基于OPG/RANKL及Notch1信號通路探討溫針灸對膝骨性關節炎兔軟骨下骨損傷的影響

馮倫冬,黃 衛,李厚臣,楊曉倩

1.?？谑械谌嗣襻t院,海南 ?？?571100;2.海南省中醫院,海南 ?？?570100

膝骨性關節炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種以關節軟骨退化為特征的關節疾病,主要表現為關節疼痛、畸形和功能障礙,甚至殘疾[1]。盡管KOA的發病機制仍存在爭議,但信號通路轉導異常及軟骨退化和軟骨下骨損傷在KOA發生發展中發揮重要的作用[2-3]。有臨床研究報道,抑制軟骨下骨損傷可以有效緩解軟骨侵蝕,提示抑制軟骨下骨吸收是用于治療KOA的潛在目標[4]。骨保護蛋白(Osteoprotegerin,OPG)及核因子κB受體活化子配體(Receptor activator of NFKB ligand,RANKL)是調節骨重塑的關鍵通路之一,主要通過調節破骨細胞活性來實現。OPG及RANKL在軟骨下骨中的表達對骨重塑過程產生極大影響,可能在KOA發病過程中起著重要的作用[5]。Notch是一種存在于多種動物體內的進化高度保守的信號通路,與靶基因Notch1的結合在骨性關節炎軟骨細胞增殖、分化、凋亡以及維持軟骨細胞基質代謝平衡等方面具有重要作用[6]。溫針灸是治療KOA的常用中醫方法之一,能促進軟骨的代謝水平和炎性物質的吸收,抑制其氧化應激損傷,從而減輕關節軟骨病變和改善關節活動障礙[7]。然而,關于溫針灸對KOA兔軟骨下骨形態改變及其與OPG/RANKL及Notch1信號通路的調節作用仍未完全闡明。為此,本研究通過建立兔KOA模型,觀察溫針灸對OPG、RANKL及Notch1表達的影響,探討溫針灸通過調控OPG/RANKL及Notch1信號通路在 KOA中的作用機制,以期為溫針灸治療KOA提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取普通級健康新西蘭兔50只(雌雄各半),6個月,體質量約2.5～3.0 kg,由北京動物實驗中心提供,動物許可證:SYYX2020-0005。在單獨的籠子中飼養,溫度和濕度分別保持在(22±2)℃和50%～60%,標準飼料。兔子適應1周后,隨機分為空白組(12只)和造模組(38只)。嚴格按照《實驗動物管理條例》進行實驗過程,本研究經本院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑與儀器 DAB顯色劑、10%山羊血清及二抗(北京中杉金橋);抗OPG、抗RANKL、抗Notch1及抗β-actin(北京博奧森);BCA試劑盒(北京索萊寶);反轉錄及熒光定量PCR試劑(廣州銳博生物)。PCR儀(美國ABI 7500型);酶標儀、電泳儀及掃描儀(美國Bio-Rad);石蠟切片機(德國Leica);普通光學顯微鏡及圖像分析系統(日本Olympus);針灸針(0.35 mm×40 mm,蘇州醫療用品公司);艾條(直徑1.9～2.1 cm,長20～21 cm,江蘇康美制藥公司)。

1.2 造模方法及分組

兔KOA模型采用管型石膏伸直位固定法,將造模組兔右后肢膝關節伸直,剃去兔毛,固定右后肢(石膏繃帶包繞于踝關節上2 cm處),打緊醫用繃帶,待石膏硬化后放回兔籠,固定6周制備KOA模型。固定結束后隨機取出空白組和造模組各2只兔,空氣栓塞處死,對兔右膝關節軟骨下骨進行HE染色,觀察軟骨結構。以造模組軟骨下骨細胞排列紊亂變薄,潮線欠佳和有血管穿過為造模成功。最后拆除石膏,將36只造模成功兔隨機分為模型組、藥物組和溫針灸組,每組12只。

1.3 干預方法

1.3.1 空白組 不予任何干預。

1.3.2 模型組 每天在兔架上固定于15 min,共4周。

1.3.3 藥物組 給予150 μg/kg阿侖膦酸鈉溶液(杭州默沙東制藥有限公司,國藥準字J20130085)灌胃,1次/d,共4周。

1.3.4 溫針灸組 參考《實驗針灸學》取穴,給予兔右后肢“鶴頂”“內膝眼”及“外膝眼”溫針灸治療[8],直刺進針3～5 mm,艾炷固定于針灸針末端,近端點燃,灸3壯艾炷(約15 min),1次/d,共4周。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 兔Lequesne MG評分 在干預結束后次日,應用Lequesne MG評分量表對各組兔右膝關節功能障礙程度進行評估,總分越高代表膝關節病變越嚴重。評分方法見表1。

表1 Lequesne MG評分量表標準

1.4.2 標本收集 干預結束后,空氣栓塞處死各實驗兔,碘伏消毒,取右后肢膝關節端股骨軟骨下骨組織,使用生理鹽水沖洗,放入4%多聚甲醛溶液固定保存,后期進行脫鈣和石蠟包埋切片,用于后續實驗檢測。

1.4.3 HE染色觀察形態學 對石蠟切片進行脫蠟,然后行蘇木素染色、1%鹽酸酒精分化、伊紅染色、脫水、透明及封片。觀察軟骨下骨組織形態學變化,并進行Mankin評分。見表2。

表2 Mankin評分標準

1.4.4 OPG、RANKL及Notch1 mRNA含量檢測 采用Trizol法提取軟骨下骨組織中的mRNA含量,以提取的RNA為模板,逆轉錄cDNA。應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測mRNA含量。反應體系:正反向引物各0.5 μL,cDNA模板1 μL,雙蒸水8 μL,TaqMan通用混合物溶液10 μL。擴增條件為:95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s,共40個循環。以β-actin為內參,采用2-△△Ct法計算OPG、RANKL及Notch1 mRNA含量。

1.4.5 蛋白質印跡法檢測OPG、RANKL及Notch1蛋白表達 提取兔軟骨下骨組織的蛋白質,采用BCA試劑檢測蛋白的濃度。進行電泳分離、轉膜,脫脂乳封閉,分別加入抗OPG、抗RANKL、抗Notch1和抗β-actin(內參)在4 ℃孵育過夜,洗滌濾膜后在二抗中孵育1 h,采用增強化學發光試劑檢測各蛋白表達情況。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 各組兔膝關節軟骨下骨組織形態變化

空白組軟骨下骨細胞排列整齊均勻,潮線完整,軟骨層結構清晰完整,細胞形態正常,細胞基質著色正常;模型組軟骨結構破損,軟骨層變薄,軟骨下骨細胞排列紊亂,細胞固縮壞死,細胞空泡多,細胞基質染色顯著減少;藥物組和溫針灸組軟骨表面相對光滑完整,結構較為清晰,軟骨下骨處細胞分布較為整齊均勻。

2.2 各組兔Lequesne MG評分及Mankin評分比較

模型組、藥物組和溫針灸組Lequesne MG評分及Mankin評分明顯高于空白組,差異具有統計學意義(P<0.01),藥物組和溫針灸組Lequesne MG評分及Mankin評分明顯低于模型組,差異具有統計學意義(P<0.01),且溫針灸組Lequesne MG評分及Mankin評分明顯低于藥物組,差異均有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組兔Lequesne MG評分及Mankin評分比較

2.3 各組兔OPG、RANKL及Notch1 mRNA含量比較

與空白組比較,模型組、藥物組和溫針灸組OPG mRNA表達水平明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01),模型組RANKL及Notch1 mRNA表達水平均明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,藥物組和溫針灸組OPG mRNA表達水平明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01),RANKL及Notch1 mRNA表達水平均明顯下降,差異具有統計學意義(P<0.01),OPG/RANKL及OPG/Notch1比值明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01)。溫針灸組與藥物組OPG、RANKL及Notch1 mRNA含量比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表4和圖1。

圖1 OPG、RANKL及Notch1 mRNA溶解曲線圖

表4 各組兔OPG、RANKL及Notch1 mRNA含量比較

2.4 各組兔OPG、RANKL及Notch1蛋白表達比較

與空白組比較,模型組RANKL及Notch1蛋白表達水平明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01),OPG/RANKL及OPG/Notch1比值明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.01);與模型組比較,藥物組和溫針灸組OPG蛋白表達水平明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01),RANKL及Notch1蛋白表達水平明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.01),OPG/RANKL及OPG/Notch1比值明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.01)。溫針灸組OPG蛋白、OPG/RANKL及OPG/Notch1水平高于藥物組,差異有統計學意義(P<0.01)。見表5和圖2。

圖2 各組兔OPG、RANKL及Notch1蛋白表達水平

表5 各組兔OPG、RANKL及Notch1蛋白表達比較

3 討論

KOA是一種病因復雜的異質性疾病,其中關節軟骨下骨出現損傷和軟骨下骨細胞凋亡在KOA的發病中起著重要作用。當機體發生KOA病變時,軟骨下破骨細胞異常激活,造成骨吸收與骨形成平衡被打破,從而導致骨重塑異常[9]。OPG是RANKL的誘騙受體,能阻止RANKL與其受體的結合,抑制破骨細胞的增殖、分化和成熟并誘導其凋亡,從而抑制骨骼吸收[10]。Kovács等[11]研究指出,OPG作為重要的骨保護因子,與RANKL競爭性結合調控骨代謝信號通路,使得成骨細胞活性增強和骨保護增強。RANKL是調節破骨細胞分化發生的重要分子,能加速破骨細胞前體分化并促進破骨細胞成熟,從而發揮促進骨吸收作用。有研究證實,OPG/RANKL信號通路是重要的破骨細胞調控系統,維持正常骨重塑和骨量穩定性,可通過調節OPG/RANKL信號通路有效抑制破骨細胞的形成和骨吸收,參與KOA的病理過程[12]。Notch1作為Notch家族的主要成員之一,參與調控軟骨細胞分化、增殖及程序性死亡等過程,抑制Notch1信號通路對減輕骨關節炎具有重要幫助[13]。越來越多的研究表明,KOA的發生發展與多個信號傳導途徑有關,其中OPG/RANKL及Notch1信號對軟骨基質的合成代謝和分解代謝都起著重要作用[14-15]。溫針灸是一種針刺與艾灸相結合的技術,可通過抑制軟骨細胞凋亡和軟骨基質的水解從而起到治療KOA的效果[16]。KOA在中醫學歸為“骨痹”,溫針灸借助艾灸的熱力及藥力刺激經絡、腧穴,起到行氣活血、袪風除濕功效,能夠有效治療此類痹證。本研究選取鶴頂”“內膝眼”“外膝眼”進行治療,為患處局部取穴,“腧穴所在,主治所及”,以疏通局部氣血,恢復膝關節軟骨內環境平衡。

本研究行溫針灸治療后,軟骨表面光滑結構清晰,軟骨下骨處細胞分布整齊均勻,可明顯降低Lequesne MG評分及Mankin評分,改善KOA兔膝關節腫脹、跛行等行為和減輕軟骨下骨的損傷。這可能與溫針灸促進膝周的血液循環有關。張艷玲等[17]研究也發現,溫針灸治療能夠顯著改善KOA兔關節軟骨結構,減輕軟骨缺損和基質降解,發揮治療KOA的作用。

OPG、RANKL及Notch1是影響骨質量的主要因子,通過OPG/RANKL及OPG/Notch1比值可反映骨代謝和骨質破壞情況,當其失衡時,能誘導骨再吸收,破壞骨環境穩定,進而引發骨代謝病。本研究表明,溫針灸可促進OPG升高和抑制RANKL及Notch1的表達,通過上調OPG/RANKL及OPG/Notch1比值,減少軟骨下骨吸收,抑制軟骨下骨惡化,改善骨微環境,進而減輕了KOA兔軟骨下骨的損傷,具有延緩KOA進程的作用。一方面OPG可阻止RANKL與其受體的結合,抑制破骨細胞的分化,阻止骨吸收,從而達到減緩軟骨退變的作用[18];另一方面Notch1對維持軟骨基質代謝平衡起著十分重要作用,抑制Notch1信號通路后,關節軟骨破壞減少,骨關節炎減輕,對延緩KOA進展起著關鍵作用。因此,調控OPG/RANKL及Notch1信號通路的表達是減緩KOA進展的治療靶點。武永利等[19]研究認為,溫針灸可通過調控OPG/RANKL信號通路來減緩軟骨下骨破壞,從而發揮治療KOA的目的。另有研究表明,Notch1信號通路通過凋亡途徑抑制軟骨細胞凋亡,減輕KOA發展,為治療KOA提供幫助[20]。

綜上所述,溫針灸可促進OPG表達,抑制RANKL及Notch1表達,通過調控OPG/RANKL及Notch1信號通路,減輕KOA兔軟骨下骨的損傷,從而起到治療KOA的作用。但影響KOA的發病因素較多,本研究僅觀察了溫針灸對OPG/RANKL及Notch1信號通路的調控,未能深入分析OPG/RANKL與Notch1在KOA中的關系及相互作用機制,今后仍需要進一步深入研究。