基于NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡探討針康法對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的影響

劉 波,丁小連,單昊宇,康玉瑩,白 露

1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;3.齊齊哈爾醫學院,黑龍江 齊齊哈爾 161003

新生兒缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是指圍生期由于腦內氧供給和血流量的不足所致的腦組織損傷[1],是造成新生兒長期殘疾的主要神經系統疾病之一。在缺血缺氧后的幾個小時內,大腦組織會發生氧化應激、炎癥反應等一系列的神經毒性損傷,造成神經細胞的廣泛死亡與神經功能缺損。炎癥小體活化是神經炎性反應中必不可少的一步,同時也是神經細胞死亡的主要誘因。細胞焦亡是一種典型依賴于炎癥反應的程序性細胞死亡方式[2]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體可誘導細胞焦亡,其機制[3]是通過切割半胱氨酸天冬氨酸酶1(Caspase-1)以及促進白細胞介素(IL)-1β、IL-18的成熟和消皮素D(GasderminD,GSDMD)的裂解來增加促炎因子的釋放。研究證實[4],細胞焦亡觸發的無菌性炎癥與HIBD的發生與發展緊密相關,抑制NLRP3介導的細胞焦亡可改善腦損傷。在頭穴叢刺長留針的過程中對HIBD患兒進行康復功能訓練,可有效改善患兒的運動功能障礙,但其作用機理尚未明確。因此,本研究通過構建新生大鼠HIBD模型,以探討針康法是否通過抑制NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡發揮腦保護作用,以進一步探究其改善HIBD后運動功能缺損的潛在機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

新生7 d齡Wistar大鼠120只,體質量10～15 g(遼寧長生),實驗動物飼養于黑龍江中醫藥大學腦功能與神經康復實驗室,溫度(23±1)℃,濕度(50±10)%,12 h光暗循環,動物自由飲水和攝食。隨機將其分成5組:正常對照組(A組)、模型對照組(B組)、頭穴叢刺組(C組)、康復訓練組(D組)和針康組(E組),每組再分成24 h、7 d和14 d共3個亞組。本實驗經黑龍江中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批(批準號:20210911-06)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 8%O2+92%N2混合氣體(哈爾濱鼎新工業氣體);轉棒疲勞儀(上海欣軟科技有限公司);針灸針(0.25mm×25mm,蘇州醫療用品廠有限公司);熒光顯微鏡(德國leica公司);2135切片機(德國leica公司);DYY-6C電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2.2 試劑 兔抗單克隆抗體NLRP3、Caspase-1及Alexa Fluor594標記的山羊抗兔IgG(北京博奧森生物科技有限公司,批號分別是Bs-10021R、Bs-10743R與Bs-0295G-AP);兔抗單克隆抗體GSDMD-N端(美國Abcam公司,批號ab-215203);TUNEL熒光試劑盒(大連美侖生物科技有限公司,批號MA0223-1)。

1.3 造模方法

采用改良RICE法制備HIBD模型[5]。7 d新生大鼠吸入異氟烷麻醉后,用醫用膠布將其仰臥位固定在手術臺上,頸正中位置剪開皮膚。剝離該切口皮下的軟組織,暴露出左側頸總動脈并分離與其伴行的迷走神經及靜脈,5-0結扎線穿入左頸總動脈的底部做雙重結扎以阻斷血流。在完成結扎后,剪斷兩根結扎線之間的血管,縫合切口,用碘伏對縫合處進行擦拭消毒,解開固定,將新生大鼠放入37 ℃恒溫箱中,休息2 h。隨后將大鼠放置在含8%氧氣和92%氮氣的37 ℃缺氧箱中2 h,在此過程中,缺氧箱的氣體流速保持在0.5 L/min。A組僅行左頸總動脈游離,未作結扎、缺氧處理。模型制備完成后,將新生大鼠放回母鼠籠中,自由飲食水。

1.4 模型評價

參照Longa評分,對制備HIBD模型的新生大鼠進行功能評估[6],評價模型是否成功,具體如下:0分:活動正常,神經功能未缺損;1分:患側的前爪不能充分伸展,呈現輕度缺損狀態;2分:活動時,軀干向患側轉圈,呈現中度缺損狀態;3分:活動時,軀干向患側傾倒,呈現重度缺損狀態;4分:失去意識且不能自主活動。

評定結束后,將1～3分的新生大鼠納入實驗,其他予以剔除。

1.5 干預方式

C組采用于致順的頭穴叢刺法[7],選擇百會及其左、右側各旁開2 mm處(頂區)向前平刺至頂前區,針刺深度約15 mm,捻轉1 min,200 r/min,留針2 h,1次/d。D組進行轉籠轉棒訓練。①轉籠訓練:采用長55 m、直徑45 cm的滾筒裝置,以6 r/min的速度進行訓練,每日訓練10 min。②轉棒訓練:運用轉棒疲勞儀以20 r/min的速度進行訓練,每日訓練10 min。E組在造模完畢后進行頭穴叢刺的基礎上進行康復訓練。其余組不予干預。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 運動功能缺損評分 不同時間點采用網屏實驗對各組大鼠運動功能進行評估[8]。網屏采用40～50 cm網片,網格1 cm×1 cm,除了下側的部分都有木質邊框,把大鼠置于其上。2 s內將網屏翻轉90°呈豎直狀態,并維持5 s。

評分時大鼠的前爪鎖住網線5 s,未脫落為0分;大鼠的前爪暫時鎖住網線,下落一小段距離,但不掉落為1分;大鼠的前爪鎖住網線并留在網屏上5 s為2分;當網屏轉動時,大鼠立即掉下為3分。

1.6.2 神經細胞焦亡的測定 TUNEL+Caspase-1免疫熒光雙染色檢測神經細胞焦亡。在對應的時間點每組取4只大鼠,將大鼠吸入異氟烷進行麻醉。麻醉后把大鼠仰臥位固定,剪開腹部皮膚,將心臟完全露出,進行心臟灌注,直到大鼠的肝臟、肺臟以及四肢出現蒼白僵硬的狀態為止?？焖僭诒蠑囝^取腦,將腦組織完整取出來。用模具從中間切成前后兩部分,將包含有海馬的后半部分用4%多聚甲醛固定后于4 ℃保存。腦組織脫水、包埋制備石蠟切片。切片脫蠟至水,抗原修復,雙氧水、血清封閉后,將Caspase-1(1∶500)滴入切片,將切片置于4 ℃下的濕盒中孵育一夜;按順序添加5 μL的TdT酶、CY3-TSA(1∶500);將50 μL的TUNEL反應液滴于切片上,37 ℃避光培養60 min;DAPI復染細胞核,抗熒光淬滅封片劑封片。顯微鏡下觀察并拍攝4只大鼠海馬區同一位置。計算細胞共表達率(三色重疊細胞/藍色熒光細胞)為細胞焦亡百分率。

1.6.3 Western blot法檢測NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N蛋白 干預結束后每組取4只大鼠,待大鼠在相應時間點吸入異氟烷進行麻醉后,快速斷頭取腦,迅速分離海馬組織。腦組織樣本取出后,置于冷凍管中,將其放入液氮中速凍15～20 s。上述完成后,將冷凍管放于-80 ℃冰箱,等待后續檢測。測定樣品的質量,加入相應體積的裂解液提取腦組織總蛋白,BCA法蛋白定量。用40 μg的蛋白煮沸變性,SDS-PAGE后,在37 ℃下5%的脫脂奶粉下封閉1 h。滴加稀釋I抗(NLRP3∶1∶1 000;Caspase-1∶1 000;GSDMD-N∶1∶2 000)和抗β-actin I抗(1∶1 000),于4 ℃下培養過夜。次日用TBST沖洗5次后,加入羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000),在37 ℃下孵育45 min。清洗后ECL顯影,用凝膠圖像處理系統分析計算目標蛋白質的吸光度,用NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N的吸光度與β-actin的吸光度之比來定量目標蛋白的表達。

1.7 統計學處理

采用SPSS26.0進行分析,采用均值±標準差表示;用單因素方差分析進行多組間比較,用LSD-t檢驗進行兩兩比較;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組運動功能缺損評分

參照網屏實驗,在各個時間點,對5組新生大鼠分別進行運動功能缺損評分。其中,相較于A組,其他4組新生大鼠在各個時間點的網屏實驗評分顯著升高,差異具有統計學意義(P<0.05);相較于B組,各治療組的網屏實驗評分在各個時間點均明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05);在各時間點,E組的網屏實驗評分與C組和D組相比較均降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組新生大鼠網屏實驗評分

2.2 各組海馬區神經細胞焦亡情況

對各組大鼠的海馬區同一位置進行TUNEL+Caspase-1免疫熒光雙染,計算在各個時間點的陽性細胞焦亡率,A組可見少量焦亡細胞;相較于A組,其余4組新生大鼠在各個時間點,焦亡細胞率顯著增加,差異具有統計學意義(P<0.05);相較于B組,各治療組在各個時間點神經細胞焦亡率明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05);相較于C組和D組,E組神經細胞焦亡率顯著降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 新生大鼠海馬區細胞焦亡比較(20×)

表2 各組新生大鼠細胞焦亡的比較

2.3 各組腦組織海馬區NLRP3、Caspase-1及GSDMD-N蛋白表達情況

對各組大鼠的大腦海馬區進行Western blot檢測,觀察在各個時間點NLRP3、Caspase-1及GSDMD-N表達情況,相較于A組,其余各組大鼠在各時間點的NLRP3、Caspase-1及GSDMD-N表達量明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.05);相較于B組,各治療組在各個時間NLRP3、Caspase-1及GSDMD-N表達量明顯減少,差異具有統計學意義;相較于C組和D組,E組的NLRP3、Caspase-1及GSDMD-N表達量在各個時間點顯著減少,差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2～4、表3～5。

圖2 各組新生大鼠NLRP3的表達情況

圖3 各組新生大鼠Caspase-1的表達

圖4 各組新生大鼠GSDMD-N端的表達

表3 各組新生大鼠NLRP3的表達情況

表4 各組新生大鼠Caspase-1的表達情況

表5 各組新生大鼠GSDMD-N的表達情況

3 討論

新生兒缺氧缺血(Hypoxic ischemia,HI)可導致不同程度的腦損傷,未成熟腦組織對HI的刺激尤為敏感[9]。HIBD可引起神經系統后遺癥,如患兒可有運動障礙、發育遲緩、癲癇發作、認知功能障礙及感覺障礙等神經系統的后遺癥[10],在嚴重的情況下可導致死亡。目前,亞低溫治療被認為是在圍產期治療新生兒腦損傷的唯一標準的療法,只有50%的治療是有效的,炎性敏感的HIBD新生兒的效果較差。因此,為減輕發病后新生兒腦損傷程度和功能障礙,降低永久性神經系統損傷發生率,仍然有必要探索新的治療方法。

《靈樞·經脈》載:“人始生,先成精,精成而腦髓生”,闡明了要將腎之精華轉化為髓進而填充大腦才能發揮功能,而腦髓的生成也與脾的精氣息息相關,故中醫學者認為本病病位在腦,其基本病因與先天胎稟不足、肝腎虧虛和臟腑氣血功能失調密切相關,而腦髓損傷等后天因素則進一步促進了本病的發生和發展[11-12]。近年來,中醫對缺血性腦損傷的治法逐漸趨于多樣化,包括針灸、方藥、中醫傳統功法和中西醫結合的綜合療法等。唐強教授通過對各種針灸方法與現代康復技術結合治療缺血性腦損傷的聯合時機、聯合點等問題的理解創新后,提出了“針康同步、動態治療與整體康復”的中西醫結合康復理念,創立了針康法治療技術[13],即在患者頭穴叢刺長留針期間進行康復訓練,以達到最佳的治療效果。

近年來,針康法在臨床缺血性腦損傷的治療中已經展現出較好的療效,可以顯著地改善缺血性腦損傷后遺癥的各種功能異常,從而提升患者的生活質量。前期實驗研究發現[14-17],針康法可以通過促進血管新生、抑制細胞自噬、降低細胞凋亡、調節腸道菌群和減輕腦部炎癥損傷,起到了神經保護的作用。研究發現,細胞焦亡參與了HIBD發生發展的整個過程。而對于針康法是否具有拮抗細胞焦亡作用尚未報道,問題一直處于擱置狀態。為了深化針康法治療HIBD具體的作用機理,于是本課題進行了此次有針對性的研究。

炎癥小體是細胞漿內識別系統參與的組裝多蛋白的復合體,是介導HIBD后中樞神經系統炎癥反應和細胞焦亡的關鍵因素之一[18]。其中,作為炎癥反應核心的NLRP3炎性小體是被研究的最透徹的一種炎性小體。NLRP3作為受體蛋白通過其效應結構域招募ASC,并由ASC的CARD結構域的NLRs募集Caspase-1的前體,從而形成NLRP3炎性小體[19]。NLRP3炎癥小體切割Caspase-1誘導其活化,觸發炎癥因子pro-IL-1β、pro-IL-18各自剪切成IL-1β及IL-18并釋放到胞外發揮促炎作用[20]。在腦缺血缺氧后,會產生大量的活性氧,對細胞結構和線粒體功能造成損害,進而導致脂質過氧化反應增強。損傷的線粒體和殘留的細胞碎片或分解的蛋白質,可引發NLRP3炎癥小體的活化,導致炎癥級聯反應。細胞焦亡是Caspase-1依賴的一種細胞炎性死亡模式[21],這種死亡模式可能會引起機體炎癥級聯反應。經典細胞焦亡途徑主要依靠激活的炎癥小體活化Caspase-1切割GSDMD,促使GSDMD-N端片段與質膜內層結合,形成膜孔并誘導焦亡[22]。NLRP3是觸發細胞焦亡的關鍵蛋白,能夠與 ASC產生相互作用,并募集pro-Caspase-1,再經過上述Caspase-1經典焦亡途徑,將焦亡信號傳遞給下游的焦亡蛋白GSDMD,GSDMD-N打孔從而導致細胞溶脹破裂,釋放出大量的炎性介質,擴大炎癥反應,誘導更多細胞損傷[23]。歐陽昕等[24]發現針刺腦缺血大鼠 “百會”“大椎”“足三里”穴,可降低大腦皮質NLRP3、Caspase-1的表達和IL-1β含量,抑制神經細胞焦亡。此外,楊小惠發現[25]對腦缺血大鼠給予豐富環境刺激干預,發現通過上調缺氧誘導因子-1α的表達可抑制NLRP3炎癥小體激活,進而調控細胞焦亡的發生和發展。綜上,針刺或康復訓練都可抑制腦缺血大鼠抑制NLRP3炎癥小體的激活,從而調控細胞焦亡,促進腦損傷后神經修復。

細胞觸發焦亡時,形態上既有壞死性又有凋亡的特點,其過程類似于凋亡,但也伴隨著核聚集、染色質DNA破碎等病理改變。TUNEL法檢測細胞凋亡和細胞焦亡都呈陽性,而細胞焦亡則是Caspase-1所介導。故當Caspase-1及 TUNEL免疫熒光染色均呈陽性時(核內紅/綠雙陽性),可判定為細胞焦亡[26]。因此,本研究采用此方法對HIBD大鼠腦組織海馬區進行免疫熒光雙染,發現缺氧缺血處理后的大鼠海馬區神經細胞焦亡率增加。此外,各治療組相較于B組細胞焦亡率降低,E組最為顯著。WB檢測發現C組、D組和E組在各時間點與B組相比較, NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N端蛋白的表達水平降低,其中E組的療效最明顯,這與熒光顯微鏡觀察到的結果一致。網屏實驗結果顯示,相較于B組,C組、D組和E組的網屏實驗評分明顯降低,提示針康法能促進HIBD大鼠運動功能恢復。以上結果表明針康法可拮抗NLRP3炎癥小體激活,調控細胞焦亡的發生,從而改善缺氧缺血性腦損傷后運動功能障礙。有研究稱甲基蓮心堿通過抑制NLRP3炎癥小體途徑對HIBD大鼠發揮拮抗細胞焦亡作用[27],與本研究結果一致。但針康法對NLRP3炎癥小體的具體抑制通路及對其他炎性小體的調控機制仍需進一步探索。