基于網絡藥理學與實驗驗證探討通脈顆粒治療缺血性腦卒中的作用機制*

苗 青,王瑞海,李玉波,劉麗梅

(中國中醫科學院中醫基礎理論研究所,北京 100700)

腦卒中是由于腦血管破裂出血和腦血管堵塞影響腦部供血,從而引起腦組織損傷的急性腦血管疾病,是我國成人致死、致殘的首位病因[1-2]。缺血性腦卒中(ischemic stroke, IS)為腦卒中的主要亞型,近30年來IS的年齡標準化發病率增加了34.7%,且仍呈現出持續上升的趨勢[3]。目前,IS的臨床治療多集中在溶栓和神經保護方面,受時間窗較窄、作用靶點單一等問題的影響,治療藥物仍然有限。方劑具有多成分、多靶點、多途徑的作用特點,其與西藥聯合應用在治療IS中突顯獨特優勢,目前備受關注。

通脈顆粒最早收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》第四冊[4],之后轉為國家藥品標準,由丹參、川芎、葛根3味藥以1:1:1的比例配伍組成,具有活血通脈的功效。臨床研究發現,通脈顆粒聯合尿激酶溶栓治療后,臨床總有效率從69.5%提高到94.59%,神經功能缺損評分由(14.86±5.45)分降低到(11.42±4.97)分[5]。這表明通脈顆粒與溶栓藥物合用,可顯著增強患者的溶栓治療效果,有效恢復腦部神經功能,明顯改善患者預后。目前,關于通脈顆粒治療IS作用機制的研究較少,有必要作進一步的系統分析。因此,本研究將通過網絡藥理學分析挖掘通脈顆粒治療IS的潛在作用靶點和通路,并對其進行動物實驗驗證。本研究可為今后指導通脈顆粒臨床用藥和進一步開發提供科學依據。

1 網絡藥理學分析

1.1 通脈顆粒潛在活性成分及作用靶點篩選

在TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和TCMIP數據庫(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)中檢索丹參、川芎、葛根3味中藥的化學成分,根據口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18,并結合《中華人民共和國藥典》2020年版[6]及文獻[7-18]補充完善各味中藥的化學成分,去除重復后,篩選出通脈顆粒的潛在活性成分。同時,通過TCMSP數據庫和TCMIP數據庫查詢潛在活性成分的作用靶點,應用UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)以物種為“Homo sapiens”將靶點名字規范化,剔除非人源、不規范的靶點。

1.2 缺血性腦卒中相關靶點篩選

以“ischemic stroke”“cerebral ischemia”“stroke”等為關鍵詞,在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、Drugbank數據庫(https://go.drugbank.com /drugs)、TTD數據庫(https://db.idrblab.net/ttd/)和OMIM數據庫(https://www.omim.org/)收集缺血性腦卒中的相關靶點。其中,GeneCards數據庫中選取Score大于中位數的目標靶點作為IS靶點。采用Uniprot數據庫對收集的靶點進行靶點-人類基因名轉換,去除重復靶點后,構建IS疾病靶點數據庫。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction, PPI)網絡建構及核心靶點預測

將通脈顆粒的預測作用靶點與IS相關靶點導入VENNY 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖,得到藥物與疾病的交集靶點。將交集靶點上傳至STRING 11.5(https://string-db.org/),設置物種為“Homo sapiens”,靶點間最小相互作用閾值設置為medium confidence(0.400)。將結果導入Cytoscape 3.8構建PPI網絡并依據Degree、Betweenness、Closeness進行拓撲分析,以Degree≥2倍中位數并結合Betweenness、Closeness均大于等于中位數為標準篩選核心靶點。

1.4 通脈顆粒治療IS靶點的富集分析

將上述獲得的交集靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/),設置物種為“Homo sapiens”,進行GO富集分析和KEGG富集分析。富集分析結果依據Pvalue<0.05進行篩選、排序,并使用微生信軟件(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化。

2 動物實驗

2.1 動物

SD雄性大鼠,體質量(200±10)g,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司,動物許可證號SCXK(京)2019-0010。實驗前大鼠適應性喂養1周,飼養條件為自然晝夜節律光照,溫度22～25 ℃,相對濕度40%～50%,自由飲水進食。本實驗已通過中國中醫科學院中醫基礎理論研究所實驗動物倫理委員會審查批準,批件編號:IBTCMCACMS21-2211-01。

2.2 主要試藥與儀器

通脈顆粒(神威藥業集團有限公司,批號:22021021);陽性對照藥腦心通膠囊(陜西步長制藥有限公司,批號:211169);白細胞介素(interleukin, IL)-6試劑盒、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor , TNF)-α試劑盒、IL-4試劑盒、IL-10試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司,貨號:20230101-RX302856R、20230101-RX302058R、20230101-RX302858R、20230101-RX302880R);Iba-1抗體(英國Abcam公司,貨號:ab178847)。3K15型高速冷凍離心機(德國Sigma公司);U-LH100HG型電子顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司);FLx800TM型熒光發光酶標儀(美國Bio Tek公司);KZ-Ⅱ勻漿儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

2.3 造模、分組與給藥

大鼠適應性喂養1周后,采用大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)法復制IS模型[19]。依據Longa評分法[20]對各組大鼠進行神經功能評分。0分-正常,無神經損害的癥狀;1分-不能伸展腦缺血對側的前肢;2分-向缺血對側轉圈;3分-向缺血對側傾倒;4分-不能自發行走,意識喪失。選擇分值在1～3分的30只大鼠,隨機分為5組:模型組、陽性對照組(腦心通膠囊)、通脈顆粒低劑量組(1.35 g/kg)、通脈顆粒中劑量組(2.7 g/kg)和通脈顆粒高劑量組(5.4 g/kg),另取6只正常大鼠作為假手術組。各給藥組大鼠給予相應的藥物灌胃7 d,假手術組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃。

2.4 神經功能缺損評分

末次給藥后,參照Longa評分法對各組大鼠進行神經功能缺損評分。

2.5 腦組織病理學觀察

對各組大鼠進行神經功能評分后,分別取腦,4%多聚甲醛固定。將固定好的腦組織進行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色后,進行腦組織皮層病理學觀察。

2.6 免疫熒光染色

將4%多聚甲醛固定的大鼠腦組織包埋,制備4 μm冠狀切片。腦切片經室溫下Triton X-100破膜、山羊血清封閉后,滴加一抗,即Iba-1抗體(1:200),4 ℃孵育過夜;次日加入二抗于37 ℃下避光孵育;4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)封片,于熒光顯微鏡下觀察皮層小膠質細胞的表達情況并采集圖像。

2.7 炎癥因子檢測

按照ELISA試劑盒說明書,分別檢測各組大鼠腦組織皮層IL-6、TNF-α、IL-4和IL-10水平。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 通脈顆粒治療缺血性腦卒中的靶點預測結果

通過檢索TCMSP數據庫和TCMIP數據庫進行OB、DL篩選,并結合《中華人民共和國藥典》2020年版及文獻報道,補充丹參、川芎、葛根中不符合篩選標準的其他活性較強的成分,如表1所示,最終獲得87個通脈顆粒的潛在活性成分(丹參64個,川芎12個,葛根11個),360個作用靶點[21]。將GeneCards數據庫、Drugbank數據庫、TTD數據庫和OMIM數據庫檢索結果合并,獲得IS相關靶點649個。將通脈顆粒的預測作用靶點與IS相關靶點進行映射,如圖1所示,得到115個交集靶點。

圖1 通脈顆粒治療缺血性腦卒中的潛在靶點韋恩圖

表1 通脈顆粒的潛在活性成分

3.2 PPI網絡的構建與分析結果

將通脈顆粒的預測作用靶點與IS相關靶點的115個交集靶點導入STRING 11.5,獲得蛋白質間的相互作用關系。去除無連接節點,共得到關鍵節點115個和575條邊。將結果導入Cytoscape軟件構建PPI網絡,根據拓撲分析以Degree≥116,并結合Betweenness≥3.92×10-3、Closeness≥0.49,篩選出排列前5的關鍵靶點,分別為IL-6、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT(serine/threonine-protein kinase AKT, AKT)1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、β-肌動蛋白(beta-actin, ACTB)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor A, VEGFA),推測這些靶點可能是通脈顆粒作用于IS的關鍵靶點。并以此推出相對應的有效化學成分,構建藥物-潛在活性成分-作用靶點網絡圖,見圖2。

圖2 通脈顆粒治療缺血性腦卒中的藥物-潛在活性成分-作用靶點網絡圖

3.3 富集分析結果

GO富集分析共得到851個條目,其中包含660個生物過程(biological process, BP)、83個細胞組分(cell component, CC)、108個分子功能(molecular function, MF),分別選取前10條使用微生信軟件進行可視化,結果如圖3所示,BP主要涉及對外來生物刺激反應(response to xenobiotic stimulus)、對缺氧反應(response to hypoxia)、對脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)、血管新生(angiogenesis)、負調控凋亡過程(negative regulation of apoptotic process)等生物過程,CC主要涉及質膜(plasma membrane)、細胞外空間(extracellular space)、細胞表面(cell surface)、內質網腔(endoplasmic reticulum lumen)、突觸(synapse)等細胞組分,MF主要涉及酶結合(enzyme binding)、蛋白結合(protein binding)、電壓門控鈣通道活性(voltage-gated calcium channel activity)、轉錄因子結合(transcription factor binding)、細胞因子活性(cytokine activity)等分子功能。

圖3 GO功能富集分析結果

KEGG富集分析共得到161條通路,選取前20條使用微生信軟件進行可視化,結果如圖4所示,通脈顆粒作用于缺血性腦卒中的作用機制可能與Calcium信號通路、Fluid shear stress and atherosclerosis、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT(phosphatidylinositide 3-kinases-serine/threonine-protein kinase AKT, PI3K-Akt)信號通路、TNF信號通路等有關。

圖4 KEGG富集分析結果

3.4 通脈顆粒對IS大鼠神經功能評分的影響

如圖5所示,末次給藥后,對各組大鼠進行神經功能評分發現,假手術組大鼠未見神經功能損傷;模型組大鼠均表現出嚴重的神經功能損傷癥狀(P<0.05),如左側肢體無力,行走時身體向左側偏斜或旋轉,甚至不能自發行走,提尾懸空時左前肢屈曲;與模型組比較,各給藥組大鼠活動增多,神經功能明顯改善,各組大鼠神經功能評分均不同程度降低(P<0.05),特別是通脈顆粒中、高劑量組,表明通脈顆?？蓽p輕IS大鼠的神經功能損傷。

注:與假手術組比較*P<0.01;與模型組比較#P<0.05,##P<0.01圖5 通脈顆粒對各組大鼠神經功能評分的影響

3.5 通脈顆粒對IS大鼠腦組織病理變化的影響

如圖6所示,假手術組大鼠腦組織皮層細胞形態規則、排列整齊,未見炎性細胞浸潤和水腫;模型組大鼠可見明顯梗死灶,細胞排列疏松紊亂,細胞核固縮深染,細胞質呈空泡化,伴有小膠質細胞增生和炎性細胞浸潤;與模型組比較,各給藥組大鼠腦組織梗死灶明顯縮小,其中通脈顆粒高劑量組大鼠腦組織細胞排列相對整齊,細胞核較清晰,水腫和炎性細胞浸潤明顯減少。

A.假手術組;B.模型組;C.陽性對照組;D.低劑量組;E.中劑量組;F.高劑量組圖6 通脈顆粒對缺血性腦卒中大鼠腦組織病理變化的影響(HE ×100)

3.6 通脈顆粒對IS大鼠腦組織小膠質細胞的影響

如圖7所示,假手術組大鼠皮層小膠質細胞呈靜息狀態,胞體較小、分支較長;模型組大鼠小膠質細胞大多胞體變大,表面突起變短,呈典型的阿米巴狀,表明小膠質細胞極化程度變高,多數細胞趨向于轉化為M1型小膠質細胞,不同濃度的通脈顆粒處理后,M1型小膠質細胞減少,阿米巴狀變化出現一定改善,表明通脈顆?？梢种菩∧z質細胞極化。

圖7 通脈顆粒對缺血性腦卒中大鼠腦組織Iba1表達的影響(×100)

3.7 通脈顆粒對IS大鼠腦組織皮層中炎癥因子的影響

如圖8所示,與假手術組比較,模型組大鼠腦組織中IL-6和TNF-α表達顯著升高(P<0.01),IL-4和IL-10表達顯著降低(P<0.01);與模型組比較,通脈顆粒中、高劑量組大鼠腦組織中IL-6和TNF-α表達均顯著降低(P<0.05),IL-4、IL-10的表達均顯著升高(P<0.05)。

注:與假手術組比較*P<0.01;與模型組比較#P<0.05,##P<0.01;白細胞介素(IL),腫瘤壞死因子(TNF)圖8 通脈顆粒對各組大鼠腦組織炎癥因子表達水平的影響

4 討論

通脈顆粒主要適應證為缺血性心腦血管疾病,主要針對經絡之氣虛血瘀證而立,已批準上市并應用于臨床20余年。方中丹參為活血化瘀藥之首,專行脈絡閉塞,為君藥[22];川芎行氣活血,氣行則血行,助君藥活血化瘀,為臣藥[23];葛根升舉清陽,通經活絡,配伍丹參能增強祛瘀生新之力,配伍川芎則補而不滯[24]。丹參為血藥,川芎為血中氣藥,葛根為氣藥,三藥合用共奏益氣活血、化瘀通絡之功,并根據各自的功效特點分別對應不同癥狀或病因,在不同環節相輔相成,活血、行氣、升陽,以達到氣行血和、活血通脈之效[25]。

本研究中采用MCAO法復制IS大鼠模型,造模后大鼠表現出嚴重的神經功能損傷;給予通脈顆粒干預后,大鼠神經功能損傷減輕,提示通脈顆?？擅黠@改善IS大鼠神經功能。為進一步系統分析通脈顆粒治療IS的作用機制,本研究采用網絡藥理學分析初步篩選出通脈顆粒作用于IS的關鍵靶點IL-6、AKT1、TNF、ACTB、VEGFA,發現可能的作用機制與MAPK、PI3K-Akt、TNF、IL-17等信號通路有關。臨床研究發現,IS患者預后不良與炎癥標志物水平升高密切相關[26],故網絡藥理學結果提示通脈顆粒治療IS的作用機制可能與其抑制炎癥反應密切相關。

炎癥反應是腦缺血后繼發性腦損傷的關鍵因素,減輕炎癥損傷是改善IS預后的關鍵。腦缺血發生后,腦內的免疫細胞被迅速激活,刺激中樞神經系統并釋放趨化因子,招募外周的中性粒細胞、淋巴細胞向受損的腦組織遷移,合成分泌一系列炎性細胞因子,加劇炎癥反應,進一步引起神經元受損,加重神經功能損傷[27-28]。小膠質細胞是中樞神經系統固有的免疫細胞,參與IS的病理生理過程,是抵御腦損傷的第一道防線[29]。腦缺血發生后,小膠質細胞被迅速活化,分為促炎型M1和抗炎型M2兩種表型。M1型小膠質細胞具有吞噬、殺滅病原體的功能,但同時產生大量TNF-α、IL-6等促炎因子引起炎癥反應,加重神經功能損傷;M2型小膠質細胞主要產生IL-4、IL-10等,抑制炎癥反應并促進組織修復[30-32]。由此可見,小膠質細胞對IS具有雙重調節作用,以不同的表型調節中樞神經系統的穩態。本研究發現,假手術組小膠質細胞呈胞體小、分支長的狀態,模型組小膠質細胞胞體變大、分支變短,呈阿米巴樣,表明小膠質細胞被激活,并趨向于M1型極化;通脈顆粒干預后,小膠質細胞形態發生改變,阿米巴狀變化有一定改善。同時,本研究對炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-4和IL-10的表達水平進行檢測,結果發現通脈顆?？娠@著降低大鼠腦組織中IL-6、TNF-α的表達水平,顯著升高IL-4和IL-10的表達水平,進一步驗證了通脈顆?？筛淖冃∧z質細胞的活化狀態,減輕腦組織炎癥反應,有助于改善神經功能損傷;同時,動物實驗的結果與網絡藥理學預測的通脈顆粒治療IS的關鍵靶點包括IL-6、TNF-α相一致。

綜上所述,采用網絡藥理學對通脈顆粒治療IS的作用機制進行了系統研究,并通過動物實驗驗證了通脈顆?？梢种蒲装Y因子的表達,改善神經功能損傷,其作用機制可能與調控小膠質細胞介導的炎癥反應相關。研究結果為今后指導通脈顆粒臨床用藥和進一步開發提供了科學依據與實驗支撐。但本研究仍存在一定的局限性,后續將對通脈顆粒干預后小膠質細胞的表型進行深入分析,為本研究的預測結果提供更加嚴謹的實驗數據。