基于Nrf-2通路探討蛭龍活血通瘀膠囊對腦出血大鼠氧化應激損傷的機制

梁俊杰，楊 燕，劉天助，徐厚平，劉 平，張 蕾，劉孟楠，楊思進，

1.西南醫科大學附屬中醫醫院心血管內科（瀘州646000）；2.西南醫科大學附屬中醫醫院神經內科（瀘州646000）；3.西南醫科大學附屬中醫醫院，國家中醫臨床研究基地（瀘州 646000）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種有極高致死率及致殘率的全球性疾病，占所有卒中類型的10%～20%[1]。在我國，腦出血患者3月致殘率及致死率可達40.4%～59.5%，1年致殘率及致死率同樣高達38.9%～63.9%[2]。損傷機制包括出血直接損傷腦組織和繼發性腦損傷（secondary brain injury，SBI）。其中繼發性腦損傷包括血腦屏障破壞，血紅蛋白誘導的鐵超負荷，興奮性毒性，神經炎癥激活，氧化應激和神經細胞死亡/凋亡等病理生理過程[3-4]。氧化應激是一種因自由基和活性氧及其代謝物增加或抗氧化機制減弱而引起炎癥反應的一種體內氧化與抗氧化失衡的狀態[5]，是腦出血繼發性損傷的重要部分。目前西醫治療以清除血腫、促使腦組織修復、防止再出血、控制血壓及降低顱內壓為主要手段[6]。研究表明，中西醫結合治療腦出血能更大程度恢復神經功能缺損，降低遠期致死率及致殘率[7]。

腦出血中醫稱為出血性中風，其關鍵病機為“陰陽失調，氣血逆亂，上泛于腦”。蛭龍活血通瘀膠囊（簡稱蛭龍膠囊）就是基于玄府理論，由楊思進教授團隊研發，用以防治心腦系統疾病的中藥制劑，具有益氣活血、化瘀通絡之效[8]，能補元氣，通血脈，開玄府，調升降[9]。前期研究表明蛭龍膠囊有調節血脂[10]、抗動脈粥樣硬化[11-12]、抗炎[10，13]、保護血管內皮[13-14]、抑制心室重構[15]、減輕血腦屏障損傷等作用[16-18]，在治療腦出血時，能通過抗炎、延緩細胞凋亡、調控水通道蛋白表達等途徑改善血腦屏障、保護腦神經、減輕腦水腫[19-22]。氧化應激損傷是腦出血后繼發性腦損傷的重要組成部分，核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2）信號通路是抗氧化應激損傷的重要通路，但蛭龍膠囊對于腦出血后氧化應激損傷是否有治療作用尚未見相關研究。因此本研究擬觀察蛭龍膠囊治療腦出血模型大鼠神經功能缺損情況，檢測腦組織中丙二酫（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等氧化應激相關指標以及腦組織內Nrf-2、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、醌氧化還原酶-1（quinone oxidoreductase-1，NQO-1）的蛋白表達水平，以探討蛭龍膠囊通過Nrf-2通路對腦出血的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物制備

蛭龍膠囊由黃芪、大血藤、桂枝、水蛭、地龍五味中藥材采取蛭龍膠囊新工藝[23]制備而成。制備方法：水蛭、地龍采用乙醇進行浸泡提取，制備濾液備用；水蛭、地龍制備后的藥物殘渣同黃芪、大血藤、桂枝采用水煎煮提取，共煎2 次，混合所得煎液；將乙醇提取濾液與水煎提取煎液混合并過濾。對混合后藥液進行減壓濃縮，得到浸膏，采用糊精為母核，沸騰制粒，粉碎成粉，裝成膠囊即得。批準文號：川藥字Z20070528，規格0.4 g×48 粒/瓶，由西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室提供。

1.2 實驗動物

清潔級3月齡雄性健康SD大鼠45只（250±20 g），由西南醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2018-17，經適應性喂養，飲食、飲水正常、無不良反應者，納入實驗。本研究經西南醫科大學動物實驗倫理中心審批（編號：20211111-002）。

1.3 實驗藥物、試劑及儀器

藥物：蛭龍膠囊（0.4 g/粒，西南醫科大學附屬中醫院制劑室）。試劑：BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0009，Beyotime），DAB 試劑盒（ZLI-9018，北京中杉金橋生物有限公司），HO-1 抗體大鼠兔克隆抗體（ab85309，Abcam），NQO-1 抗體大鼠兔克隆抗體（A19586，Abclonal），Nrf-2抗體大鼠兔克隆抗體（A1244，Abclonal），β-actin 抗體大鼠兔克隆抗體（AC026，Abclonal），生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（S0001，affinity），二抗兔克隆抗體（GB23303，Servicebio），總蛋白（TP）測定試劑盒（A045-2，南京建成生物工程研究所），超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（A001-3，南京建成生物工程研究所），丙二醛（MDA）測定試劑盒（A003-1，南京建成生物工程研究所），谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（A006-1-1，南京建成生物工程研究所）。儀器：電泳儀（JY200C，北京君意東方電泳設備有限公司），酶標儀（Spectra MAX Plus384，美谷分子儀器有限公司），UV752N 紫外可見分光光度計（UV752N，上海佑科儀器儀表有限公司），化學發光凝膠成像儀（5200，上海天能科技有限公司），數碼三目攝像顯微攝像系統（BA400 Digital，麥克奧迪實業集團有限公司）。

1.4 動物模型的建立和分組

腦出血模型造模采用自體血注入法：造模前大鼠禁食8 h后稱重，以戊巴比妥鈉麻醉（40 mg/kg），待麻醉成功，暴露大鼠顱頂，備皮常規消毒后，大鼠以俯臥位固定于腦立體定位儀上，取前囟點中線，靠右側旁開3.0 mm，沿矢狀面向后1.5 mm，牙科鉆鉆透顱骨，深度至硬腦膜，不傷及腦實質。鼠尾消毒后，于尾根部抽取大鼠自體血約100 μL。于顱骨骨孔方向，垂直進針約5 mm，緩慢注入100 μL自體血液，注血時間10 min，后留針15 min。骨蠟封閉顱骨骨孔，經逐層縫合后，頭皮消毒。其中Sham組只穿刺，不注血。

分組及給藥：將大鼠編號后按照隨機數字表法分為Sham組，ICH組，ZL組，每組各15只。ICH模型評定方式采用Longa 評分評定，分值介于1 至3 分的記作造模成功，Sham組大鼠造模后無神經功能損傷體征記為造模成功，造模成功者計入實驗，造模失敗者予以相應補充。造模成功后，ZL 組以蛭龍膠囊（1 g·kg-1·d-1），溶解于0.9%生理鹽水中，連續灌胃7 d，Sham 組及ICH組大鼠給予等劑量生理鹽水灌胃7 d。

1.5 水迷宮實驗檢測神經功能

水迷宮實驗于喂養第3 d開始適應性訓練，為期4 d，每天進行4 次，每次間隔2 h。將大鼠面向池壁放入水池中游泳2 min，記錄爬上平臺時間，記為逃避潛伏期，若2 min內大鼠未爬上平臺，則逃避潛伏期記為120 s；實驗2 min內爬上平臺次數記為穿越平臺次數。第7 d進行正式實驗，實驗步驟同適應性實驗，記錄各組大鼠的逃避潛伏期及穿越平臺次數。

1.6 免疫組化染色觀察大鼠腦組織Nrf-2表達情況

處死各組大鼠，留取腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋、切為4 μm厚切片，經二甲苯脫蠟及不同濃度乙醇水化后，浸入檸檬酸鹽緩沖液中處理30 min，PBS 漂洗3 次后用3%的過氧化氫溶液于室溫處理10 min，隨后PBS清洗3次，每次5 min。滴加山羊血清封閉液，室溫20 min；滴加一抗（Nrf-2，Abclonal，1:50稀釋），4 ℃過夜；PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗（兔克隆抗體，Servicebio，1:100稀釋），37 ℃孵育30 min；PBS洗3次，每次5 min；經DAB顯色、蘇木素復染、返藍、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下每張切片隨機選取3個高倍鏡視野（×400）觀察計數，以細胞出現棕色染色為Nrf-2 陽性細胞，取陽性細胞比率進行統計學分析。顯微攝像系統對切片進行圖像采集，使用Halo 數據分析系統計算每張圖像陽性面積占比。

1.7 Elisa 檢測大鼠腦皮質組織相關氧化應激指標含量

給藥7 d 后處死大鼠，經心尖取血1 mL，取大鼠腦皮質組織，ELISA法檢測血清、腦皮質組織SOD活性及MDA、GSH含量，具體步驟依據如下：處死大鼠后，經心尖取血1 mL，3 000 r/min 離心10 min，取上清液待檢；腦組織分離灶周2 mm 組織，經過清洗、稱重、搗碎后，制備組織勻漿，離心，取上清液備用。標準品充分蕩勻并稀釋，蒸餾水50 倍稀釋制備洗滌緩沖液，同時全部溶液充分搖勻備用，96 孔板檢測，標準品和樣品均采用復孔。稀釋后的標本置入50 反應孔內添加50 μL稀釋好的標準品和50 μL樣品，迅速滴入50 μL生物素標記抗體。覆膜后振蕩均勻，室溫放置3 h。清除孔內液后以洗滌液填充搖勻30 s，用吸水紙吸干洗滌液，重復洗滌3 次。每個反應孔內分別加入兩組試劑各50 μL，充分混合，在37°C 溫度中溫育20 min，同時避光，取下酶標板，將終止液快速加入，每孔50 μL，完成后迅速使用酶標儀于450 nm 波長處檢測每個反應孔的OD值。制作曲線，以橫坐標（X）表示檢測物質標準品濃度，縱坐標（Y）表示吸光度OD 值。根據OD 值由標準曲線換算待測蛋白分子含量濃度。

1.8 Western Blot檢測大鼠腦海馬組織

Nrf-2、HO-1、NQO-1 蛋白質表達：取大鼠海馬腦組織，加入RIPA裂解液，4 ℃下制備組織勻漿。BCA試劑盒測定蛋白濃度，根據所測蛋白濃度計算上樣體積。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，PVDF 轉膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加一抗Nrf-2（1:1 000）、HO-1（1:1 000）、NQO-1（1:2 000）及β-actin（1:50 000）4 ℃孵育過夜，用TBST 將PVDF 膜洗3 次，每次5 min。第2 d加二抗室溫孵育3 h，用TBST洗PVDF 膜3次，每次10 min。用天能GIS 機箱控制軟件V2.0對條帶進行曝光掃描，Image J軟件對光密度值進行分析，檢測Nrf-2、HO-1、NQO-1 蛋白表達水平，以β-actin 為內參比較，得出各蛋白表達水平。

1.9 統計學分析

應用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計，計量數據以平均數±標準差（）表示，多樣本均數間比較采用One-Way ANOVA 檢驗，兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 蛭龍膠囊對腦出血大鼠神經功能的影響

與Sham組比較，ICH及ZL組大鼠的逃避潛伏期升高，穿越平臺次數降低（P＜0.05）。ZL組的逃避潛伏期低于ICH 組，穿越平臺次數高于ICH 組（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠水迷宮實驗結果比較（）Table1 Comparison of water maze test results of rats in each group（）

表1 各組大鼠水迷宮實驗結果比較（）Table1 Comparison of water maze test results of rats in each group（）

注：a 表示 與Sham 組 比較，P ＜0.05；b 表示與ICH 組相比，P ＜0.05。

2.2 蛭龍膠囊對腦出血大鼠腦組織細胞Nrf-2 蛋白免疫組化染色的影響

陰性染色細胞核為藍色，Nrf-2 陽性表達為棕黃色。Sham組大鼠腦組織神經細胞有序排列、整體組織致密，僅有較少組織疏松和Nrf-2 蛋白染色；ICH 組神經細胞整體排列疏松，散在Nrf-2 蛋白染色的陽性細胞；ZL組神經細胞排列較為致密，可見散在疏松、空泡，及大量陽性染色細胞，見圖1。與Sham組相比，ICH組大鼠腦組織Nrf-2蛋白表達增加，但差異無統計學意義（P＞0.05），ZL組大鼠腦組織Nrf-2蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與ICH組相比，ZL組大鼠腦組織Nrf-2蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

圖1 蛭龍膠囊對大鼠腦組織Nrf-2蛋白免疫組化染色的影響Figure 1 Effects of Zhilong capsule on immunohistochemical staining of Nrf-2 protein in rat brain tissues

表2 大鼠腦組織Nrf-2免疫組化染色陽性面積占比（）Table 2 Proportion of positive area of Nrf-2 immunohistochemical staining in rat brain tissues（）

表2 大鼠腦組織Nrf-2免疫組化染色陽性面積占比（）Table 2 Proportion of positive area of Nrf-2 immunohistochemical staining in rat brain tissues（）

注：a 表 示與Sham 組相 比，P ＜0.01；b 表示與ICH 組 相比，P ＜0.05。

2.3 蛭龍膠囊對腦出血大鼠血清及腦皮質組織的SOD活性及MDA、GSH含量的影響

與Sham組比較，ICH組及ZL組腦出血大鼠大腦皮質中MAD 含量上升（P＜0.01），SOD 活性和GSH 的含量下降（P＜0.05）。與ICH 組比較，ZL 組皮質中MDA含量下降（P＜0.01），SOD 活性、GSH 含量上升（P＜0.05）。與Sham 組比較，ICH 組及ZL 組腦出血大鼠血清中MDA 的含量上升（P＜0.01），SOD 活性和GSH 含量下降（P＜0.05）。與ICH 組比較，ZL 組血清中MDA含量下降（P＜0.01），SOD 活性、GSH 含量上升（P＜0.01），見表3。

表3 各組大鼠腦組織及血清氧化應激指標（）Table 3 Oxidative stress index of brain tissue and serum of rats in each group（）

表3 各組大鼠腦組織及血清氧化應激指標（）Table 3 Oxidative stress index of brain tissue and serum of rats in each group（）

注：a表示與Sham組相比，P ＜0.01；b表示與ICH組相比，P ＜0.05。

2.4 蛭龍膠囊對腦出血大鼠腦海馬組織氧化應激指標的蛋白表達的影響

各組大鼠腦海馬組織指標比較：與Sham 組相比，其余兩組腦出血大鼠氧化應激指標Nrf-2、NQO-1、HO-1 的蛋白表達均有明顯上升（P＜0.05）；與ICH 組相比，ZL 組的Nrf-2、NQO-1、HO-1 蛋白表達水平更高（P＜0.05），見表4、圖2。

圖2 蛭龍膠囊對大鼠ICH模型腦海馬組織Nrf-2及相關蛋白表達的影響Figure 2 Effects of Zhilong capsule on expression of Nrf-2 and related proteins in hippocampus of rats with ICH model

表4 大鼠腦海馬組織Nrf-2、HO-1、NQO-1蛋白的表達（）Table 4 Expression of Nrf-2，HO-1 and NQO-1 proteins in hippocampus of rats（）

表4 大鼠腦海馬組織Nrf-2、HO-1、NQO-1蛋白的表達（）Table 4 Expression of Nrf-2，HO-1 and NQO-1 proteins in hippocampus of rats（）

注：a表示與Sham組相比，P ＜0.05；b表示與ICH組相比，P ＜0.05。

3 討論

腦出血屬于傳統醫學中的“中風”病，近代又提出了“出血性中風”的病名。楊思進教授總結歷史各大醫家理論并結合自身多年臨床經驗，提出“瘀血毒水、玄府閉塞”為其基本病機[24]，根據“血不利則為水”“離經之血便為瘀”等中醫經典理論[25]創立了“開玄啟閉”治療心腦血管疾病的方法。蛭龍膠囊是楊思進教授團隊在玄府理論基礎上研究而成，全方以黃芪為君，大補肺脾之元氣，兼有利水之功，《神農本草經》中謂其治“大風癩疾”；《神農本草經》中謂水蛭能逐惡血，瘀血，利水道[26]，用水蛭一則能逐其瘀血，二則能通利水邪；地龍一可通血絡，二可開玄府；大血藤則助水蛭、地龍活血通絡，三者共為臣藥。桂枝為使藥，助君藥黃芪一使元氣上入腦府，二使瘀血濁毒下行二腑；與水蛭、地龍、大血藤同用，辛溫助其行，增強諸藥通絡開玄之功。全方配伍精當，藥簡力宏，有益氣活血、化瘀通絡之功。腦出血后的SBI 機制以繼發性腦缺血、炎癥反應、氧化應激損傷、凝血酶的毒性作用、神經細胞的自噬和凋亡[3]等為主，這與中醫出血性中風后產生的瘀、血、毒、水等病理產物導致[27]的損傷有共通性。氧化應激反應與炎癥反應、神經細胞凋亡等SBI 機制緊密相關，是腦出血繼發性損傷的重要部分。

在腦組織損傷后，紅細胞的裂解及毒性產物的產生能誘導自由基與某些分子相互作用形成活性自由基，從而對機體造成損傷。機體自身的抗氧化防御系統可以通過抗氧化劑的產生而抵抗損傷?？寡趸瘎┠芘c自由基相互作用，通過保護機體的重要分子阻斷相關級聯反應。腦出血后血腫形成，血液內紅細胞裂解，血管損傷，炎癥反應等均能廣泛產生微血管超氧自由基。這些超氧自由基主要由羥基自由基、超氧陰離子、過氧化氫等構成。ROS能在生理狀態下作為部分信號通路的轉導因子，高濃度的ROS 則能對脂質和蛋白產生氧化反應，這些氧化反應會破壞細胞結構完整，損壞信號轉導通路，影響線粒體能量代謝，甚至導致DNA的損毀而造成細胞死亡[5，28]。清除超氧自由基可降低創傷后超氧自由基水平，防止微血管自我調節功能的喪失，減少細胞結構損毀及死亡[29]。Nrf-2是抗氧化應激的經典通路的激活蛋白，其相關通路激活后有治療心、腦、腎、肝、神經系統相關損傷，抗衰老，抗癌等臨床作用[30]。相關研究表明腦出血后Nrf-2 蛋白的激活能有效減少腦出血后的繼發性腦損傷[31]。當抑制Nrf-2表達后，腦出血模型大鼠死亡率升高，神經功能缺損加重，炎性產物增加，抗氧化相關蛋白（HO-1、NQO-1）表達減少[32]。本研究中，ZL 組大鼠腦組織免疫組化切片可見較其他組更多的Nrf-2 蛋白陽性表達，表明Nrf-2相關通路激活。NQO-1、HO-1 均為Nrf-2 的下游靶蛋白，ZL組大鼠腦海馬組織NQO-1、HO-1蛋白表達量增加，表示Nrf-2/HO-1 通路激活，發揮其對神經系統的保護作用。HO-1 蛋白是腦出血后抗氧化應激的重要蛋白，有研究表明其能反映ICH 急性期的腦組織水腫及神經功能損傷程度[33]。腦出血后血紅蛋白的裂解能產生一系列氧自由基，促使細胞凋亡及壞死[34]。而HO-1蛋白的表達能對抗細胞凋亡及產生的壞死因子，將血紅蛋白轉化為鐵、一氧化碳和膽紅素[35]，以減少血紅蛋白與自由氧結合，進而減輕血管內皮細胞和大腦膠質細胞受到的氧化損傷。同時HO-1 蛋白還能激活相關抗氧化應激因子（過氧化氫酶、谷胱甘肽），清除MDA 等氧化產物起到抗氧化作用[36]。MDA 是氧化應激產生的下游產物，是一種細胞毒性物質，腦出血后的氧化應激過程中，會產生大量MDA，其通過誘發神經細胞凋亡及消耗抗氧化物質從而加重腦組織損傷[37]。ZL組腦組織及血清中MDA含量均較ICH組減少，表明蛭龍膠囊能減少氧化應激毒性產物產生。SOD、GSH是抗氧化應激的重要分子，能清除自由基及阻斷其后續的脂質過氧化反應和細胞損傷[37]，從而保護神經細胞及其功能。ZL組、ICH組較Sham組的血清及腦組織有更高的SOD、GSH含量，表明腦出血后機體自身抗氧化應激機制的激活，ZL 組抗氧化應激因子含量較ICH組更高，表明蛭龍膠囊能增加腦出血大鼠抗氧化應激因子的生成。ZL組血清中毒性產物及抗氧化因子含量均高于大腦皮質，與中醫理論的瘀血毒水致病理論有一定共通性，為后續外周血清檢測相關氧化指標及臨床治療提供一定實驗依據。

蛭龍活血通瘀膠囊由黃芪、水蛭、地龍、桂枝、大血藤五味中藥制成?，F代藥理研究表明，黃芪能抗衰老、抗腫瘤、抗氧化、調節免疫[38]；水蛭能抗凝血、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤[39]；桂枝有抗炎、抗病毒、抗腫瘤和抗菌等作用[40]；大血藤能抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、調節免疫[41]；地龍能降壓、抗腫瘤、增強免疫、抗炎、抗纖溶[42]。而ICH 后炎性反應、氧化應激損傷是神經功能進行性損害的主要原因[43]。ICH 后大量血細胞破裂導致凝血相關毒性物質生成，是氧化應激和炎癥反應的重要誘因，活化的小膠質細胞，浸潤后的白細胞及巨噬細胞等分泌的促炎因子也會導致炎癥反應產生和加重[44]。腦出血后氧自由基產生會激活大量炎癥細胞并伴隨炎性因子如TNF（tumor necrosis factor）、IL-1β（interleukin-1β）的釋放，這些炎癥因子也能產生各種自由基，從而加重氧化應激損傷[45]。炎癥細胞活化浸潤，大量的炎癥因子、趨化因子生成，過量的炎癥因子可活化NF-κB（nuclear factor kappa-B）信號通路。而NF-κB 信號通路的活化可抑制Nrf-2 相關的抗氧化應激途徑，進而加重氧化應激損傷[46]。結合現代藥理研究，蛭龍膠囊中的藥物有效成分可能通過抗炎、抗氧化應激、抗凝血相關毒性物質等多途徑起到對腦出血的治療作用。

4 結論

蛭龍活血通瘀膠囊能明顯提高Nrf-2 相關蛋白的表達，增加血清及腦組織中抗氧化因子含量，降低毒性產物含量，減輕腦出血后氧化應激損傷，進而改善神經功能缺損。其機制可能是通過激活Nrf-2 相關信號通路來完成，但具體分子機制還需進一步驗證。