電針干預去勢骨質疏松大鼠“骨微生態”的作用機制研究

屈媛媛,楊添淞,孫忠人,馮楚文,林楚華,王慶勇,馬 帥,秦鴻宇,鮑圣涌△

1.深圳市人民醫院,廣東 深圳 518020;2.黑龍江中醫藥大學第二臨床醫學院,黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,黑龍江 哈爾濱 150040;4.黑龍江省針灸臨床(腦病)神經生物學重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150040

絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)以全身骨量減少、骨微觀結構退化為特征,主要發生在女性絕經后[1]。社會老齡化加劇了醫療資源和醫療需求之間的失衡[2]。因此,PMOP的臨床防治必須高度重視。PMOP的西醫治療主要包括藥物療法、雌激素替代療法與營養療法等,其中大多數藥物存在服藥周期長、不良反應多且使用不便等缺點[3]。研究證實針灸防治PMOP有效[4-5],在改善骨密度(Bone mineral density, BMD)、激素水平和骨代謝等方面療效顯著。前期研究證實電針“關元”和“后三里”可以改變去勢骨質疏松大鼠的骨礦物質含量、BMD及炎癥因子等指標。

腸道微生物組成的“虛擬器官”在生理和病理過程中發揮著調節作用[6],Ohlsson等提出的“骨微生物學”更是直接闡明了腸道菌群在骨健康中的重要性[7]。為深入研究電針干預機制,本研究從“骨微生物”角度入手,納入16S rRNA測序技術。16S rRNA測序技術是最常用的高通量測序依賴的組學技術之一,實現了對復雜樣品中混合菌種的分類學鑒定和精確定量,并通過生物信息學分析獲得實驗樣品中細菌物種組成、物種豐度與群落比較等諸多信息[8-10]。因而本研究應用去勢雌性大鼠建立骨質疏松模型,利用生物力學實驗檢測骨質,結合16S rRNA測序技術,試圖從腸道菌群的豐度及構成變化層面闡釋電針對去勢骨質疏松大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SPF級大鼠80只,6月齡,體質量(320±30)g,購自青島市實驗動物和動物實驗中心[許可證編號:CXK (魯)2014 0001]。于SPF級實驗室適應性飼養7 d,在此期間大鼠自由飲水進食,環境溫度22～24 ℃,相對濕度 40%～60%,晝夜節律12 h光/12 h暗。每日定期更換墊料,清洗大鼠飲水器并補充飼料及飲用水。本實驗經深圳市人民醫院醫學倫理委員會批準(批件號:LL-KY-2019170)。

1.2 實驗材料

1.2.1 儀器 電針儀(HANS-200A,南京濟生醫療科技有限公司);20 kN電子萬能試驗機(AGXplus,島津);核酸電泳儀(DYCP-32C,北京市六一儀器廠);超聲波破碎儀(Covaris S2 System, Massachusetts);Qubit Fluorometric Quantification (Qubit 2.0, Thermo Scientific);生物分析儀(Agilent 5400, Agilent Technologies Co Ltd.);PCR儀(T100PCR, Bio-Rad);測序儀(Novaseq 6000, Illumina,San Diego)。

1.2.2 試劑 CTAB方法提取樣本DNA(Nobleryder);Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer (M0531S, New England Biolabs);Phusion? High-Fidelity DNA polymerase (M0530S, New England Biolabs);2% agarose gels (111860, biowest);PCR產物純化Universal DNA純化回收試劑盒(DP214, TianGen);NEB Next? Ultra DNA Library Prep Kit (E7370L, Illumina, San Diego)。

1.3 建模

將80只6月齡、體質量(320±30)g的雌性大鼠隨機平均分為兩組,假手術組(Con)20只和造模組60只。3%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉后,Con組大鼠切除卵巢周圍部分脂肪組織(大小同卵巢)后縫合;造模組切除雙卵巢。保溫待麻醉蘇醒。術后肌注青霉素生理鹽水(4萬單位/mL)抗炎,每天注射1.5 mL,連續3 d。自由攝水和進食標準飼料,其中鈣和磷含量分別為0.6%和0.4%,飼養12周[11],期間不給予任何干預,造模成功。

1.4 分組與干預

將造模成功大鼠隨機分為模型組(Mod)20只、電針A組(MA)20只與電針B組(MB)20只。MA和MB大鼠接受電針治療,取穴“關元”“后三里”,連接電針,正極接“后三里”(兩側隔日交替連接電針),負極接“關元”疏密波,2 Hz/15 Hz,1 mA[12- 13]。電針治療1次/d,每次15 min,留針10 min,連續治療6 d后休息1 d。MA連續治療4周后取材,MB連續治療8周后取材。

1.5 標本收集

每組隨機選取10只大鼠,將其置于代謝籠中收集糞便,放入-80 ℃低溫冰箱保存,待進行16S rRNA測序。隨后各組所有大鼠接受3%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)麻醉,頸椎脫臼法處死后,取右側脛骨、第5腰椎體。注意在不損傷骨質的情況下,去除附著的肌肉和結締組織,用PBS生理鹽水浸透的紗布包裹摘出的骨骼,裝入密閉凍存管中并編號,將標本放置于-80 ℃冰箱留待生物力學檢測。

1.6 生物力學檢測

1.6.1 椎骨壓縮實驗 L5椎體解凍至室溫(22～35 ℃),注意維持骨骼濕潤。將椎弓根等附件從椎體分離,使用砂紙打磨椎體上下表面使之平行,以暴露松質骨為限。將打磨后椎體置于電子萬能試驗機上,確認上下表面緊貼平行的不銹鋼板,以0.05 mm/s的速度進行壓縮,達到極限載荷,即出現骨折為限。記錄載荷變形曲線及最大載荷、彈性模量。

1.6.2 三點抗彎實驗 右脛骨解凍至室溫,在電子萬能試驗機上完成三點抗壓最大載荷檢測。支點跨距為30 mm,加載跨距10 mm,加載速率為0.5 mm/min,至脛骨折斷瞬間電腦自動采集到三點抗壓最大載荷。記錄載荷變形曲線及最大載荷、彈性模量。

1.7 糞便16S rRNA測序

1.7.1 DNA抽提和PCR擴增 采用CTAB提取樣本基因組DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度,取適量樣品于離心管中,無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。用341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)引物對V3+V4可變區進行PCR擴增。

1.7.2 PCR產物純化和混樣 根據PCR產物濃度等量混樣,混勻后用1xTAE 2%瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產物,使用純化回收試劑盒回收目的條帶。

1.7.3 文庫構建和上機測序 使用NEB Next? Ultra DNA Library Prep Kit進行文庫構建,將構建好的文庫使用安捷倫5 400檢測和Q-PCR定量;文庫合格后使用NovaSeq 6000上機測序。

1.7.4 信息分析 將原始序列fastq文件導入為可進行QIIME2后續處理的文件格式。然后運用QIIME2 dada2插件進行質控、修剪、去噪、拼接和去除嵌合體后,得到了最終特征序列表格[14]。運用QIIME2 feature-classifier插件將ASV的代表序列比對到預先訓練好的13_8版本99%相似度的GREENGENES數據庫(根據341F/806R引物對將數據庫修剪到V3V4的區域),得到了物種的分類信息表[15]。用QIIME2 feature-table插件剔除所有污染性的線粒體和葉綠體序列。LEfSe和DEseq2方法鑒定分組和樣本間豐度有差異的細菌[16-18]。應用R軟件包“mixOmics”,偏最小二乘判別分析(PLS-DA)揭示微生物群落與樣品類別之間的關系模型來實現對樣品類別的預測[19]。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 生物力學分析結果

2.1.1 各組椎骨壓縮實驗比較 與Con相比,Mod大鼠的椎骨最大載荷、彈性模量均下降,差異具有統計學意義(P<0.01),證實造模成功;與模型組比較,MA和MB的椎骨最大載荷、彈性模量均升高(P<0.05或P<0.01);且MB的椎骨最大載荷、彈性模量優于MA,差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 椎骨壓縮實驗結果

2.1.2 各組三點抗彎實驗比較 與Con比較,Mod大鼠的脛骨最大載荷、彈性模量均下降,差異具有統計學意義(P<0.01),證實造模成功;與模型組比較,MA和MB的脛骨最大載荷、彈性模量均升高;且MB的脛骨最大載荷、彈性模量優于MA,差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 脛骨三點抗彎實驗結果

2.2 糞便菌群測序結果分析

2.2.1 樣品共有物種分析 Con和Mod共有OUT(Operational Taxonomic Unit,即分類操作單元)數目879;Mod和MA共有OUT數目1061;Mod和MB共有OUT數目979。Con、Mod、MA與MB各自特有OUT數目分別為604、446、610和1035。4組共有OUT數目為699。見圖1。

圖1 共有或特有物種韋恩圖

2.2.2 物種組成分析 從門級別的分布情況來看,共檢測出20種主要細菌門類,厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)位列前3。與假手術組比較,模型組厚壁菌門、放線菌門豐度增加,擬桿菌門減少,電針干預后出現不同程度的回調。見圖2。

2.2.3 組間OTU差異顯著性分析 LEfSe分析各組特征微生物結果:在屬水平上,假手術組中的特征微生物是Jeotgalicoccus屬和考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium);模型組的特征微生物是乳桿菌屬(Lactobacillus)和Akkermansia屬;電針治療A組的特征微生物是顫螺旋菌屬(Oscillospira)、羅氏菌屬(Roseburia)、螺桿菌屬(Helicobacter)和梭菌屬(Clostridium);電針治療B組的特征微生物是假單胞菌屬(Pseudomonas)、Dysgonomonas屬、乳球菌屬(Lactococcus)、紫色桿菌屬(Janthinobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、Paludibacter屬、腸球菌屬(Enterococcus)和羅思氏菌屬(Rothia)。見圖3、表3。

圖3 LEfSe分析LDA柱形圖(genus屬)(LDA>2)

表3 各組特征微生物(LEfSe分析LDA值>2物種,genus水平)

DESeq2分析組間差異菌屬結果:比較假手術組與模型組,在屬、科、目、綱與門水平上的差異OUT分別為5種、2種、2種、1種和1種,矯正后P值均<0.05。其中具有顯著統計學差異的考拉桿菌屬、耐鹽咸海鮮球菌屬為LEfSe分析的假手術組優勢菌屬。見表4。

表4 Con和Mod之間的DESeq2差異豐度

比較模型組與電針A組,在屬、科、目、綱與門水平上的差異OUT分別為6種、7種、6種、4種和1種,矯正后P值均<0.05。其中具有顯著統計學差異的螺桿菌屬、顫螺菌屬為LEfSe分析的電針A組優勢菌屬。見表5。

表5 Mod和MA之間的DESeq2差異豐度

比較模型組與電針B組,在屬、科、目、綱與門水平上的差異OUT分別為7種、12種、9種、4種和2種,矯正后P值均<0.05。其中具有極顯著統計學差異的假單胞菌屬、Dysgonomonas屬和紫色桿菌屬為LEfSe分析的電針B組優勢菌屬。見表6。

分析以上表格發現,DESeq2分析結果中Mod與MB比較結果具有顯著性統計學差異的菌群包含了所有Mod與MA比較組具有顯著性統計學差異的相關菌群。

2.2.4 Beta多樣性指數統計分析 同一分組的樣本彼此之間距離較近,不同分組的點之間距離較遠,表明分類模型效果越好。見圖4。所得到曲線下面積值均接近于1,說明區分效果好,有多個微生物在分組間豐度有差異。見圖5。

圖4 PLS-DA坐標圖

圖5 PLS-DA AUC曲線圖

3 討論

本研究對大鼠的脛骨和椎骨分別進行了骨質疏松表型研究的經典實驗[20]三點抗彎實驗和椎骨壓縮實驗,兩種檢測結果的最大載荷和彈性模量均在造模后出現下降,在電針干預后出現不同程度的回調,說明骨受力和骨韌性顯著改善,從生物力學角度證實模型建立成功及電針干預對去勢大鼠骨質疏松有效,其中干預8周的數據優于4周,肯定了模型制備的可靠性和電針的療效。選穴“關元”“足三里”兩穴,選穴思路來源于“雙固一通”針灸理論[21]。天癸和氣血正常運行在維持女性的生理功能方面發揮了重要作用[22],“雙固”即固護先天和后天之本,恰合圍絕經期女性生理特點。關元穴功能補腎培元,“腎主骨生髓”,補益先天;足三里健運脾胃,調理后天,二者固護正氣、以治為防,充分體現了“治病求本”的中醫治療觀。配合疏密波電針治療,放大針灸治療效果,操作方便。

大量研究證實腸道菌群失調與人類和嚙齒動物的骨關節炎和骨質疏松發展相關[23]。作為腸道菌群中最主要的門[24-26],調節厚壁菌門和擬桿菌門的比例有利于抑制肌肉骨骼組織中因年齡增加引起的慢性炎癥和氧化損傷[23]?？梢姽琴|與腸道菌群之間聯系密切。本研究各分組之間菌群差異明顯,隨著電針治療時間延長,各個層面具有顯著差異的腸道菌群數量均上升,表明電針治療呈時效累加性改善骨質疏松大鼠腸道菌群狀態。

從門級別的分布情況而言物種組成,本研究檢測出的20種主要細菌門類中,厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門位列前3。與假手術組比較,模型組的厚壁菌門、放線菌門豐度增加,擬桿菌門減少,電針干預后出現不同程度的回調。查閱文獻發現,厚壁菌門和擬桿菌門在骨代謝中發揮的作用可能與雌激素抑制有關[27]。研究指出厚壁菌門在去勢術后8周內下降,隨后明顯增加,而且增加幅度和去勢前比較差異有統計學意義(P<0. 05)[28],趨勢變化與本研究一致。腸道微生物組及其發酵副產物與骨代謝有關,能量缺乏、雌激素不足可致骨骼健康受損,神經性厭食癥者厚壁菌門減少[29]。老年人群厚壁菌門細菌減少導致短鏈脂肪酸含量下降,影響其發揮抗炎、抗腫瘤活性等作用[30]。

擬桿菌門為多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)優勢菌[31]。而在來曲唑聯合高脂飲食誘導的PCOS大鼠腸道菌群中,各分類水平的擬桿菌豐度均減少[32]。而且擬桿菌門可以異常增殖產生脂多糖[33],降解腸黏膜上黏蛋白[34],誘導和維持腸道微環境慢性炎癥狀態。由此證實擬桿菌門可誘導炎癥反應,但對激素水平呈現出雙向調節作用,此外其與骨質狀態也存在一定聯系。研究發現萬通筋骨片可以顯著改變類風濕關節炎大鼠腸道菌群門水平上的擬桿菌、軟壁菌和脫鐵桿菌的菌群相對豐度,恢復擬桿菌與厚壁菌的相對豐度比值到正常水平[35];去勢后擬桿菌(門/綱/目)逐漸增加到術后8周,隨后顯著下降[28],趨勢與本研究一致。

放線菌門同樣是PCOS患者腸道菌群的主要優勢菌門[31]。在探討骨質疏松模型大鼠腸道菌群結構多樣性特征及固本增骨方作用靶點菌種的研究中發現,模型對照組、空白對照組、戊酸雌二醇組及固本增骨方的菌群存在差異,差異菌群主要集中在放線菌門、螺旋菌門、變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門等[36]。

進一步查閱LEfSe和DESeq2結果綜合分析出的具有顯著統計學差異的各組屬水平上特征微生物與PMOP發病相關病理特點發現,假手術組中的考拉桿菌屬在卵巢功能低下大鼠中為顯著差異菌群[37],為PCOS患者與健康人群的差異菌群[38],隊列研究指出其豐度與骨質疏松正相關[39]。耐鹽咸海鮮球菌屬為穴位埋線干預PMOP的顯著差異菌群[40]。結合兩菌屬為空白組中的顯著特征微生物,可以推測其菌群特征可能用于區分雌激素分泌健康與非健康人群,同時后者與骨質疏松相關。電針A組中的螺桿菌屬在雌性大鼠去勢后12周顯著增多[28]。顫螺菌屬豐度與骨質疏松正相關[39],與抗骨質疏松作用負相關[41];其在去勢大鼠中顯著富集,可能是核因子-κB受體激活劑和抗酒石酸酸性磷酸酶顯著上調和骨保護素下調的原因之一[42]。電針B組中,假單胞菌屬歸屬于變形菌門,變形菌門為PCOS優勢菌[31],在HIV/AIDS 患者免疫重建不良、免疫重建良好和健康人群的3組間腸道菌群豐度差異有統計學意義(P<0.05)[43],證實該菌屬豐度與炎癥及女性機體代謝相關。Dysgonomonas屬隸屬于擬桿菌門,紫色桿菌屬為部分市售牛奶中含有的菌屬[44]。

通過分析各組特征微生物發現,假手術組的特征微生物均歸屬于厚壁菌門,模型組的歸屬于厚壁菌門和疣狀菌門,電針干預后的主要集中在厚壁菌門和擬桿菌門,其中治療8周的大鼠腸道菌群的特征微生物更多,與物種組成分析結果一致。綜上可以得出結論,去勢大鼠的腸道菌群存在菌種失調現象,電針可以改善;各組屬水平上特征微生物主要歸屬于厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門,與骨代謝、炎癥反應和激素水平密切相關;電針可能通過調節腸道菌群豐度和組成結構來發揮抗骨質疏松作用,且治療效果在一定時間范圍內具有累加性。

本研究發現了“雙固”針法干預所影響的特異性腸道菌群,同時從時間上縱向證實針灸療效的產生并非偶然,而是隨治療時間的增加逐步提高的。但尚存不足之處:其一,僅利用生物力學實驗結果證實模型建立的有效性,未結合病理切片進行佐證;其二,本研究選穴關元和足三里兩穴,雖契合針灸多靶點干預的特點,但未能細致闡明單穴對“骨微生態”的影響,較之單穴研究意義稍遜;其三,未對上述特征微生物進行體外或體內實驗驗證。