小膠質細胞PTGS2/Hepcidin炎癥通路在神經元鐵死亡中的作用機制

楊曉玲，何宗源，章琦鑫，王魚浩，李雪蓮，段曉霞

1.西南醫科大學附屬醫院麻醉科（瀘州646000）；2.麻醉與重癥醫學瀘州市重點實驗室（瀘州646000）；3.西南醫科大學麻醉學系（瀘州 646000）

鐵死亡（ferroptosis）是一種由活性氧（reactive oxygen species，ROS）和游離鐵驅動的調節性非凋亡性細胞死亡形式，其主要特征包括線粒體功能失調和脂質過氧化等[1-2]。神經元鐵死亡參與多種病理生理狀態下的神經退行性改變進程，介導認知功能障礙等多種癥狀發展。在衰老過程中，鐵蛋白功能失調導致神經元Fe2+積累，增加細胞發生鐵死亡的風險[3-4]。既往的研究提示，小膠質細胞可能是神經炎癥過程中神經元鐵代謝的重要參與者[5-8]，但神經炎癥是否促進鐵死亡目前尚不清楚。

小膠質細胞源于中胚層，是中樞神經系統的主要免疫細胞，能對各種病理生理刺激做出反應[9]，是調節中樞神經系統疾病最合適的靶點[10]。在靜息狀態下，小膠質細胞呈現梭形或橢圓形，有數條樹枝樣突起。而在衰老[11]、手術麻醉[12]和神經退行性疾病[13]過程中，小膠質細胞可發生極化激活，胞體變大呈現阿米巴樣，誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達水平顯著上升，導致ROS和促炎細胞因子爆發性釋放[14]，在神經炎癥的發生發展中起重要作用[15]。此外脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理的小膠質細胞將顯著增加共培養條件神經元細胞的鐵含量[6]，腹腔注射LPS 可破壞小鼠中樞神經系統鐵穩態，促進神經元發生鐵死亡，并最終損害認知功能[16-17]，提示神經元處于炎癥條件下，可以增加其對鐵死亡誘導劑的易感性。

炎癥條件下鐵穩態的主要調節者是鐵調素（hepcidin），通過完全阻斷鐵外排途徑以抑制鐵運輸，被認為是全身鐵穩態的主要調節器[18]。hepcidin 表達增加可誘導SH-SY5Y 細胞內鐵輸出蛋白（ferroportin1，FPN1）的內化，并增加二價金屬轉運蛋白1（recombinant divalent metal transporter1，DMT1），鐵蛋白重鏈（ferritin heavy chain，FTH）和線粒體鐵蛋白（mitochondrial ferritin，FTMT）的水平，抑制細胞內鐵輸出，增加鐵蓄積，擾亂神經元鐵穩態[5]。前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxidesynthase2，PTGS2）是 病 理情況下合成前列腺素的關鍵基因，被認為是鐵死亡的標志物之一[19]，并參與炎癥級聯反應，增加TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子的釋放[20]，增強STAT3 磷酸化[21]，而p-STAT3 易位到細胞核中，促進hepcidin 基因（HAMP）的表達[7]。塞來昔布等選擇性PTGS2 抑制劑可以抑制炎癥級聯反應，改善神經退行性改變所導致的認知功能損傷。然而小膠質細胞PTGS2能否通過調節hepcidin影響神經元鐵代謝進而調節神經元鐵死亡，目前仍不清楚。本研究旨在通過體外實驗，運用BV2、HT22細胞探討小膠質細胞PTGS2/hepcidin炎癥軸對神經元鐵死亡的作用機制與影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

組織鐵測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國），TNF-α、IL-1β Elisa 檢測試劑盒及MTT 試劑盒（索萊寶科技有限公司，中國），高糖DMEM 培養基以及胎牛血清（Gibco，美國），LPS（From Escherichia coli 055:B5，索萊寶科技有限公司，中國）。BCA 試劑盒（碧云天生物技術有限公司，中國）。

1.2 細胞培養

BV2 的培養：BV2 細胞在含有10% FBS、1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM普通高糖培養基中進行培養，24 h換液一次，待細胞處于對數生長期，進行后續實驗。

HT22的培養：HT22細胞在含有10%FBS、1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM 普通高糖培養基中培養，24 h換液一次，待細胞處于對數生長期，進行后續實驗。

塞來昔布預處理BV2 細胞：將BV2 細胞接種于100 mm 培養皿，至匯合度達30%左右，以2.5 μmol/L 塞來昔布預處理24 h后，進行后續實驗。

1.3 實驗分組

待BV2 小膠質細胞進入對數生長期后，將其分為模型組（CELE 組、CELE+LPS 組和LPS 組）與對照組（Control 組），Control 組繼續常規培養，CELE 組和CELE+LPS組加入2.5 μmol/L塞來昔布，LPS組加入等體積完全培養基。24 h后換液，LPS組和CELE+LPS組給予LPS（100 ng/mL）孵育12 h。收集各組培養液上清，以1∶1比例與完全培養基混合培養對應各組HT22細胞24 h。

1.4 MTT法檢測細胞活性

建模完成后BV-2、HT22細胞每孔加入10 μL MTT溶液，孵育4 h，棄去上清，每孔加入110 μL Formazan溶解液，充分溶解后在490 nm處測定吸光度，即A490值。細胞存活率=（A490 實驗組-A490 空白組）/（A490 對照組-A490空白組）×100%。

1.5 PTGS2、IBA-1、STAT3、p-STAT3蛋白檢測

Western blotting 法檢測目標蛋白。建模完成后，收集BV-2、HT22細胞，使用RIPA裂解液充分裂解，11 000×g離心10 min后收集上層清液作為樣品，使用BCA法測定細胞蛋白含量，使用濃度為5%的上層膠和濃度為10%的下層膠進行SDS-PAGE凝膠電泳。濕法轉膜、5%脫脂牛奶封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參。洗膜3 次，加入二抗37 ℃孵育2 h，洗膜3次，保存于TBST 中。使用ECL 化學發光法顯影。

1.6 GPX4、FTH1、DMT1、PTGS2 mRNA 相對表達量測定

實時熒光定量PCR 法檢測。建模完成后，收集BV-2、HT22 細胞，使用Trizol 試劑提取細胞總RNA。將RNA反轉錄為cDNA后立即進行實時熒光定量PCR檢測。根據試劑盒說明書制備20 μL 反應體系。同一樣品設置3 個重復孔，GAPDH 為內參基因。使用到的基因特異性引物序列見表1所示。使用三步法進行擴增反應，具體條件為：95 ℃預變性120 s，95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸10 s，40 個循環后72 ℃延伸10 min。

表1 目的基因特異性引物序列Table 1 Primer Sequences of Target Genes

1.7 TNF-α、IL-1β含量檢測

上述各組細胞建模完成后，收集各組BV2及HT22細胞培養上清及細胞，酶標板洗板后加入標準品及樣品，置于37 ℃孵育90 min，加生物素化抗體37 ℃孵育60 min。加入TMB 顯色后測定吸光度A450，繪制標準曲線并根據樣本吸光度計算各組TNF-α、IL-1β含量。

1.8 ROS含量檢測

配置濃度為10 μmol/L 的2，7-二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFHDA）熒光探針孵育細胞20 min。使用激光共聚焦顯微鏡直接觀察?；厥占毎⑹褂貌缓宓募毎囵B液清洗細胞3次，充分去除細胞外的DCFH-DA。熒光酶標儀激發波長設置為488 nm，發射波長設置為525 nm檢測熒光的強度。以對照組計算各組相對ROS含量。

1.9 細胞內鐵水平的檢測

采用比色法，各組細胞處理完成后，收集并使用PBS重懸BV-2、HT22細胞，超聲破碎后，2 500×g離心10 min，收集上清液，加入檢測試劑后，沸水浴5 min，測量各組樣品在波長520 nm的吸光度，即A520。

采用比色法檢測細胞內鐵水平。各組細胞處理完成后，收集并使用PBS 重懸BV-2、HT22 細胞。超聲破碎后，2 500×g 離心10 min，收集上清液，使用BCA 法檢測細胞蛋白濃度。加入鐵檢測試劑后，沸水浴5 min，測量各組樣品在波長520 nm 的吸光度，即A520。使用公式計算細胞內鐵含量：鐵含量（mg/g）=（A 實驗組-A空白組）/（A標準組-A空白組）×C標準（mg/L）/帶測定樣本蛋白濃度（g/L）。

1.10 統計學分析

使用Graphpadprism 9.0 進行統計分析并繪制統計圖表。所有研究數據均使用均數± 標準差（x ± s）表示，多個組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Sidak檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS、塞來昔布對BV2細胞活力的影響

4 個組BV2 細胞活力比較差異具有統計學意義（F=633.5，P＜0.001）。與對照組相比，LPS 處理組其BV2 小膠質細胞活力比值為0.87 ± 0.04，明顯降低（P＜0.001）。塞來昔布（CELE，25 μmol/L）單獨處理的BV2細胞活力比值為0.98±0.02，不能引起小膠質細胞活力明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。CELE+LPS 組細胞活力比值為0.85 ± 0.06，CELE 可在一定程度改善LPS 導致的BV2 小膠質細胞活力下降（P＜0.001），見圖1。

圖1 BV2細胞活力檢測結果（n=5）Figure 1 Viability of BV2 Cells（n=5）

2.2 LPS、塞來昔布對BV2細胞活化的影響

Western blotting 檢測結果顯示，與對照組比較，LPS 組BV2 細胞Iba-1 及PTGS2 蛋白表達顯著上升（P＜0.001）。與LPS 組相比，CELE+LPS 組BV2 細胞Iba-1 及PTGS2 蛋白表達下降（P＜0.001，P ＜0.05），見圖2。

圖2 BV2細胞IBA-1，PTGS2蛋白水平比較（n=3）Figure 2 Protein expression level of IBA-1 and PTGS2 in BV2 Cells（n=3）

2.3 LPS、塞來昔布對BV2細胞炎癥因子的影響

Elisa結果顯示，與對照組細胞相比，LPS組BV2細胞TNF-α、IL-1β表達水平顯著升高（P＜0.001）。CELE組無顯著變化（P＞0.05）。與LPS組相比，CELE+LPS組TNF-α、IL-1β表達水平顯著下降（P＜0.001），見表2。

表2 各組BV2細胞上清液炎癥因子含量比較（n=5，）Table 2 Inflammatory factors in BV2 cell supernatant（n=5，）

表2 各組BV2細胞上清液炎癥因子含量比較（n=5，）Table 2 Inflammatory factors in BV2 cell supernatant（n=5，）

注：a 表示Control 組與LPS 組比較，P ＜0.001。b 表示Control組與CELE+LPS組比較，P ＜0.001。

2.4 炎癥暴露對HT22細胞活力的影響

收集各組BV2細胞上層清液用于培養對應組小鼠海馬神經元系HT22細胞。結果顯示：4個組HT22細胞活力比較差異具有統計學意義（F=303.4，P＜0.001）。與對照組相比，LPS 組HT22 細胞活力比值為0.80 ±0.05，明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.001）。CELE組HT22細胞活力比值為0.96±0.04，神經元細胞活力未出現明顯變化（P＞0.05）。CELE+LPS組細胞活力比值為0.90±0.06，神經元細胞活力顯著下降（P＜0.001），但與LPS組相比，細胞活力下降程度明顯減輕，差異具有統計學意義（P ＜0.001），見圖3。

圖3 HT22細胞活力檢測結果（n=5）Figure 3 Viability of HT22 Cells（n=5）

2.5 炎癥暴露對HT22細胞鐵死亡影響

檢測各組HT22細胞鐵死亡相關指標。qPCR結果顯示LPS 組PTGS2、DMT1、FTH1 mRNA 水平升高（P＜0.001，P=0.005，P＜0.001），GPX4 mRNA 表達下調（P=0.002），氧化應激ROS 水平升高（P＜0.001）。CELE組HT22細胞各指標未見顯著差異。與LPS組相比，qPCR 結果 顯 示CELE+LPS 組PTGS2、DMT1、FTH1mRNA 水 平 降 低（P=0.015，P=0.026，P=0.003），GPX4 mRNA表達上調（P=0.037），ROS水平降低（P＜0.001），見圖4、圖5。

圖4 HT22細胞GPX4、FTH1、DMT1、PTGS2 mRNA表達情況（n=3）Figure 4 mRNA expression levels of GPX4，FTH1，DMT1 and PTGS2 in HT22 cells（n=3）

圖5 各組HT22細胞ROS熒光檢測（n=3）Figure 5 ROS detection of HT22 cells（n=3）

2.6 BV2細胞PTGS2對HT22細胞鐵穩態影響

4個組HT22細胞鐵含量比較差異具有統計學意義（F=88.84，P＜0.001）。與對照組比較，LPS組HT22細胞內鐵水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.001）。與LPS 組相比，CELE+LPS 組細胞內鐵水平顯著降低（P＜0.001），見圖6。提示神經炎癥參與神經元鐵穩態失衡，而抑制小膠質細胞PTGS2 將改善鐵穩態失衡。Western blotting 檢測結果顯示：與對照組比較，LPS 組HT22 細胞hepcidin、p-STAT3 顯著上調（P=0.005，P＜0.001），FPN1顯著下調（P＜0.001），總STAT3無顯著差異；CELE組hepcidin、p-STAT3無顯著差異（P＞0.05）。與LPS 組比較，CELE+LPS 組HT22 細胞hepcidin、p-STAT3 顯著下調（P＜0.001，P=0.005），FPN1 上調（P＜0.001），總STAT3無顯著差異（P＞0.05），見圖7。

圖6 HT22細胞Fe2+含量（n=3）Figure 6 Fe2+levels in HT22 cells（n=3）

圖7 HT22細胞蛋白表達情況（n=3）Figure 7 Protein expression levels in HT22 cells（n=3）

3 討論

神經退行性改變常導致認知能力下降等后果，極大降低人們的社會參與度和生活幸福感，增加社會和家庭的經濟負擔。神經炎癥是研究較為廣泛的神經退行性疾病防治靶點[22]，在神經退行性疾病中，廣泛存在的神經炎癥與神經元鐵死亡的聯系[23-24]。目前研究多認可神經炎癥與神經元鐵穩態呈雙向調節，但大多集中在鐵超載誘發氧化應激，促進小膠質細胞活化等方面[25-26]。本課題組研究結果顯示：小膠質細胞PTGS2導致神經元鐵穩態失衡，進而促進神經炎癥條件下的神經元鐵死亡。

本研究首先建立了LPS誘導BV2的小膠質細胞神經炎癥模型。BV2 細胞是常用的小膠質細胞模型，其高度純化且基本具備了原代小膠質細胞的形態及功能，是一種相對容易培養的永生化小膠質細胞系。實驗中常用LPS 誘導BV2 細胞活化進行神經炎癥的建模[27-28]。與既往報道一致，本實驗結果證明，LPS 導致BV2小膠質細胞活化，產生大量炎癥因子，而BV2細胞活力并未明顯降低，證實LPS 誘導的神經炎癥模型適宜進行下一步研究。

塞來昔布是選擇性PTGS2 抑制劑，能迅速穿過血腦屏障，到達中樞神經系統發揮PTGS2抑制效應、減少小膠質細胞活化和炎癥因子釋放[29]。我們使用LPS和塞來昔布構建了神經炎癥模型和PTGS2抑制的神經炎癥下調模型。塞來昔布是PTGS2 的活性抑制劑，本身不直接減少PTGS2 的表達量，然而我們觀察到PTGS2在塞來昔布+LPS處理后的BV2細胞中表達下降，這提示在BV2 細胞中，極有可能存在神經炎癥的正反饋途徑。

使用上述模型的培養基上清液干預HT22 神經元細胞。與細胞凋亡、自噬和焦亡不同的是，鐵死亡是新近發現的氧化應激依賴性的程序性細胞死亡，由鐵積累導致脂質過氧化引起[1]。因此，我們檢測了氧化應激指標ROS、GSH、SOD和脂質過氧化指標MDA。結果顯示LPS組神經元鐵死亡增加，而CELE+LPS組神經元鐵死亡減少，這提示神經炎癥促進神經元鐵死亡發生，而通過塞來昔布抑制PTGS2后，神經炎癥減輕，神經元鐵死亡隨之降低。

為了探索神經元鐵死亡的機制，進一步檢測了鐵代謝相關蛋白hepcidin 和FPN1。結果提示，神經炎癥可促進hepcidin 蛋白的表達，抑制FPN 表達。hepcidin是一種抗菌肽，主要由肝臟在鐵超載和炎癥的條件下合成分泌，也廣泛分布于不同的腦區，包括皮層、嗅球、丘腦、下丘腦及海馬等區域，hepcidin 與FPN1 結合，完全阻斷鐵外排途徑以抑制鐵運輸[30]。hepcidin 受到磷酸化STAT3調節[31]，因此，繼續探索神經炎癥對STAT3磷酸化的影響。Western blotting 檢測結果顯示，STAT3總量不受影響，然而神經炎癥提升STAT3磷酸化水平，即p-STAT3 增加，PTGS2 抑制劑塞來昔布可以降低STAT3的磷酸化水平。

本研究也存在一些不足，首先本研究僅在細胞水平探討了BV2小膠質細胞與神經元鐵死亡的關系。機體環境復雜，受到多種體內外因素調控，因此在活體動物層面的繼續深入研究有助于進一步揭示小膠質細胞在神經元鐵死亡中的作用機制。本研究設計上也存在一定缺陷，使用LPS 誘導BV2 細胞產生炎癥因子以干預HT22 細胞，但LPS 對HT22 細胞的潛在影響不能完全排除。因此，尋找合適的分離技術去除LPS 或增加實驗對照的方式將更好的指導未來進行深入的研究。

4 結論與啟示

在神經炎癥條件下，小膠質細胞活化促進神經元鐵死亡，可能與小膠質細胞PTGS2 通過增加STAT3 磷酸化影響神經元hepcidin 表達有關，造成神經元鐵蓄積，導致神經元鐵死亡。抑制PTGS2 可能是治療神經退行性改變的潛在靶點，有待更充分、更深入的研究探討和最終實現臨床轉化。