基于miR-155/TLR4/NF-κB信號軸探討中醫藥治療RA炎癥的研究*

井維堯,杜小正△,方曉麗,張小娜,何文潔,劉 翠,袁 博

(1.甘肅中醫藥大學,蘭州 730000;2.甘肅中醫藥大學附屬醫院,蘭州 730000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是以關節滑膜炎癥為主要病理特征的自身免疫疾病,發病具有進行性、致殘性的特點,可并發多臟器侵害,嚴重危害人類健康[1]。RA全球發病率約為0.5%～1%,女性發病率高于男性[2]。其具體發病機制尚不明確,持續的滑膜炎癥是導致RA病情發展的最主要因素。臨床給予甲氨蝶呤、來氟米特、糖皮質激素等藥物治療可明顯改善病情,延緩疾病進展,但長期用藥不僅使患者產生耐受,也會對患者的循環系統、消化系統等造成損害[3]。中醫藥治療RA具有一定的優勢,而作用機制不明是目前限制中醫藥發展的難題。

Toll樣受體(toll like receptor,TLR)4/核因子(nuclear factor,NF)-κB是RA炎癥網絡中經典的促炎通路之一,與血管翳、軟骨破壞密切相關,該通路可激活下游信號轉錄白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6[4]、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9[5]等炎癥因子引發炎癥級聯反應及軟骨破壞;并可上調B淋巴細胞瘤(B cell lymphoma, Bcl)-2、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)的表達增加成纖維樣滑膜細胞(fibroblast like synoviocyte,FLS)的侵蝕和遷移能力,導致骨破壞加劇[6],同時還促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達[7],誘導血管翳生成。

小核糖核苷酸(microRNA,miR)-155可提升TLR4/NF-κB活性,且與RA炎癥水平呈正相關[8]。研究表明,中醫藥治療可通過調節miR-155水平[9]及TLR4/NF-κB通路活性[10]減輕RA炎癥反應。整體調節、免疫調控是中醫藥的優勢所在,通過miR-155調節免疫細胞分化及功能將是中醫藥今后的研究熱點。故本文針對以上問題,較全面地總結了miR-155對免疫細胞的調控作用及調節TLR4/NF-κB活性促進RA炎癥的關鍵機制,并基于該信號軸對中醫藥緩解RA炎癥進行述評,為進一步研究提供思路。

1 miR-155可誘導免疫細胞分化,促使RA發病并增加炎癥反應

miRNA約有22個核苷酸大小,由DNA轉錄剪切成初始miRNA后,再經Dicer酶剪切并解體而成。miRNA主要通過裝配成RNA沉默復合體并通過堿基序列配對的方式結合mRNA的3 ’UTR區域來抑制mRNA的翻譯。miR-155位于人類21號染色體B細胞非編碼集合基因簇中的第3個外顯子中,成熟的miR-155的單鏈序列為5 ’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3 ’,miR-155廣泛表達于免疫細胞中,可調控免疫細胞的發育、分化過程,與RA發病相關。

1.1 調節T細胞的分化及免疫耐受

Zhang等[11]研究發現miR-155可調控CD4+T細胞對調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)介導的免疫抑制的敏感性,在Treg介導的免疫耐受過程發揮重要調節作用。此外,miR-155對于Th17細胞的分化也有明顯調控作用,miR-155缺乏的CD4+T細胞中DNA結合蛋白Jarid2表達上調,Jarid2可招募多硫抑制復合物(polycomb repressive complex,Prc)2至染色質中并增加其與H3K27組蛋白的甲基化結合,進而抑制Th17的分化。miR-155亦可通過靶向JAK激酶(janus kinase,JAK)/信號傳導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)通路調節Treg/Th17的平衡,并增加IL-17的產生,促進RA炎癥的發展[12]。相關轉錄因子與miRNA的相互作用是RA患者中Treg/Th17失衡的重要因素,miR-155與smad3、smad4、STAT3等轉錄因子均有密切關系,其表達的升高將抑制Treg分化,加重RA炎癥反應[13]。miR-155高表達的CD4+T細胞則優先分化為Th1細胞,而Th1/Th2細胞的失衡也是介導RA的重要原因之一[14]。

1.2 誘導巨噬細胞分化

巨噬細胞(macrophages,M?)1型有抗感染作用,但比例過高易引起炎癥反應及免疫損傷。miR-155有誘導M1極化、抑制M2極化、促進巨噬細胞炎性反應的功能[15]。研究發現RA患者體內M1型細胞比例高于常人,并可通過誘導破骨細胞分化加重軟骨破壞[16]。Jablonski等[17]發現,M1型巨噬細胞在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)聯合干擾素(interferon,IFN)-γ刺激后,miR-155水平迅速上升并促使M1巨噬細胞分泌大量IL-1β、一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等炎癥因子,而敲除miR-155后,M1對LPS聯合IFN-γ刺激的反應能力下降了72%。骨關節炎研究發現,關節滑膜液中miR-155高表達可誘導M1的極化,并通過靶向半胱天冬氨酸蛋白酶(cysteine-aspartic acid protease,Caspase)-3減少巨噬細胞凋亡,加劇骨關節炎中的骨破壞進程[18]。

1.3 介導樹突狀細胞引發自身免疫反應

miR-155可通過靶向轉錄因子mafb促使單核細胞向樹突狀細胞(dendritic cells,DC)分化,使用miR-155拮抗劑可上調mafb表達,抑制DC細胞分化,miR-155同樣是TNF-α誘導DC形成的關鍵[19]。DC細胞與T細胞的相互作用是自身免疫疾病產生的基礎,Wehr等[20]發現,早期RA患者滑膜組織中DC細胞向T細胞發生聚集。而miR-155可抑制DC細胞內SH2結構域肌醇-5-磷酸酶(SH2 domain-containing inositol 5'-phosphatase,SHIP)1的表達水平,進而影響DC細胞的免疫耐受程度,并增加炎癥因子的產生,而DC內高表達的miR-155可破壞體內自身免疫耐受水平并促進CD8介導的自身免疫反應[21-22]。

1.4 調節B細胞免疫能力

miR-155缺失的小鼠生發中心B細胞數量減少,免疫反應性以及免疫球蛋白抗體G1產生減少,導致免疫功能低下[23]。Alivernini等[24]發現,miR-155在RA患者滑膜組織B細胞中高表達,其通過抑制B細胞中轉錄因子PU.1的表達促使B細胞抗體分泌,可介導自身免疫反應,而抑制miR-155的表達可使PU.1表達上調,并抑制B細胞受體交聯誘導的抗體產生。

臨床研究顯示miR-155與RA患者關節疼痛、腫脹程度及炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-17水平呈正相關[25]。實驗表明,miR-155過表達的RA滑膜組織CD14+細胞可通過靶向抑制SHIP1的水平以上調TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8等促炎因子的表達,并且減少了IL-10等抑炎因子的分泌,使用miR-155抑制劑可顯著減少TNF-α的產生,并可抑制LPS誘導的炎癥反應,而miR-155缺乏的小鼠可抵抗膠原誘導的關節炎癥,對自身免疫反應具有抑制性[21]。

2 TLR4/NF-κB是miR-155加重RA炎癥反應的關鍵通路

TLR4/NF-κB通路是經典的RA炎癥通路之一。而miR-155可通過靶向細胞因子信號傳導抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling, SOCS)1、SHIP1等細胞因子促進該通路激活,介導炎癥反應。

2.1 miR-155靶向SOCS1增加TLR4/NF-κB通路活性

雙熒光素酶報告基因檢測發現miR-155可與SOCS1 3 ’UTR區域結合,實驗發現高表達miR-155小鼠模型中SOCS1的蛋白水平顯著下調,miR-155可靶向SOCS1來促進TLR/NF-κB的激活,增加了IL-6、TNF-α的產生并加重了小鼠肝臟缺血再灌注的炎癥損傷[26]。SOCS1是JAK/STAT信號通路的經典抑制分子,具有抗炎的作用,而JAK/STAT作為細胞炎癥通路之一,其磷酸化的過程可將絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB又稱AKT)、TLR4/NF-κB等信號通路聯系在一起,共同調節炎癥過程。另外,LPS誘導免疫炎癥主要由TLR4信號通路所介導,而研究證實SOCS1缺陷小鼠對LPS的耐受能力下降,并且敲除SOCS1的巨噬細胞在LPS刺激時會引起更多的核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa-B,IκB)磷酸化[27]。相反,強制表達SOCS1可抵抗LPS誘導的NF-κB的核移位,SOCS1有抑制TLR4/NF-κB通路來減輕炎癥反應的作用。相關研究發現SOCS1可與TLR4轉導分子Toll/白介素-1受體(toll/interleukin-1 receptor,TIR)相結合,在TLR4信號通路激活過程中直接起到負調控的作用,轉導分子白細胞介素-1受體相關激酶(interleukin-1 receptor associated kinase,IRAK)也是SOCS1的靶標之一,SOCS1通過SH2結構域與IRAK直接相聯,可抑制IRAK的激活過程[28-29]。SOCS1還可靶向TLR4下游NF-κB P65以抑制其核轉位,并且可通過泛素化作用介導p65的降解,減少炎癥因子的轉錄[30]。綜合研究提示SOCS1可抑制TLR4/NF-κB介導的炎癥反應,而miR-155可靶向SOCS1減少其抑制作用。

2.2 miR-155靶向SHIP1促使NF-κB核移位

miR-155可調控慢性炎癥的發展,使用miR-155海綿可減輕炎癥反應以及NF-κB的活化,miR-155海綿的抗炎機制與其靶點SHIP1有關[31]。O'Connell等[32]發現,巨噬細胞在LPS刺激后SHIP1的表達增加,高表達SHIP1可以阻斷TLR4與髓樣分化因子(myeloid differentiation factor,Myd)88的轉導并抑制多通路的激活以及IκB的降解。雖然SHIP1可阻斷PI3K/AKT通路的活化來抑制炎癥發展,且腫瘤壞死因子相關受體(tumor necrosis factor receptor associated factor,TRAF)6也可通過激活PI3K/AKT信號通路激活核因子κB激酶抑制劑(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK)引起P65核轉移[33],但An[34]等人對LPS刺激的巨噬細胞使用PI3K通路抑制劑LY294002處理,其SHIP1高表達后仍可抑制巨噬細胞炎癥因子產生,且PI3K抑制劑不能顯著阻斷SHIP1對NF-κB磷酸化的抑制作用,證明TLR4/NF-κB通路在SHIP1的抑炎作用中具有關鍵作用。

miR-155靶向SOCS1、SHIP1后,降低了兩種炎癥通路負向調控因子的轉錄,以此增加了TLR4/NF-κB通路活性,加重了RA炎癥反應,見圖1。

圖1 miR-155抑制SHIP1、SOCS1促進TLR4/NF-κB的激活

3 miR-155/TLR4/NF-κB信號軸在中醫藥治療RA中的重要作用

臨床研究提示中藥復方[35]、針灸[36]等治療RA療效明確,可延緩病情發展,減輕炎癥反應。但中醫藥基礎研究薄弱,是阻撓其發展的關鍵,明確中醫藥治療RA的具體分子機制可為中醫藥的發展提供堅實的理論基礎,同時有利于中醫藥成果的轉化。

中藥復方含有多種有效成分,在機體中共同作用,具有多靶點,整體調節的優勢。而miRNA調控網絡有類似于中藥復方調節的特點,或可揭示復方治療RA的關鍵機制。趙晶晶等[37]基于網絡藥理學探討桃紅四物湯治療RA的內在機制,KEGG分析顯示其作用機制與TLR及NF-κB通路密切相關,為經方研究提供了思路。韓隆胤等[38]研究顯示,斷藤益母湯可抑制LPS誘導的RA患者軟骨細胞中IKK、IκBα及NF-κB蛋白的磷酸化,減少IL-6、MMP-9的產生,對軟骨破壞起到保護作用。靖衛霞等[39]探究化瘀通絡方對CIA大鼠滑膜炎癥的改善作用,治療結束后CIA大鼠滑膜病理評分及滑膜微血管記數均有明顯下降,且血清中miR-155、IFN-γ、IL-2水平均有減少,并可增加IL-10、IL-4等抑炎因子的表達。柳慶坤等[40]探究復方追風透骨膠囊對RA大鼠的治療機制,證實其可通過下調miR-155及轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1的水平改善RA大鼠關節炎癥及腫脹程度,但下游機制還需進一步探索。同時,王慧蓮等[41]臨床試驗探究宣痹湯對RA患者的治療作用,患者經治療后紅細胞沉降量(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)水平較前明顯下降,且患者血清血栓素(thromboxane,TX)B2、血小板α-顆粒膜蛋白(α-granule membrane protein,GMP140)、TNF-α、IL-17、IKKβ、NF-κB p65、miR-155等水平均有明顯下調,表明宣痹湯改善RA患者血液高凝狀態的機制與下調miR-155/NF-κB通路有關。

研究發現,黃芪有效成分黃芪甲苷可抑制RA-FLS的增殖活力,并減少IL-6的產生,其機制與下調c-Jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)通路有關[42],而JNK是TLR4/NF-κB通路中重要的蛋白激酶之一,在血管炎癥的研究中,黃芪甲苷可通過抑制TLR4/NF-κB通路緩解炎癥反應[43]。

針灸作為中醫重要組成部分,臨床治療RA安全有效,Meta分析指出艾灸聯合西藥可明顯改善患者癥狀,降低活動度[44]。實驗研究證實艾灸干預RA家兔可降低孤核受體(retinoid relate dorphan receptor,ROR) γt 的mRNA表達,減少IL-17產生,可能對體內Th17/Treg平衡起到調節作用[45]。同樣,使用艾灸干預佐劑性關節炎大鼠可減輕其后肢腫脹程度及滑膜的炎性浸潤,并減少滑膜組織中IL-1、TNF-α的水平;還可減少MyD88、TLR4、NF-κB p65、IkBa mRNA的表達,表明TLR4/NF-κB通路在艾灸抑炎機制中有關鍵作用[46]。朱艷等[47]進一步實驗指出,艾灸大鼠“足三里”“腎俞”等穴位不僅可降低TLR4/NF-κB通路的活性,還可下調miR-155的表達。臨床應用針刺治療RA則可降低患者RF、ESR、CRP水平[48],減輕患者疼痛及膝關節腫脹,針刺機制研究指出激活TLR4受體可能是針灸效應的關鍵啟動過程[49]。還有研究表明電針干預CIA大鼠可下調TLR4/NF-κB通路活性,減輕炎癥反應及足趾腫脹程度,而進一步從轉錄組學角度探究針刺治療的分子機制或可為相關研究提供廣闊的前景[50]。

4 結語與展望

miR-155可調節多種免疫細胞的分化及功能,高表達的miR-155能促進巨噬細胞M1極化、破壞Treg/Th17平衡、誘導B細胞產生自身抗體,故miR-155在誘導RA發病及促進炎癥方面有關鍵作用。而miR-155通過抑制SOCS1及SHIP1的表達促進TLR4/NF-κB通路的激活,放大炎癥反應則是滑膜炎癥持續的關鍵因素。中醫藥治療RA療效顯著,可減輕炎癥反應,內在機制與miR-155/TLR4/NF-κB信號軸活性密切相關。本文通過綜述中醫藥的研究發現,該信號軸在RA及中醫藥中的研究尚不完全,未來可從本信號軸調節免疫細胞分化角度進行探究。此外,NF-κB通路除介導炎癥外還參與氧化應激反應及物質代謝過程,這些與RA均存在密切聯系[51-52],但目前在該方面研究較少。綜上,miR-155/TLR4/NF-κB信號軸具有較大的挖掘價值,可為中醫藥的基礎研究提供新思路。