2012—2022年針灸治療心肌缺血再灌注損傷的動物實驗分析*

劉瓊瓊,嵇 波,葛云鵬,謝亞娜,方 洋,王佳佳,石天宇,劉翼天

(北京中醫藥大學針灸推拿學院,北京 100029)

心血管疾病是導致患者死亡的重要原因之一,其中心肌缺血是引起心血管疾病最常見的原因。長時間心肌缺血缺氧會造成心肌不可逆轉的損傷,影響心功能。隨著現代醫學的進步,通過經皮冠狀動脈支架術、溶栓療法等技術可以恢復心肌血供、降低心肌損傷和病死率。然而,在再灌注過程中心肌細胞產生炎癥反應、脂質過氧化物增加等原因會產生大量自由基,這些自由基攻擊再灌注組織內的細胞,可對心肌造成進一步損傷,甚至導致心律失常等一系列嚴重的臨床后果,稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)。有研究顯示,每年缺血性心臟病患者都在增多,2017年,中國大陸進行了228 938例心臟手術[1]。這些患者在心臟缺血-復流過程中均會產生再灌注損傷,因此MIRI的防治是心血管領域研究的熱點?，F代醫學多使用維生素E、鈉-鈣交換阻斷劑等藥物或缺血預處理的手段防治MIRI。但藥物應用療效不確定,在臨床上尚未完全開展,有待進一步的研究和驗證;預處理也存在缺血現象不可預見、操作不及時等缺點。近年來,針灸治療MIRI的實驗取得了大量成果,但其干預措施、作用效果、治療機制等內容并沒有一個系統的歸納,因此,本文對近10年來針灸防治MIRI的實驗成果進行匯總分析,以期對以后的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 文獻來源

查閱2012年1月1日—2022年6月1日期間中國知網、維普、萬方、CBM、PubMed和Web of Science數據庫發表的文獻。中文檢索詞“心肌缺血再灌注”“再灌注心肌”“針灸”“針刺”“艾灸”“灸”“溫針灸”“電針”“耳針”“頭針”“腹針”,英文檢索詞“Myocardial Reperfusion Injury”“Myocardial Reperfusion Injury”“Injuries, Myocardial Reperfusion”“Myocardial Reperfusion Injuries”“Reperfusion Injuries, Myocardial”“Myocardial Ischemic Reperfusion Injury”“Reperfusion Injury, Myocardial”“Injury, Myocardial Reperfusion”“Acupuncture”“Pharmacopuncture”“electroacupuncture”“Moxibustion”。

1.2 文獻納入標準

研究類型為隨機對照研究的文獻;研究對象為動物模型的文獻;干預措施包括單純針刺、電針、艾灸、溫針灸等穴位刺激方式的文獻。

1.3 文獻排除標準

重復發表的、未獲得全文的或文章內容不全的文獻;綜述、系統評價和meta分析、會議論文;文章數據不明確或統計方法有誤的文獻。

1.4 文獻數據處理

按照上述檢索策略將符合條件的文獻導入EndNote20文獻管理系統,運用軟件剔除重復文獻,然后通過題目和摘要進行初篩,再進一步閱讀全文判斷是否符合納入標準,并提取納入文獻的實驗動物、造模方法、干預組措施、對照組措施和結局指標等相關信息,運用Excel軟件進行總結歸納。

2 結果

2.1 文獻篩選結果

根據檢索策略,檢出中文文獻529篇、英文文獻64篇,剔除重復文獻后剩余中文文獻161篇、英文文獻30篇,通過閱讀文章,最終檢出符合要求的文獻164篇,其中中文文獻138篇,英文文獻26篇。

2.2 年度分布情況

如圖1所示,篩選的文獻數量隨分布年限基本呈上升趨勢,近5年較之前明顯增多且呈波動狀態,2019年達到高峰(n=24),2020年有下降趨勢(n=14),2021年又有回升(n=20)。

圖1 2012年1月1日—2022年6月1日針灸防治MIRI動物實驗的文獻數量變化圖

2.3 納入研究的基本情況

2.3.1 實驗對象的選擇 納入文獻所選用的實驗動物有SD大鼠(n=71)、wistar大鼠(n=66)、C57/BL6小鼠(n=6)、ZDF大鼠(n=2)、新西蘭大耳白兔(n=15)和健康家兔(n=3)。另有一篇文獻中用Stat5-floxed小鼠和Tnnt2-Cre小鼠雜交出Stat5-cKO小鼠,后使用Stat5-floxed小鼠和雜交出的Stat5-cKO小鼠進行試驗[2]。關于實驗動物性別,實驗小鼠多為雄性(n=106),新西蘭大耳白兔多雌雄不限(n=12)。在實驗動物年齡方面,未標明年齡的文獻有105篇;新西蘭大耳白兔多3～4月齡(n=11);SD大鼠年齡最小為3～4周齡,最大為18～24月齡,其余多在2～4月齡之間;wistar大鼠常見42～48日齡(n=6)、3月齡(n=8)。關于實驗動物體質量,新西蘭大耳白兔多為1.5～2.5 kg(n=12);Wistar大鼠大多在180～300 g之間;SD大鼠的體質量最小為50～70 g,最大為500～600 g,其余大多在200～350 g之間,見表1。

表1 近10年針灸防治MIRI動物實驗所用實驗動物品系、性別、年齡、體質量和造模的基本情況

2.3.2 模型制備的方法 判斷造模成功的標準為心電圖和(或)形態學改變[3]:缺血時肢體Ⅱ導聯ST段弓背上抬、T波高聳,再灌注后ST段回落1/2以上;心臟蒼白或紫紺提示心肌缺血形成,再灌注后蒼白或紫紺區變紅提示再灌注成功。納入的文獻中SD大鼠造模常見搭配是缺血40 min再灌注60 min(n=14);其次是缺血30 min再灌注240 min(n=10)和缺血30 min再灌注120 min(n=10)。Wistar大鼠最多的造模方法是缺血20 min再灌注40 min(n=17)。新西蘭大耳白兔常見造模時間為缺血40 min再灌注60 min(n=10),見表1。

2.3.3 針灸干預方案

2.3.3.1 干預措施 針灸對MIRI的干預措施主要有電針、艾灸等,其中電針相關的有149篇,包括普通電針(n=134)、針藥聯合(n=1)、頭針(n=4)和電針艾灸對比(n=10);艾灸相關16篇;其次還有溫針灸(n=2)、穴位埋線(n=2)、單純針刺(n=2)、按法(n=1)、穴位凝膠包埋(n=1)和針刺聯合高壓氧(n=1)。

2.3.3.2 電針參數 電針治療儀主要采用韓氏電針治療儀(HANS-200)、華佗牌SDZ-V或SDZ-Ⅱ電針儀。電針參數的選擇方面,主要采用連續波和疏密波,連續波以2 Hz最多(n=43),疏密波以2/100 Hz最多(n=23)。刺激強度有mA和V兩種單位,其中刺激強度應用最多的是1 mA(n=77);另有25篇文獻沒有具體數據,僅提示以肢體輕微顫抖為準,見表2。

表2 近10年針灸防治MIRI動物實驗中針灸干預方案的分類統計

2.3.3.3 針灸介入時機和持續時間 在針刺介入時機方面,缺血預處理有124篇,缺血后處理有10篇,再灌注即刻及之后處理有8篇。在針刺持續時間方面,最長60 min,最短15 min,其中20 min最多(n=84)。針刺療程方面,最長針刺14 d,最短針刺1次,其中7 d的最多(n=78),見表2。

2.3.4 穴位的選擇 選穴方面,電針選取的單穴大多為內關穴(n=81),頭針全部選取額旁1線(n=4),其余單穴有T4、T5夾脊穴(n=7)、心俞穴(n=3)等。穴位以內關相關的最多(n=31),如內關穴+足三里+關元(n=11)、內關+足三里(n=4)。與內關無關的穴方最多的是神門+通里(n=8)。

艾灸相關文獻中,有每次約5～7次的麥粒灸(n=10)和5 mg/壯的艾炷灸(n=2)。艾灸療程最短為4 d,最長為14 d,最多的療程為5 d(n=6)。艾灸選穴有內關穴(n=13)、內關+間使+足三里+上巨虛(n=1)、足三里+內關+關元(n=1)和膻中+膈俞(n=1),見表2。

2.3.5 對照組干預措施 在MIRI的相關實驗中一篇文獻可以有多個研究內容,研究內容不同對照組也不同。陰性對照有假手術組和(或)正常組(n=164)、模型組(n=164)。機制探索的其他對照組有抑制劑或激動劑組(n=24)、電針+抑制劑或激動劑(n=23)、非穴對照組(n=49)和缺血預處理組(n=13)等,見表3。

表3 近10年針灸防治MIRI動物實驗中對照組干預措施的分類統計

2.3.6 結局指標 結局指標分為一般情況、形態學指標、功能學指標和分子生物學指標。納入文獻中有78篇選用了形態學指標,其中有測量心肌梗死面積(n=48)、觀察心肌細胞組織病理形態改變(n=45)等內容。79篇選用功能學指標,有測量心電圖ST段變化和(或)T波改變(n=44)、心肌細胞凋亡指數(n=29),檢測心功能(n=21)等內容。139篇文獻選用分子生物學指標,包括檢測心肌損傷標志物(n=50),如肌酸激酶(creatine kinase, CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB, CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T, cTnT)等;炎癥反應標志物(n=30),如白細胞介素( interleukin, IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF)-α等;氧化應激標志物(n=35),如活性氧(reactive oxygen species, ROS)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、一氧化氮、熱休克蛋白等;能量代謝指標物(n=19),如線粒體相關如線粒體膜電位/吸光度/完整性、腺苷A1、磁共振氫譜檢測代謝物質等;細胞凋亡相關指標(n=23),如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)相關蛋白表達、死亡因子(factor associated suicide, fas)/死亡因子配體(fas ligand, fasL)相關蛋白表達等;自噬基因相關指標(n=17),如B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)/Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein, Bax)相關蛋白表達、自噬相關蛋白Beclin1等,見表4。

表4 近10年針灸防治MIRI動物實驗中結局指標的分類統計

3 討論

隨著心血管疾病患病率的上升和介入等技術的發展,心肌缺血再灌注損傷的研究也在進一步發展。在長期實驗過程中針刺對MIRI的作用效果被大量證實,目前更多的研究在于探索實驗動物的選擇、合適的干預方案和作用機制。具體內容現論述如下:

3.1 實驗動物的選取

納入文獻的實驗動物多為SD大鼠和wistar大鼠,其中10周齡wistar雄性大鼠的體質量可達280～300 g,10周齡SD雄性大鼠的體質量可達300～400 g,研究選用的SD大鼠普遍比Wistar大鼠重,符合上述規律。另外SD大鼠造模缺血時間多為30或40 min,再灌注時間一般不少于60 min,Wistar大鼠缺血時間多為20或30 min,再灌注時間多小于60 min?？梢钥闯鯳istar大鼠所用造模時間平均少于SD大鼠。這可能是因為Wistar大鼠的體質量普遍比SD大鼠低且應激反應靈敏,另外SD大鼠是由Wistar大鼠培育而成的,適應性和抗病能力更強。研究發現兩種大鼠心房肌細胞中心鈉素即心房利鈉多肽(polypeptide, ANP)的含量不同,釋放方式也有區別,SD大鼠心房特殊顆粒(specific atrial granule, ASG)分為A、B兩型,顆粒平均直徑大于Wistar大鼠,Wistar大鼠未見B型顆粒,顆粒的體密度和數密度大于SD大鼠[4]。ANP的含量與釋放和心房特殊顆粒相關,心肌缺血時ANP釋放,對MIRI有抑制作用[5],因此釋放ANP多的大鼠可能所需造模時間更長?？紤]到時間、資金和成功率的問題,建議使用造模時間相對較少的Wistar大鼠,缺血30 min再灌注40 min,在造模的過程中,改用釣魚絲線固定時用的硅膠太空豆來進行勒線取代縫合線打活結,與此同時線繩下墊橡膠圈,這樣不僅使手術造模的操作更加簡便,造模成功率也提高到90%[6]。

3.2 針灸干預方案

在電針參數選擇方面,研究發現不同頻率作用不同:在鎮痛方面2 Hz可刺激內啡肽和腦啡肽的釋放,100 Hz則刺激強啡肽的釋放,兩種頻率交替的疏密波可刺激三種物質同時釋放[7];神經系統疾病中高頻電針可更有效地減少自由基損害,保護細胞,低頻電針則對神經和肌細胞的再生和修復有優勢;循環系統疾病中高頻電針比低頻電針在減輕應激保護心肌上更有優勢。綜上,高頻電針常用于止痛、鎮靜、緩解肌肉和血管痙攣,低頻電針常用于治療痿證、肌肉韌帶等損傷[8]。本文的納入文獻中,有3篇文獻對電流頻率進行比較,提示總體高頻較低頻有優勢[9-11]。目前研究主要使用低頻,高頻電針相關研究很少,推薦未來研究使用中高頻電針。另外疏密波(n=68)和連續波(n=64)使用次數相近,后續可研究疏密波和持續高頻誰更有優勢。刺激強度方面,有文獻進行了電流強度的對照實驗[12],比較了0.2 mA、1 mA、2 mA、4 mA、6 mA、8 mA電流強度對結果的影響,結論是2 mA的刺激強度對MIRI的預防更有效。但納入的研究中77篇使用1 mA的電流強度,僅6篇使用2 mA,建議未來的研究可以關注不同電流強度的療效差異。

在療程方面,有研究對比針刺7 d和14 d保護作用的差異[13],結果提示差異無統計學意義;兩篇文獻研究艾灸5 d和10 d保護作用的差異[14-15],但結果并不統一,無法得出結論。因此,未來可進行不同針刺時程的療效差異研究,以明確針灸干預的最佳療程,在療效最大化的同時節約成本。

在針灸介入時機方面,大多數的研究為缺血預處理,但由于缺血不可預見,缺血后針灸更具有臨床適用性,因此,近年來缺血后干預也受到了人們重視,有研究對缺血后針刺的干預時相進行了效果對比,比較再灌注前、再灌注即刻和再灌注前后均針刺的效果差異,結果提示再灌注前后均針刺對MIRI損傷的治療效果最好[16-17]。另外,有實驗比較了再灌注后不同時期電針對心肌細胞自噬相關蛋白表達的影響,顯示再灌注0.5 h后電針干預效果最為顯著[18]。但針灸預處理和針灸后處理的療效是否存在差異,尚未有研究報道,未來可進行相關研究,為臨床治療提供理論依據。

綜上所述,電針頻率、刺激強度,針灸療程、介入時機方面都有待進一步優化治療方案,更好地服務臨床。

3.3 穴位的選取

針灸選穴方面,目前的研究多采用單穴治療,尤其以“內關”穴使用頻率最高。內關穴是手厥陰心包經絡穴,《靈樞·邪客》記載“故諸邪之在于心者,皆在于心之包絡”[19],當外邪侵犯心臟時,心包代為受邪,因此心包經穴位是治療心臟疾病時常見的選擇。內關穴為心包經絡穴,研究發現《黃帝內經》等古籍的有效處方中,內關穴為針灸治療心痛使用頻次的第五位[20]?！夺樉拇蟪伞氛f內關“主手中風熱……實則心暴痛,瀉之……”[21],后人更是在《四總穴歌》基礎上增補了“心胸內關謀”的說法[22]。因此內關一直是歷代醫家治療心胸疾病的常用穴位?，F代醫學發現電針內關穴可減少心肌梗死面積,降低再灌注后心電圖ST段電位值和心肌損傷標志物含量,刺激血清腺苷的釋放,對心肌有保護作用[23]。且內關穴在抑制氧化應激、減輕炎癥反應、減輕鈣超載、調節能量代謝和調控相關信號通路方面都有保護作用[24]。且研究表明,內關相較于陽陵泉、曲池等普通穴位效果更好,與夾脊穴的保護作用具有高度的一致性[25-26],因此推薦使用內關穴作為治療穴位。

然而,在臨床實際應用中多使用配穴治療。合理的腧穴配伍能提高針灸的臨床療效,不同腧穴配伍間的差異也一直是基礎針灸學研究的重點。通過對現有文獻的梳理,發現針灸在治療MIRI時配穴方法多樣,主穴常選內關穴,配穴常用足三里、關元、心俞、膻中、神門、通里、間使、夾脊等,另外亦有單獨選用神門與通里相配伍治療者,但不同配穴的療效是否存在差異尚不清楚。有研究發現,本經原絡配穴和相表里經原絡配穴對急性心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護效應存在差異[27]。因此,未來可從影響針灸療效的重要因素——穴位配伍方面,進行不同配穴療效的比較研究,以更好地應用于臨床。

3.4 干預措施的選擇

心肌缺血再灌注損傷屬于“胸痹”病,病機為本虛標實,艾灸溫熱補益,針刺疏通泄實。有研究發現,在下調自噬相關蛋白表達方面[28],電針優于艾灸;而在增強熱休克蛋白表達能力方面艾灸預處理優于電針預處理[29]。因此,后續可進一步研究比較兩者作用機制的不同,在臨床上選出最優方案。Lee等設計實驗探究添加更多的治療方式是否會有更好的治療效果,設置電針組、電針+背俞電針組、電針+背俞+艾灸組,發現三組之間沒有額外的差異,添加幾種治療方法并不一定會增加保護作用[30]。

3.5 機制研究的進展

目前對MIRI的認識主要包含三個方面:①氧自由基的大量產生;②再灌注導致的細胞內鈣離子超載;③白細胞作用和微血管損傷[31]。實際上MIRI是一個復雜的,涉及基因通路、分子、細胞等多層次多因素交互作用的過程,很難明確將其機制嚴格歸類。劉丹勇等[32]將MIRI的機制總結為氧化應激、細胞內鈣超載、能量代謝障礙、細胞凋亡、內質網應激、自噬、焦亡、鐵死亡、程序性壞死。楊麗華等[33]人認為線粒體功能障礙可引起鈣超載、活性氧生成及線粒體膜通透性增加等問題,最終導致細胞凋亡。白樺[34]則解釋了MIRI炎癥反應的動態變化,將缺血心肌的恢復分為急性促炎期和抗炎恢復期,促炎反應會導致兩個階段之間的平衡和轉化的紊亂,加重心肌損傷。另外還有從神經系統釋放的單胺類物質入手MIRI與腦相關的研究[35],結果顯示電針可通過“大腦邊緣-下丘腦-自主神經系統”調節心臟功能?？梢?針灸的作用是多靶點的,期待后續能發現新的角度研究MIRI機制,最終使MIRI的預防或治療有一套統一全面的評價方式。

4 結語

綜上所述,本文對近10年來針灸治療MIRI動物實驗研究文獻從實驗動物選取、造模、干預措施、對照組、結局指標和研究內容等方面進行分析總結,肯定了針灸對MIRI的效果,建議今后注重針灸干預方案、穴位的選擇及不同針灸干預措施對MIRI保護效應的影響,并進一步探討針灸的作用機制,以闡釋針灸的作用原理,優選針灸治療方案,最終指導臨床,提高臨床療效。