熱應激對羊成肌細胞部分miRNA的影響及其生物信息學分析與靶基因預測

盧佳偉,趙鵬,劉媛,魏宗友,李惠俠*

(1.南京農業大學動物科技學院,江蘇 南京 210095;2.太倉市農業農村科技服務中心,江蘇 太倉 215400)

骨骼肌約占機體總體重的40%～60%,由肌肉纖維(也稱為肌纖維或肌細胞)、脂肪組織和相關結締組織構成,能夠維持機體的運動和基礎能量代謝[1]。因此,骨骼肌是動物重要的組織之一。骨骼肌的發育是一個非常復雜且精細的過程,會受到外界環境、遺傳特性、基因[2-3]、短鏈非編碼RNA(microRNA,miRNA)[4-5]、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)[6]、環狀RNA(circularRNA,circRNA)[7-8]、信號通路[9-10]、轉錄后修飾的調控[11-12]。骨骼肌起始于體節干細胞,其分化形成肌肉祖細胞,肌肉祖細胞經過多次的增殖和分裂后,形成成肌細胞[13]。成肌細胞不斷增殖為肌細胞,隨后相互融合形成肌管,肌管逐漸匯合形成肌纖維,最終形成骨骼肌[14]。成肌細胞是肌肉運動和再生的關鍵組分,其進行增殖和分化,從而融合形成新的肌肉纖維,維持骨骼肌的健康[15]。

氣候和環境條件的變化會導致環境溫度的升高,當人類或動物的體溫高于其恒溫點時,就會出現熱應激(heat stress,HS),從而影響生理功能[16]。嚴重或者持續的熱應激會造成器官損傷甚至是致命的生理功能障礙[17]。研究發現,持續熱應激會抑制小鼠C2C12細胞的增殖、分化和遷移,影響肌管的發育[18]。熱應激也會誘導小鼠C2C12細胞發生凋亡,通過改變肌源性調節因子MyoD、myogenin和MyHC的表達擾亂肌管的生成[19]。持續熱應激還會促進雞成肌細胞的凋亡[20]。

miRNA是一種長約22個核苷酸、內源性啟動的短鏈非編碼RNA,其廣泛表達于動物各種組織和細胞中[21]。miRNA通過與靶基因的3′非翻譯區(3′untranslated region,3′UTR)結合來負調控靶基因的表達,miRNA還會引導RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結合靶基因的3′UTR,導致靶基因被降解或其翻譯過程被抑制,從而實現基因沉默[22]。miRNA能夠調控眾多細胞過程,如細胞增殖、分化、凋亡和遷移等[23]。最近,很多研究探明了miRNA在骨骼肌發育中的調控作用,如miR-23a-5p能夠促進C2C12成肌細胞的增殖,抑制分化過程[24];miR-24-3p可促進C2C12細胞的肌發生過程[25];miR-27a可促進C2C12細胞的增殖和分化[26];此外,miR-30a-5p會抑制雞成肌細胞的增殖,促進分化過程[27]。由此表明miRNA可調控成肌細胞的生長和發育。目前,對熱應激下成肌細胞增殖與分化過程的研究主要集中在小鼠C2C12細胞上,而在羊等家畜中的研究非常少,熱應激對羊成肌細胞miRNA影響尚未見報道。因此,本研究以羊成肌細胞miRNA為研究對象,利用RT-qRCR探究熱應激對羊成肌細胞miRNA的影響;通過生物信息學方法預測miRNA的靶基因,并對共同預測出的靶基因進行GO功能與KEGG信號通路的富集分析,為進一步探究熱應激條件下miRNA調控成肌細胞的增殖與分化過程提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗所用成肌細胞分離于健康的1月齡山羊(江蘇南京六合某羊場)。山羊屠宰后立即采集第13胸椎至第3腰椎的背最長肌,放入含5%(體積分數)雙抗(青霉素/鏈霉素)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,在 1 h 內運回實驗室,分離羊的成肌細胞并進行體外培養,以完成后續試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊成肌細胞的分離與體外培養采取酶消化法和差速貼壁法分離羊的成肌細胞。具體步驟如下：先將肌肉組織在75%乙醇中浸泡10 s,用含5%雙抗的PBS清洗3次,充分去除其表面的血跡;再將肌肉組織置于無菌平皿中,剔除筋膜和脂肪等組織,用眼科剪將肌肉組織充分剪碎,隨后轉移至無菌15 mL離心管中,加入適量PBS,吹打混勻,靜置3 min后棄掉上清液;加入適量含0.1% I型膠原酶的DMEM/F12(DF12),37 ℃水浴鍋消化1 h,每5 min上下顛倒1次,然后12 000 r·min-1離心5 min,棄上清液;加入適量0.25%胰蛋白酶,37 ℃水浴鍋消化15 min,棄上清液;經70 μm細胞篩過濾后,12 000 r·min-1離心 5 min,棄上清液;最后用含20%(體積分數)胎牛血清、10%(體積分數)馬血清和1%(體積分數)雙抗的DF12培養基進行重懸,接種于T25細胞培養瓶,于37 ℃、5%(體積分數)的CO2培養箱中培養2.5 h,再將培養液轉移至新的T25細胞培養瓶中繼續培養2.5 h,最后移至新的T25細胞培養瓶,即得到純凈的羊原代成肌細胞。當細胞長滿80%左右時,進行傳代：棄掉原有培養基,PBS洗滌1次,加入1 mL提前預熱的0.25%胰蛋白酶,放入37 ℃培養箱中消化1 min,加入1 mL培養液吹打均勻終止消化,300g離心5 min,棄上清液,加入1 mL培養液重懸沉淀,1∶2傳至新的細胞培養板。

羊成肌細胞增殖階段使用生長培養液進行培養,即含20%胎牛血清、10%馬血清和1%雙抗的DF12,隔天換液;當細胞長滿90%時,換用分化培養液誘導分化,即含2%馬血清和1%雙抗的DF12,隔天換液,觀察肌管的生成情況。

1.2.2 羊成肌細胞的熱應激處理增殖階段熱應激處理：當羊成肌細胞長滿90%時,放入42 ℃、5%的CO2培養箱中培養3 h;分化階段熱應激處理：當羊成肌細胞分化出明顯的肌管時放入42 ℃、5%的CO2培養箱中培養3 h。

1.2.3 免疫熒光鑒定羊成肌細胞將羊成肌細胞傳至35 mm細胞培養皿中培養,取誘導分化前后的羊成肌細胞,棄掉培養基,在搖床上用PBS清洗3次,每次5 min,加入1 mL 4%多聚甲醛,4 ℃過夜后棄掉多聚甲醛。在搖床上用PBS清洗3次,每次5 min,吸干PBS。加入0.5%(體積分數)Triton X-100(1×PBS配制)室溫通透20 min;在搖床上用PBS清洗3次,每次5 min,吸干PBS。用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。分別用PAX7(Affinity,AF7584,1∶500)、MYF5(Affinity,DF3089,1∶500)和MYHC(Abcam,Ab11083,1∶500)一抗4 ℃孵育過夜,在搖床上用PBS清洗3次,每次5 min,吸干PBS。加入熒光二抗室溫避光孵育1 h,在搖床上用PBS清洗2次,每次5 min,吸干PBS。用DAPI染核避光孵育15 min,滴加防熒光淬滅劑后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 細胞總RNA的提取與反轉錄(RT)熱應激后,采用Trizol法提取成肌細胞的總RNA,參照miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)反轉錄試劑盒(南京諾唯贊)的說明書,采用莖環法合成miRNA的cDNA。試驗過程：吸取1 μg細胞總RNA,加入2 μL 5×gDNA Wiper Mix,再加入RNase-free ddH2O至10 μL,吹打混勻,42 ℃反應2 min,去除基因組的DNA。反應完成后,加入1 μL Stem-loop primer(2 μmol·L-1),2 μL 10×RT Mix,2 μL HiScript Ⅱ Enzyme Mix和5 μL RNase-free ddH2O,吹打混勻,進行如下反應：25 ℃ 5 min,50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min,即得到miRNA的cDNA。最后用RNase-free ddH2O稀釋3倍,-80 ℃保存。

1.2.5 miRNA的引物設計與實時熒光定量PCR(RT-qPCR)依據Cleys等[28]的研究結果,選擇miR-23a、miR-24、miR-26a-5p、miR-27a-5p、miR-27a-3p、miR-29c-3p、miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-379-5p和miR-379-3p來探討熱應激對miRNA的影響。在miRBase數據庫(http：//www.mirbase.org/)中查找miRNA的成熟序列,在上海生工生物工程股份有限公司官網合成各miRNA的莖環引物、上游引物與下游引物,隨后交由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

以cDNA為模板,參照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊)的說明書,對miRNA進行定量分析,采用20 μL體系：10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,2 μL cDNA,0.4 μL 上游引物,0.4 μL下游引物,7.2 μL RNase-free ddH2O。RT-qPCR反應條件：95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。以U6為內參基因,每組3個重復。采用2-ΔΔCT法對miRNA的相對表達量進行定量分析。

1.2.6 miRNA的序列分析在miRBase數據庫中查找山羊、人、綿羊、小鼠、大鼠、牛、雞、野豬和家犬的miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的成熟序列,并對不同物種miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的成熟序列和種子序列進行分析,比較各miRNA的保守性。

1.2.7 miRNA系統進化樹的構建通過MEGA X軟件對miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的前體序列進行比對,計算各模型組合的貝葉斯信息準則分數(Bayesian information criterion,BIC),選擇BIC最低的組合。miR-23a選用Jukes-Cantor模型,miR-24和miR-27a選用Kimura 2-Parameter模型和Gamma分布,miR-30a選用Kimura 2-Parameter模型,分別構建miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a的系統進化樹。

1.2.8 miRNA的靶基因預測及功能分析利用4個在線網站TargetScan 8.0(https：//www.targetscan.org/vert_80/)、miRDB(https：//www.mirdb.org/)、miRWalk(http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)和RNA22(https：//cm.jefferson.edu/rna22/)對hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因進行預測。

使用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov)對預測出的共同靶基因進行GO(gene ontology)功能分析和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路富集分析,只保留P<0.05的條目,并利用聯川生物OmicStudio云工具繪制GO富集柱狀圖和因子圖以及KEGG富集柱狀圖和因子圖。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 羊成肌細胞增殖與分化階段的判定

通過免疫熒光染色檢測了成肌細胞增殖標志基因和分化標志基因的蛋白表達。如圖1所示：成肌細胞增殖標志蛋白PAX7和MYF5在肌衛星細胞中表達,成肌細胞分化標志蛋白MYHC在分化后的細胞中呈陽性表達,并且能看到明顯分化的肌管。以上結果表明該細胞為羊的成肌細胞,分別處于增殖階段與分化階段。

圖1 羊成肌細胞標志蛋白的免疫熒光檢測Fig.1 Immunofluorescence detection for the marker proteins of the myoblasts PAX7：配對盒轉錄因子7 Paired box 7;MYF5：成肌細胞決定蛋白5Myogenic differentiation 5;MYHC：肌球蛋白重鏈Myosin heavy chain;FITC：熒光素5-異硫氰酸酯Fluorescein isothiocyanate;DAPI：4′,6-二氨基-2-苯基吡啶4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.2 熱應激對羊成肌細胞miRNA的影響

如圖2-A所示：熱應激后,羊成肌細胞增殖階段miR-23a、miR-26a-5p、miR-29c-3p、miR-30a-5p、miR-30a-3p和miR-379-5p的相對表達量顯著降低(P<0.05),miR-24、miR-27a-5p、miR-379-3p(P<0.01)和miR-27a-3p(P<0.001)的相對表達量極顯著降低。如圖2-B所示：熱應激后,羊成肌細胞分化時期miR-23a、miR-26a-5p、miR-27a-3p和miR-379-5p的相對表達量顯著降低(P<0.05),miR-24和miR-30a-5p相對表達量極顯著降低(P<0.01)。上述結果說明熱應激會影響羊成肌細胞部分miRNA的表達。

圖2 RT-qPCR檢測熱應激下羊成肌細胞miRNA的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of miRNA by RT-qPCR in myoblasts under heat stressA. 增殖階段Proliferation stage;B. 分化階段Differentiation stage. 圓點表示每個數值。The dots indicate each value.CON：對照組Control group;HS：熱應激組Heat-stressed group. *P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.

2.3 miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a的序列分析

根據熱應激下羊成肌細胞miRNA的RT-qPCR結果,我們選擇了miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p進行后續的生物信息學分析以及靶基因預測。對不同物種miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p的成熟序列進行比對,結果(表2)發現,miR-23a在不同物種的成熟序列基本相同,同源性很高,且序列長度基本相同,均為19～22 nt,其中有19個堿基保守,即第1～19位堿基,并且不同物種的miR-23a的種子序列完全一致(UCACAUU),僅3′端末尾個別堿基存在不同程度的缺失。表3展示了不同物種miR-24的成熟序列,從表中發現除了牛的成熟序列外,其余物種miR-24的成熟序列基本相同,序列長度均為 20～23 nt,其中有20個堿基保守,即第1～20位堿基,并且這些物種miR-24的種子序列完全一致(GGCUCAG),也是3′端末尾個別堿基存在缺失情況。如表4所示：miR-27a-3p在不同物種中的成熟序列也基本相同,同源性很高,且序列長度基本相同,均為20～21 nt,其中有20個堿基保守,即第1～20位堿基,并且不同物種的miR-27a-3p的種子序列完全一致(UCACAGU),只是3′端末尾C堿基存在缺失情況。表5展示了不同物種miR-30a-5p的成熟序列,從表中發現不同物種miR-30a-5p的成熟序列基本相同,序列長度均為22～24 nt,其中有22個堿基保守,即第1～22位堿基,并且這些物種miR-30a-5p的種子序列完全一致(GUAAACA),也是3′端末尾個別堿基存在缺失情況。由此說明miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p具有較高的保守性。

表2 不同物種miR-23a的序列信息Table 2 Information on miR-23a sequences in different species

表3 不同物種miR-24的序列信息Table 3 Information on miR-24 sequences in different species

表4 不同物種miR-27a-3p的序列信息Table 4 Information on miR-27a-3p sequences in different species

表5 不同物種miR-30a-5p的序列信息Table 5 Information on miR-30a-5p sequences in different species

2.4 miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a的系統進化樹

利用MEGA X軟件對miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在山羊、人、綿羊、小鼠、大鼠、雞、牛、野豬和家犬等物種的前體序列進行比對分析,構建系統進化樹,發現miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在進化中保守性較高,成熟序列基本相同(圖3)。

圖3 miR-23a(A)、miR-24(B)、miR-27a(C)和miR-30a(D)的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic trees of miR-23a(A),miR-24(B),miR-27a(C)and miR-30a(D) oar：綿羊Ovis aries;bta：牛Bos taurus;hsa：人Homo sapiens;chi：山羊Capra hircus;ssc：野豬Sus scrofa;cfa：家犬Canis lupus familiaris;mmu：小鼠Mus musculus;rno：大鼠Rattus norvegicus;gga：雞Gallus gallus.

2.5 hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因預測

通過4個在線網站工具TargetScan、miRDB、RNA22和miRWalk對hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p進行靶基因的預測,分別預測到141、317、383和11個共同靶基因(圖4)。

圖4 hsa-miR-23a(A)、hsa-miR-24(B)、hsa-miR-27a-3p(C)和hsa-miR-30a-5p(D)的靶基因預測Fig.4 Target gene prediction of hsa-miR-23a(A),hsa-miR-24(B),hsa-miR-27a-3p(C)and hsa-miR-30a-5p(D)

2.6 hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因GO功能分析

分別對預測出的hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因進行GO功能分析,結果如圖5所示。141個hsa-miR-23a靶基因顯著富集在51個GO terms(P<0.05),其中生物過程 29個、細胞組分11個、分子功能11個(圖5-A),并且主要富集在細胞增殖的負向調控、細胞周期和細胞遷移等過程(圖5-B)。317個hsa-miR-24靶基因顯著富集在123個GO terms(P<0.05),其中生物過程 73個、細胞組分28個,分子功能22個(圖5-C),并且主要富集在細胞增殖的負向調控、細胞凋亡和遷移等(圖5-D)。383個hsa-miR-27a-3p靶基因顯著富集在185個GO terms(P<0.05),其中生物過程110個、細胞組分37個、分子功能38個(圖5-E),并且主要富集在細胞增殖、周期、遷移和骨骼肌細胞分化等(圖5-F)。11個hsa-miR-30a-5p靶基因富集在2個GO terms(P<0.10,圖5-H),即細胞組分2個(圖5-G)。GO功能分析結果提示miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p可能參與調控成肌細胞的增殖、分化、周期、凋亡、遷移等過程,進而調控骨骼肌的發育。

圖5 hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因GO功能分析Fig.5 GO function analysis of target genes of hsa-miR-23a,hsa-miR-24,hsa-miR-27a-3p and hsa-miR-30a-5pA,B. hsa-miR-23a;C,D. hsa-miR-24;E,F. hsa-miR-27a-3p;G,H. hsa-miR-30a-5p.

2.7 hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結果如圖6所示。hsa-miR-23a的靶基因顯著富集在2條通路上(P<0.05,圖6-B)。hsa-miR-24的靶基因顯著富集在19條通路(P<0.05,圖6-D),如MAPK、Ras、ErbB、FoxO和PI3K-Akt信號通路。hsa-miR-27a-3p的靶基因顯著富集在31條通路(P<0.05,圖6-F),如mTOR信號通路、TGFβ信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、ErbB信號通路、FoxO信號通路和PI3K-Akt信號通路。hsa-miR-30a-5p的靶基因無顯著富集的通路。以上結果表明miR-24和miR-27a-3p可能參與調控相關信號通路,從而影響骨骼肌的發育過程。

圖6 hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p的靶基因KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of hsa-miR-23a,hsa-miR-24 and hsa-miR-27a-3pA,B. hsa-miR-23a;C,D. hsa-miR-24;E,F. hsa-miR-27a-3p.

2.8 hsa-miR-24和hsa-miR-27a-3p與靶基因、KEGG通路的關聯分析

將hsa-miR-24和hsa-miR-27a-3p與靶基因、KEGG通路進行關聯分析,從結果(圖7)中發現：NLK與TAOK1是hsa-miR-24和hsa-miR-27a-3p的共同靶基因,可能調控MAPK與FoxO信號通路。此外,hsa-miR-24還可能通過調控PI3KR3基因的表達,來參與Ras、ErbB、FoxO、PI3K-Akt和mTOR信號通路。NARS、KRAS和SOS1作為信號通路的交互靶基因,hsa-miR-27a-3p可能靶向NARS、KRAS和SOS1調控MAPK、Ras、ErbB、FoxO、PI3K-Akt和mTOR信號通路。以上結果說明miR-24和miR-27a-3p可能通過調控靶基因影響相關信號通路,進而調控成肌細胞的增殖、分化、凋亡、遷移等過程,從而影響骨骼肌的發育。miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p對熱應激下成肌細胞增殖、分化、凋亡、遷移等調控作用還需要后續的試驗來深入探究。

圖7 hsa-miR-24和hsa-miR-27a-3p與靶基因、KEGG通路的關聯分析Fig.7 Correlation analysis of hsa-miR-24,hsa-miR-27a-3p with target genes and KEGG pathway PI3KR3：磷酸肌醇3激酶基因Phosphoinositide-3-kinase,regulatory subunit 3 gene;NLK：Nemo樣激酶基因Nemo-like kinase gene;TAOK1：TAO激酶1基因TAO kinase 1 gene;NARS：Asparaginyl-tRNA合成酶基因Asparaginyl-tRNA synthetase gene;KRAS：Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog;SOS1：七子基因編碼因子基因Son of sevenless gene encoding factor.

3 討論

miR-23a抑制C2C12細胞的肌分化[29],miR-24促進肌分化[30],miR-27a通過靶向肌生長抑制素基因來促進豬成肌細胞的增殖[31],miR-30a家族會促進小鼠C2C12細胞的分化過程[32]。然而,目前有關熱應激是否會影響miRNA表達的研究鮮有報道,熱應激如何通過調控miRNA的表達來影響成肌細胞的增殖、分化、凋亡等過程也尚不清楚。本研究通過RT-qPCR技術發現熱應激抑制羊成肌細胞增殖階段和分化階段大部分miRNA的表達,其中,miR-27a-3p的表達極顯著降低。由此表明熱應激會影響羊成肌細胞miRNA的表達,進而影響成肌細胞的各種生物學過程。

通過RT-qPCR試驗結果,本研究篩選了4個miRNA(miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p)進行后續的生物信息學分析與靶基因預測,并利用miRBase數據庫查詢山羊、人、綿羊、小鼠、大鼠、牛、雞、野豬和家犬的miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的成熟序列,經過序列比對后發現miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的成熟序列在各物種中基本相同,種子序列完全一致。miRNA的種子序列是miRNA 5′端第2～8個核苷酸,通常與靶基因3′UTR完全互補[33]。本研究結果表明miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p的保守性較強,其在不同物種的進化中發揮著重要作用。生物信息學分析表明山羊、人、綿羊、小鼠、大鼠、牛、雞、野豬和家犬的miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的成熟序列都只有1條。通過miRDB、TargetScan、miRWalk和RNA22預測miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的靶基因,分別預測到141、317、383和11個共同靶基因。因上述數據庫沒有羊的miRNA信息,且羊的這4個miRNA的成熟序列與人的基本相同,故而以人miRNA的成熟序列進行預測。

GO富集分析結果表明hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因主要富集在細胞增殖的負向調控、細胞周期、細胞凋亡、骨骼肌細胞分化和細胞遷移等生物學過程。已有相關研究報道了上述miRNA能夠調控小鼠C2C12細胞的增殖、分化、凋亡和遷移等[5,10,24]。本研究KEGG通路富集分析結果表明靶基因主要富集在MAPK、Ras、ErbB、FoxO、PI3K-Akt和mTOR信號通路。MAPK能夠調控細胞的增殖和分化等過程,細胞外信號相關激酶(extracellular signal-related kinases,ERK1/2/5)、P38 MAPK和Jun氨基末端激酶(Jun amino-terminal kinases,JNK1/2/3)都屬于MAPK家族[34]。PI3K-Akt也是細胞生長的重要信號因子[35]。研究表明P38 MAPK和PI3K-Akt信號通路調控C2C12成肌細胞的增殖[36]。哺乳動物中有4個FOXO基因,即FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6,這4種轉錄因子參與多種細胞生物學途徑[37]。Ras(H-、K-或N-Ras)是許多小GTP-結合蛋白中的一種,作為分子開關調節活性GTP-和非活性GDP的結合狀態。在骨骼肌成肌細胞中,Ras被認為是一種強烈的肌生成抑制劑,調節骨骼肌祖細胞的遷移。成紅細胞癌基因B(erythroblastic oncogene B,ErbB)屬于表皮生長因子受體酪氨酸激酶受體家族(epidermal growth factor receptor,EGFR),該家族由ErbB1(也稱為EGFR)、ErbB2、ErbB3和ErbB4組成,能夠調節細胞的生長、凋亡和分化[38]。由此表明miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p可能通過參與MAPK、Ras、ErbB、FoxO、PI3K-Akt和mTOR信號通路,來調控成肌細胞的增殖、凋亡和分化等過程,從而影響骨骼肌的發育。

本研究發現,hsa-miR-24和hsa-miR-27a-3p可能都會調控NLK與TAOK1基因,參與MAPK、Ras、ErbB、FoxO、PI3K-Akt和mTOR信號通路。研究發現Ras/ERK/SRF/ELK信號傳導需要NLK(Nemo-like kinase)通過磷酸化SRF和拮抗SRF/MKL途徑來調節骨骼肌發育,在NLK敲除小鼠中,肌纖維會肥大生長,增加肌肉和體重,表明NLK能夠調節體內肌肉發育[39]。TAOK1(thousand and one amino-acid kinase 1)是步驟20p蛋白激酶家族的一部分,在絲裂原活化蛋白激酶級聯的上游發揮重要作用,參與多個細胞生物學過程。TAOK1也稱為PSK2、TAO1或MARKK,通過c-Jun N末端激酶和Rho激酶1參與凋亡[40]。TAOK1在炎癥反應和癌癥的調節過程中發揮著重要作用,已被廣泛證實為癌癥藥物的潛在靶點[41]。然而,TAOK1是否調控骨骼肌的發育還不清楚。

綜上,本研究首次探明了熱應激對羊成肌細胞部分miRNA的影響并進行了生物信息學分析,預測了靶基因與調控成肌細胞的生物學功能與信號通路,但是熱應激條件下miRNA的具體作用機制及其與靶基因的靶向關系還有待于深入研究。