飼料中添加復合膽汁酸對皮質酮誘導的肉雞脂肪肝綜合征的緩解作用研究

胡丹,郝燕青,陳渠,鄔曉婷,倪迎冬

(南京農業大學動物醫學院/農業農村部動物生理生化重點實驗室,江蘇 南京 210095)

脂肪肝綜合征(fatty liver syndrome,FLS)是一種常見的家禽代謝性疾病,其發病機制與病理癥狀與哺乳動物非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)十分相似[1]。為了增加肉雞生長性能和養殖效益,近年來肉雞飼料中油脂添加量有增加趨勢,更易發生脂肪肝綜合征?；疾‰u肝臟出現嚴重的脂肪沉積,導致肝臟破裂出血,從而出現突然死亡現象[2-3]。脂肪肝綜合征已成為籠養雞非感染性死亡的主要原因之一,約有75%的籠養肉雞死亡與FLS有關[4]。因此,家禽脂肪肝的致病機制和防治技術研究成為熱點研究之一。

皮質酮(corticosterone,CORT)是禽類體內一種有活性的糖皮質激素(glucocorticoid,GC)。GC水平過高可誘發機體代謝紊亂,包括Ⅱ型糖尿病、骨骼肌流失、血脂異常、向心性肥胖和肝臟中甘油三酯過度沉積等[5-6]。作為調控機體脂代謝的重要激素,CORT通過糖皮質激素受體(glucocorticoid receptors,GR)動員組織從頭合成脂肪酸,增加外周循環中的游離脂肪酸水平[7]。肝臟攝入的脂肪酸增多,促進甘油三酯的合成,產生脂質沉積,最終誘發脂肪肝。慢性應激或長期高水平CORT暴露與脂肪肝進展和炎癥反應密切相關[8]。

膽汁酸(bile acid,BA)是由肝臟合成后分泌到消化道中的一類物質,在十二指腸中促進脂類物質及脂溶性維生素的吸收。此外,BA作為信號分子可通過與法尼酯 X 受體(farnesoid X receptor,FXR)和G 蛋白偶聯膽汁酸受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1,GPBAR1/TGR5)來調節機體葡萄糖和脂質代謝[9-10]。臨床研究表明,NAFLD的發生伴隨著膽汁酸穩態及其相關信號通路的紊亂,通常表現為初級膽汁酸增加,而次級膽汁酸減少[11-12]。因此,與BA相關的信號通路被認為是治療哺乳動物NAFLD的靶點。近年來,對家禽的研究表明,飼料中添加BA可促進肉雞生長,可能與腸上皮細胞消化酶的活性升高有關[13-14]。在攝入不同能量水平日糧的情況下,飼喂BA能顯著降低肉雞的料重比,降低血清中甘油三酯水平,并改善肝臟中的脂代謝狀態[15]。然而,目前有關飼喂膽汁酸對家禽FLS緩解作用與機制的研究尚未見報道。因此,本研究以AA肉雞為動物模型,通過注射CORT誘導FLS,以探索飼料中添加BA對FLS的緩解作用及機制,為家禽脂肪肝綜合征研究與防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑膽汁酸由山東龍昌動物保健品技術有限公司生產,組成成分主要是豬脫氧膽酸(70.67%)、鵝脫氧膽酸(19.61%)和豬膽酸(8%)[13]。組織甘油三酯檢測試劑盒購于北京普利萊基因技術有限公司;血液生化檢測試劑盒購于美康生物科技股份有限公司;4%多聚甲醛購自南京建成科技有限公司;TRIzol 試劑購于北京擎科生物科技有限公司;RT-qPCR試劑盒和反轉錄試劑盒均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司;引物由北京擎科生物科技有限公司合成;細胞組織 RIPA 裂解液、增強型ECL化學發光液、蛋白酶抑制劑均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司;BCA蛋白檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司;硝酸纖維素膜購于南京邁博生物科技有限公司。

1.1.2 試驗儀器試驗儀器包括：全自動生化分析儀(7020,HITACHI);全波長多功能酶標儀(Synergy 2,BioTek);全自動化學發光圖像分析系統(5200,Tanon);微量核酸檢測儀(Nanodrop 2000,Thermo);實時熒光定量 PCR 儀(QuantStudio 6 Flex,Applied Biosystems);光學顯微鏡(Olympus-BX53)。

1.2 試驗設計與日糧

1.2.1 動物飼養與管理試驗選取120只1日齡雄性AA肉雞,隨機分為2組,分別飼喂基礎日糧和添加BA的日糧。膽汁酸的添加分為3個階段：3～7日齡(前期),劑量(每只雞)為4、7、10、13、16 mg·d-1;17～21日齡(中期),劑量為18、19、20、21、22 mg·d-1;31～35日齡(后期),劑量為28、29、30、31、32 mg·d-1。采用籠養方式飼養,1～3日齡,飼養室內溫度為32～34 ℃,隨后以每周2～3 ℃的速度降低溫度,直到第35天的21～22 ℃。按常規程序進行免疫接種。全天光照,自由飲水和采食。

1.2.2 皮質酮處理28日齡時從飼喂基礎日糧的肉雞中隨機選取20只,隨機分為對照組(CON),皮質酮注射組(CORT);從膽汁酸組隨機選取10只進行皮質酮注射(CORT+BA)。CORT組和CORT+BA組肉雞皮下注射4 mg·kg-1皮質酮(溶解于含15%乙醇的PBS溶液中),連續注射7 d,CON組注射等量含15%乙醇的PBS溶液。于40日齡時結束試驗,進行采樣。

表1 日糧營養成分Table 1 The nutrient component of the diet g·kg-1

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長情況與樣品采集采樣前(40 d)稱肉雞體重,禁食12 h后屠宰采樣。采集頸部動靜脈混合血液,在4 ℃條件下3 500 r·min-1離心20 min,將分離的血清置于EP管中,于20 ℃冰箱內儲存。采集肝臟組織樣及分子樣,使用4%多聚甲醛緩沖液固定組織樣,分子樣迅速放入液氮中,采樣結束后轉移至-80 ℃冷凍保存。

1.3.2 組織器官發育采集完整的肝臟稱重,以器官重占肉雞活體重的相對量來表示器官指數(g·kg-1)。采集全部的腹部脂肪組織、腿肌組織稱重,以組織重占肉雞活體重的相對量來表示組織所占百分比(%)。

1.3.3 血液生化指標檢測血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TCHO)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDLC)、游離脂肪酸(NEFA)、甘油三酯(TG)使用全自動生化分析儀以及相對應的試劑盒檢測。

1.3.4 HE染色和油紅O染色對部分肝臟組織使用4%多聚甲醛緩沖液進行固定,切片,進行HE和油紅O染色,每組6個。使用光學顯微鏡對切片進行觀察和拍攝,觀察組織形態與脂滴分布和大小。

1.3.5 總RNA提取提取肉雞肝臟組織總RNA,檢測并統一濃度后反轉錄為cDNA,通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測肝臟中脂肪合成、分解和轉運相關mRNA的相對表達量。引物序列見表2。

表2 熒光定量PCR引物序列Table 2 Sequence used for real-time PCR

1.3.6 Western blot檢測稱取肝臟樣品約30 mg,按1∶10的比例加入RIPA裂解緩沖液后勻漿。勻漿后樣品在 4 ℃條件下12 000 r·min-1離心20 min。收集上清液,使用Pierce BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。變性蛋白樣品(30 μg 蛋白)經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。隨后將蛋白轉印至硝化纖維素膜上,以50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜,用TBST洗膜后與二抗反應2 h。洗滌后,使用增強化學發光試劑,避光孵育后放入全自動化學發光圖像分析系統中進行圖像采集。以GAPDH作為內參。利用Image J軟件對條帶灰度進行量化分析?？贵w信息見表3。

表3 Western blot檢測所用抗體信息Table 3 Information of antibody used for Western bolt

1.3.7 數據統計與分析所有結果以平均值±標準誤表示,各組間顯著性差異采用SPASS 19.0軟件進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析,采用LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 肉雞體重、器官重及器官指數變化

由表4可知：與對照組相比,CORT注射對肉雞體重、肝重和肝臟指數無顯著影響(P>0.05),但顯著降低肉雞的腿肌重,顯著增加了腹脂重及腹脂率(P<0.05)。BA能緩解由CORT引起的腿肌重的減少和腹部脂肪的增加(P<0.01),同時顯著增加腿肌率(P<0.05)。提示BA可改善CORT引起的肉雞腹部脂沉積和腿部肌肉流失。

表4 不同處理肉雞體重、器官重和器官指數變化Table 4 Changes of body weight,organ weight and organ index in broilers under different treatments

2.2 肉雞血清中相關生化指標變化

由表5可知：對照組相比,CORT組肉雞血清中ALT活性、GLU、TCHO和TG水平均無顯著變化(P>0.05),但HDLC和LDLC水平顯著降低,而NEFA水平顯著升高(P<0.05)。BA處理顯著提高了血液HDLC水平(P<0.05)。以上結果表明,CORT處理引起機體脂質代謝的紊亂,而BA處理可改善脂代謝。

表5 不同處理肉雞血清中相關生化指標變化Table 5 Changes of biochemical indexes in serum of broilers under different treatments

2.3 肉雞肝臟TG含量變化

由圖1可知：HE染色結果表明CORT處理組肉雞肝臟組織松散,存在明顯的脂滴空泡;油紅染色結果進一步顯示CORT處理組肝臟內有大面積的脂滴分布,生化檢測結果顯示肝臟TG水平顯著上升(P<0.01)。而BA添加顯著降低了肝臟中TG水平,改善了肝臟脂肪沉積現象(P<0.05)。表明膽汁酸可緩解皮質酮引起的肉雞脂肪肝綜合征現象。

圖1 不同處理肉雞肝臟內甘油三酯水平的變化Fig.1 HE and oil red O staining of liver tissue and hepatic TG level in broilers under different treatments

2.4 肉雞肝臟脂代謝相關基因表達變化

由圖2可知：CORT顯著上調肉雞肝臟中脂肪合成關鍵酶硬脂酰輔酶A去飽和酶(cd1)和乙酰輔酶A羧化酶(acc)的基因表達(P<0.05)。BA添加后降低了scd1及acc的基因表達量(P<0.05),且顯著增加了脂肪酸β氧化關鍵酶肉毒堿棕櫚?；D移酶(cpt1a)基因表達量(P<0.05)。與對照組相比,CORT和CORT+BA組肝臟中脂肪酸合成酶(fasn)、固醇調節元件結合轉錄因子1(srebf1)、過氧化物增殖激活受體(pparα)及脂蛋白脂肪酶(lpl)的mRNA表達量無顯著差異(P>0.05)。提示飼料中添加BA顯著抑制由CORT誘導的肝臟TG合成。

圖2 不同處理肉雞肝臟脂代謝關鍵基因表達變化Fig.2 Changes of gene expression involving in hepatic lipid metabolism in broilers under different treatments

2.5 肉雞肝臟脂代謝相關蛋白表達變化

由圖3可知：BA顯著緩解了由CORT引起的肝臟脂肪合成有關蛋白FASN和ACC的表達上調,以及脂肪酸氧化分解相關轉錄因子PPARα的蛋白表達水平下調(P<0.05);與CORT組相比,CORT+BA組肝臟中脂肪酸轉移酶(CD36)的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。提示：CORT處理促進肉雞肝臟中脂肪酸從頭合成蛋白的表達,抑制脂肪酸的β氧化,而膽汁酸處理能抵抗CORT的上述作用,并抑制肝臟對外周游離脂肪酸的吸收。

圖3 不同處理肉雞肝臟脂代謝關鍵蛋白表達變化Fig.3 Changes of protein expression involving in hepatic lipid metabolism in broilers under different treatments A—C. 蛋白免疫印跡條帶Protein blotting;D—G. 肝臟脂代謝關鍵蛋白表達水平Expression levels of key protein involving in lipid metabolism in liver.

3 討論

外源性CORT注射可誘導家禽肝臟中脂質異常積聚和炎癥反應,從而發展為脂肪肝綜合征[8,16]。CORT通過GR動員組織從頭合成脂肪酸,增加循環中的游離脂肪酸水平引發肝臟脂肪沉積增加。機體中糖皮質激素水平過高會促進肝外組織,尤其是肌肉組織蛋白的分解,導致肌肉萎縮。本研究采用皮質酮注射后同樣引起了肉雞腹部脂肪堆積,腹脂重和腹脂率顯著升高,外周血液中游離脂肪酸水平顯著升高,同時腿肌重顯著降低,與之前的研究結果相吻合[17-18]。已有研究[13,15]表明,飼料中添加BA可減少腹脂沉積并增加胸肌重。本研究結果顯示,飼料中添加BA不影響皮質酮引起的脂肪酸動員,但可顯著緩解由皮質酮誘導的腹脂沉積和肉雞的腿肌重和腿肌率降低,因此可能加速了肌肉組織而非脂肪組織對脂質的儲存及轉化。此外,BA添加使血清中HDLC水平著顯著升高,提示對脂類代謝的有益作用。

當肝臟中脂質的合成速率超過其分解速率時,肝臟中出現脂質過載,產生脂質沉積,最終誘發脂肪肝[19]。在本研究中,盡管CORT處理組肉雞肝重和肝指數無顯著變化,但肝臟內出現了較多的脂滴空泡,油紅O染色顯示有大面積的脂滴分布,同時肝臟TG水平顯著上升。而添加BA顯著改善了肝臟中脂肪變性,降低了TG沉積。研究表明 GR 可以靶向結合到脂代謝相關基因啟動子區域調節其轉錄表達,GC處理導致大鼠肝臟TG升高,主要是因為促進了脂肪酸從頭合成過程[20-21]。在家禽中,CORT處理可以通過促進脂肪酸合成關鍵基因acc、fasn、scd1和sredf1的去甲基化修飾來促進其表達[22]。因此,為了進一步探究BA緩解肉雞肝臟脂肪沉積的作用機制,我們檢測了肝臟中與脂質合成、分解及轉運有關的基因和蛋白的表達。

FASN、ACC、SCD1是調控肝臟中脂肪酸從頭合成的關鍵酶,分別催化脂肪酸從頭合成、長鏈脂肪合成以及單不飽和脂肪酸的合成。研究表明利用藥物或者基因缺失等方式抑制這3種關鍵酶的合成,可有效改善糖尿病或基因模型小鼠的肝臟脂肪變性以及脂質代謝紊亂[23-25]。因此,抑制肝臟脂肪生成可能是緩解肝臟脂肪變性相關疾病的有效手段。本研究結果顯示,飼料中添加BA顯著抑制皮質酮引起的肝臟中scd1和scc基因表達及FASN和ACC蛋白表達的上調,從而抑制肝臟的脂質合成。BA對脂代謝的調控主要是通過激活受體實現的,其中FXR受體的激活在BA誘導的糖脂代謝調控中起關鍵作用。FXR可通過調節下游靶點PPARα來促進肝臟脂肪酸β氧化[10]。PPARα是一種轉錄因子核受體,對脂肪合成、脂肪酸氧化及運輸等代謝途徑具有轉錄調節活性[26-27]。研究發現PPARα的下游靶點包括CPT1a、SCD1和CD36等[28]。PPARα對CPT1a和CD36基因的表達具有正向調控作用,從而影響脂肪酸轉運和吸收過程。CPT1a位于線粒體外膜,將脂肪酸從細胞質轉移到線粒體中進行β氧化,是脂肪酸氧化分解的限速酶[29]。CD36為脂肪酸轉位酶在大部分組織都有表達,在促進長鏈脂肪酸的攝取和細胞內運輸中起著重要作用[30]。在脂肪肝患者和動物脂肪肝模型中CD36表達顯著增加,而CD36敲除鼠對高脂引起的肝臟脂肪沉積具有抵抗作用[31-32]。本研究結果顯示,飼料中添加BA顯著上調了肉雞肝臟中PPARα蛋白的表達和cpt1amRNA的表達。相對于CORT組,CORT+BA組中肝臟CD36蛋白的表達顯著下調。因此,BA對肝臟脂肪沉積的緩解作用是通過抑制脂肪酸合成、促進脂肪酸氧化分解并抑制肝臟對外周脂肪酸的吸收實現。

BA可直接激活蛋白激酶誘導小異源二聚體伴侶受體(SHP)發生磷酸化,經過一系列分子級聯反應導致代謝靶基因的抑制性修飾,降低肝臟中TG水平[33]。此外,BA還可激活磷酸鞘氨醇受體(S1PR2)調控脂代謝,喂食HFD的s1pr2敲除小鼠的肝臟脂質積累增加[34]。在腸道中,BA受體FXR的激活,可通過FXR-FGF15/19-SHP軸使肝臟中FASN發生DNA甲基化修飾,抑制脂肪合成[35]。因此,在CORT處理下,BA所引起變化的相關機制還有待進一步研究。

總之,本研究表明日糧中添加BA可通過對肝臟脂代謝關鍵基因和蛋白表達的調控,通過減少脂質合成,促進脂肪酸分解,抑制肝臟對脂肪酸攝取,緩解由皮質酮注射引起的肉雞肝臟脂肪沉積。本研究為BA在家禽養殖中的合理使用提供了試驗依據,對改善肉雞健康,提升動物福利有重要意義。