM-5-C208A突變菌均有直接抑制作用。

圖2 不同質量濃度大蒜辣素處理后大腸埃希菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of E.coli strains treated with different concentrations of allicin

2.4 NDM-5-C208A蛋白的純化及活性測定

對突變體蛋白進行大量表達和純化濃縮后,SDS-PAGE電泳分析驗證蛋白純度。圖3-A顯示蛋白相對分子質量符合預期24×103,且條帶單一,純度>90%,采用Nanodrop測定突變型蛋白濃度為3.8 mg·mL-1,表明突變體蛋白純化成功,能滿足后續試驗要求。將純化后的NDM-5和NDM-5-C208A進行活性測定。將NDM-5的水解活性設為100%,則NDM-5-C208A水解底物美羅培南的酶活性極顯著下降(P<0.001),與野生型NDM-5相比,突變體的酶活性下降約85%(圖3-B),表明Cys208位點是NDM-5維持水解活性的關鍵位點。

圖3 NDM-5-C208A的表達純化(A)及酶活性測定(B)Fig.3 Expression and purification of NDM-5-C208A(A)and the determination of the enzyme activity of NDM-5-C208A(B)M. 蛋白標準品Protein marker. ***P<0.001.

2.5 大蒜辣素對NDM-5和NDM-5-C208A的抑制效果

不同濃度大蒜辣素分別作用于NDM-5和NDM-5-C208A,將無大蒜辣素處理組的酶活性定義為100%,通過與各自的對照組比較計算其剩余的酶活性。從圖4可知：10～40 μmol·L-1的大蒜辣素均對NDM-5酶活性有極極顯著的抑制作用(P<0.000 1),并存在明顯的劑量效應;不同濃度的大蒜辣素對NDM-5-C208A的酶活性影響均不顯著(P>0.05)。

圖4 不同濃度大蒜辣素處理后NDM-5和NDM-5-C208A的酶活性比較Fig.4 Residual enzyme activity of NDM-5 and NDM-5-C208A treated with different concentrations of allicin****P<0.000 1.

2.6 大蒜辣素聯合美羅培南對NDM-5的Cys208位點突變前后菌株的聯合抑菌作用比較

從圖5可知,大蒜辣素聯合美羅培南對大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5的FICI為0.375,表示二者對其有協同抑菌作用,二者聯用對突變菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5-C208A的FICI為2,表現為獨立作用,失去協同抗菌作用。

圖5 美羅培南和大蒜辣素聯用對NDM-5陽性菌株(A)及其C208A突變后菌株(B)的作用結果Fig.5 The effect of combination of meropenem and allicin on NDM-5 positive strain(A) and its C208A mutation strain(B)

時間殺菌曲線(圖6)顯示亞抑菌濃度的大蒜辣素與美羅培南單獨使用均不能有效殺滅大腸埃希菌BL21(DE3)pET21a-NDM-5,但是二者即使采用亞抑菌濃度進行聯用也能抑制細菌的生長并表現出了明顯的殺菌效果;若菌株的NDM-5發生C208A突變后,大蒜辣素和美羅培南則無明顯的聯合殺菌效果。細菌體內試驗再次證實NDM-5的Cys208是大蒜辣素對酶發揮抑制作用的關鍵位點。

圖6 大蒜辣素和美羅培南聯合對NDM-5野生型菌株(A)及Cys208突變菌株(B)的時間殺菌曲線Fig.6 Time-dependent killing curve of the combination of allicin and meropenem against NDM-5 wild type strain(A)and its Cys208 mutation strain(B)

3 討論

近年來,耐藥菌的產生和傳播以及相關有效藥物的缺乏已成為威脅公眾健康的重要問題[14]。碳青霉烯類抗生素是人醫臨床抗革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”[15]。但近些年來不斷有研究顯示人、動物及其所處環境中均能檢測到介導細菌對碳青霉烯類耐藥的NDM基因,并存在不同生態位的水平傳播。人醫臨床中也發現碳青霉烯類抗生素逐漸失去了應有的治療效果[16-18]。NDM可以水解除氨曲南之外的所有β-內酰胺類抗生素,因此,NDM在畜禽中的檢出對獸醫臨床常用的青霉素類及專用的頭孢類抗生素的活性也會產生重要影響。NDM導致的耐藥已成為人醫和獸醫臨床共同關注的焦點。

NDM具有典型的αβ/βα三明治結構,其中α-螺旋與β-折疊通過柔性的Loop環連接,該空間折疊結構特點使NDM對不同的β-內酰胺類抗生素都具有高度的適應性[19]。NDM的活性中心有2個Zn2+,各自可與3個氨基酸殘基相互作用,Zn1與His120、His122和His189配位;Zn2則與Asp124、Cys208和His250配位,研究表明活性中心的殘基對維持NDM酶水解活性至關重要,因此是較為理想的抑制劑潛在作用靶點[20]。NDM結構的解析為采用分子對接、蛋白結晶等技術用于預測和模擬受體-配體復合物結構以及結合位點提供重要基礎[21]。本文則是基于模擬對接分析大蒜辣素與NDM-5的結合位點為活性保守殘基Cys208,進一步通過定點突變方法成功構建出突變型載體pET21a-NDM-5-C208A,由此獲得NDM-5的C208位點突變菌株,并證實C208A突變可導致NDM水解頭孢類抗生素和碳青霉烯類抗生素的活性下降,后續的體外酶水解試驗進一步佐證了該結果。Wang等[12]發現當Cys208被突變為惰性氨基酸丙氨酸(Ala)后,NDM的酶活性約下降了80%,本研究結果與之較為一致,均證實該殘基對NDM-5水解活性的重要性以及外源化合物可通過干預該位點起到抑制酶活性的作用。本試驗中發現構建的C208A突變菌株對氨芐西林與阿莫西林仍表現耐藥,我們分析是由于表達載體pET21a攜帶氨芐西林抗性,因此NDM失去了水解活性,而質粒攜帶的抗性基因仍在發揮作用。我們后續將通過篩選其他抗性載體進行驗證。

綜上所述,本研究首次探討了大蒜辣素對NDM-5的抑制作用及其相關作用位點,提示大蒜辣素有望以一種新型的碳青霉烯類抗生素佐劑用于產NDM的CRE菌株感染治療,并具有較好的應用前景。