苦瓜果實不同發育時期細胞壁組分及相關酶活性的差異分析

裘波音, 林琿, 張前榮, 李永平, 溫慶放, 朱海生, 李大忠

苦瓜果實不同發育時期細胞壁組分及相關酶活性的差異分析

裘波音, 林琿, 張前榮, 李永平, 溫慶放, 朱海生*, 李大忠*

(福建省農業科學院作物研究所，福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室，福建省蔬菜工程技術研究中心, 福州 350013)

為了解苦瓜()果實品質差異的原因，以厚肉型種質‘LX1-3’和薄肉型種質‘ZK54’為材料，對果實發育過程中細胞壁組分含量及相關酶活性進行了分析。結果表明，花后17 d，‘LX1-3’果實的橫徑(FD)、腔徑(FLD)、果肉厚度(PT)、單瓜鮮質量(FFW)和干質量(FDW)均超過‘ZK54’。細胞壁組分和酶活性表現品種間差異，水溶性果膠含量整體水平表現為厚肉型高于薄肉型，且與PT、FFW和FDW呈顯著正相關；花后17～23 d ‘LX1-3’的半纖維素(HCE)和纖維素(CE)含量均高于‘ZK54’；花后3 d，兩種質的-半乳糖苷酶(-Gal)和-木糖苷酶(-Xyl)活性顯著高于其他3個時期，多聚半乳糖醛酸酶(PG)、-Gal和果膠酶變化趨勢與離子型果膠和共價型果膠含量的變化一致。-Gal、-Xyl和纖維素酶活性與5個生長性狀間呈極顯著/顯著負相關，PG與FD、FLD和PT呈極顯著/顯著負相關。因此，細胞壁組分和酶活性與果實發育密切相關，-Xyl和-Gal在苦瓜早期發育中發揮主要效應，而HCE和CE對果實中后期發育影響較大。

苦瓜；果實；發育；細胞壁組分；酶活性

苦瓜()為葫蘆科(Cucurbitaceae)苦瓜屬植物，營養價值高，降血糖效果突出，是亞洲和非洲部分地區重要的蔬菜和藥用植物[1–2]。關于苦瓜品質的研究目前主要集中在營養成分和風味物質解析等方面[3–6]，對于其它品質因子及形成原因的關注相對較少。作為重要的質地品質，果肉厚、瓤腔厚等性狀對苦瓜的經濟價值起關鍵作用, 其形成和變化受細胞大小、形態等微觀因素的影響甚大[7]。植物細胞的外層結構為細胞壁，在維持細胞形態、控制細胞繁殖、抵御外力損傷等方面有較大作用[8]。細胞壁主要包括果膠、纖維素(cellulose, CE)、半纖維素(hemicellulose, HCE)及少量蛋白質和礦物質等成分，其合成、轉移、水解等過程需要多種細胞壁相關酶的參與和協同調控。因此研究苦瓜果實發育過程中細胞壁物質及相關酶活性變化規律，對探討苦瓜果實品質差異具有重要的指導意義。

細胞壁的結構與成分因物種、組織、細胞類型的不同而表現差異。研究表明，共價型果膠(covalent pectin，CSP)、HCE和CE含量降低可能是梨()[9]和藍莓()[10]、山楂()[11]、木瓜()[12]、杏()[13]和樹莓()[14]等果實后期成熟軟化的重要因素。但也有研究表明，紅肉枇杷()水溶性果膠(water soluble pectin, WSP)含量隨生長過程逐漸增加，而白肉枇杷的WSP含量呈先下降后快速上升趨勢，2個品種的CSP含量在發育過程中均表現早期增加后期減少的動態規律，但離子型果膠(ionic pectin, ISP)含量變化呈無規則狀態[15]；隨著果實生長發育，加工型橄欖() ‘長營’的HCE含量逐漸增大，而鮮食型橄欖“清欖1號”則逐漸減少[16]；梨的CE含量的變化趨勢沒有什么規律，甚至發育后期含量較前期更高[17]，這些說明細胞壁組分與果實成熟的關系不能一概而論。

細胞壁組分的變化大多需要果膠酶(pectinase, PE)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)、-半乳糖苷酶(-galactosidase,-Gal)、-木糖苷酶(- xylosidase,-Xyl)、纖維素酶(cellulase, Cx)等代謝酶的催化，從而引起胞間層逐漸降解，導致相鄰細胞失去連接而彼此分離[18]。早期研究表明，PE參與低溫貯藏期間獼猴桃()的快速軟化[19]，是果實品控的關鍵因子；PG在果實成熟的后期起作用，可能與蘋果的多汁性有關[20]；-Gal能降解植物組織初生細胞壁中的果膠和半纖維素，降低細胞壁組分穩定性[21]，但乙烯利處理可以顯著抑制-Gal活性，延緩番茄()軟化[22]；-Xyl可水解半纖維素核心成分木聚糖, 在香蕉()的成熟軟化[23]、鴛鴦茉莉()和擬南芥()花色素苷的降解[24]等過程中發揮重要作用，其活性隨番茄和藍莓的成熟逐漸降低[25–26]；Cx活性隨桃()的成熟而顯著增加，并促進果膠酶催化果膠質的分解，導致細胞壁結構松散，最終導致桃細胞壁多糖的降解[27]。目前，關于細胞壁組分及相關酶活性在苦瓜果實生長發育過程中的作用研究尚未見報道。本研究以不同果肉厚度苦瓜(厚肉型‘LX1- 3’和薄肉型‘ZK54’)為材料，探討不同發育時期的果實性狀、細胞壁物質含量及相關酶活性的變化，分析種質間的差異性和相關性，以期找出形成果實生長及品質差異的關鍵因素，為進一步研究苦瓜生長發育調控機理和品質改良提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

以福建省蔬菜遺傳育種重點實驗室選育的厚肉型苦瓜(‘LX1-3’)和薄肉型苦瓜(‘ZK54’)為材料，于2021年3月17日穴盤育苗，3月28日定植于福建省農業科學院作物研究所福州基地大棚，5月上旬進入盛花期，開花當日授粉，分別于花后3、10、17和23 d (days after flower, DAF)進行果實性狀觀測, 并采樣檢測細胞壁組分及酶活性。

1.2 方法

利用游標卡尺測量果實橫徑(fruit diameter, FD)和果實腔徑(fruit lumen diameter, FLD)，計算果肉厚度(pulp thickness, PT)=(FD-FLD)/2，利用電子天平先稱取苦瓜鮮質量(fruit fresh weight, FFW)，然后置于恒溫烘箱中100 ℃殺青2 h，65 ℃烘干，稱取干質量(fruit dry weight, FDW)，每個性狀5個重復。細胞壁組分和酶活性的檢測設3次重復，每3個苦瓜混樣為1個重復。

果實細胞壁物質的提取和分離參考Huber[28]和Siddiqui等[29]的方法并作了改進。稱取約0.3 g果肉，加液氮快速研磨后，加入80%乙醇提取15 min, 90 ℃水浴20 min, 冷卻至室溫, 6 000×, 25 ℃離心10 min,棄上清，沉淀用1.5 mL 80%乙醇和丙酮各洗2次, 再用1 mL 90%二甲基亞砜浸泡15 h, 6 000×, 25 ℃離心10 min，棄上清，將沉淀用蒸餾水清洗2次后置于60 ℃～100 ℃下烘干得到細胞壁物質。將上述細胞壁物質依次用1 mL 50 mmol/L乙酸鈉(pH 6.5)、1 mL 50 mmol/L乙酸鈉(含50 mmol/L EDTA)、1 mL 50 mmol/L碳酸鈉(含2 mmol/L EDTA)各振蕩提取3 h，每次8 000×4 ℃離心10 min收集上清液，3種上清液分別含有WSP、ISP和CSP。再向沉淀中加入1 mL 4 mmol/L NaOH (含100 mmol/L NaBH4)提取12 h后，10 000×離心10 min，得到含HCE的上清液，最后沉淀則為CE。各果膠采用咔唑-硫酸比色法測定，以半乳糖醛酸溶液作標準曲線；半纖維素采用間苯三酚-冰醋酸法測定，以d-木糖溶液作標準曲線；纖維素含量采用蒽酮比色法測定, 以葡萄糖溶液作標準曲線。PG、-Gal、-Xyl、PE、Cx的提取和活性檢測參照微量法試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)進行。

1.3 數據分析

所有數據以均值±標準誤差表示，采用Excel 2010進行數據整理，通過SPSS 21.0軟件進行相關性分析和多重比較(Duncan法)，以<0.05表示顯著差異，<0.01表示極顯著差異。

2 結果和分析

2.1 果實性狀差異

2份種質的FD、FLD、PT、FFW和FDW均隨發育過程而增加，相同發育時期不同性狀表現不一。其中，‘ZK54’在3和10 DAF的5個性狀均高于‘LX1-3’，且10 DAF的FFW差異顯著；但17和23 DAF ‘LX1-3’的5個性狀均大于‘ZK54’，且FD、FT、FFW和FDW的差異均達顯著水平(圖1)。

2.2 細胞壁組分含量差異

如圖2所示，2份材料的5個細胞壁組分含量在不同發育時期的變化不同?！甃X1-3’的WSP含量為23>3>17>10 DAF (下同)，‘ZK54’為23>10>3>17; ‘LX1-3’的ISP含量為10>23>3>17，‘ZK54’為10>17>23>3；‘LX1-3’的CSP含量為23>10>3>17, ‘ZK54’的CSP含量變化與ISP相似；‘LX1-3’的HCE和CE含量為3>10>23>17，‘ZK54’為10>3>17>23?！甃X1-3’在3和23 DAF的5種成分含量均高于‘ZK54’;‘LX1-3’在10 DAF的WSP和CSP含量高于‘ZK54’，而ISP、HCE和CE含量則低于‘ZK54’; ‘LX1-3’在17 DAF的WSP、HCE和CE含量高于‘ZK54’, 其余2種成分則低于‘ZK54’。

2.3 細胞壁相關酶活性

2個品種苦瓜的5種細胞壁相關酶活性在不同時期不同?！甃X1-3’的PG和-Gal活性為3>17>23> 10，‘ZK54’為3>23>17>10；2個品種的-Xyl活性變化趨勢相似，均為3>10>17>23；‘LX1-3’的PE活性為17>23>3>10，‘ZK54’為3>23>17>10；‘LX1-3’的Cx活性變化與-Xyl相似，‘ZK54’為3>17>10> 23?！甃X1-3’在3 DAF的PG和Cx活性均高于‘ZK54’,-Gal、-Xyl和PE活性則低于‘ZK54’；‘LX1-3’在10 DAF的PG、PE和Cx活性高于‘ZK54’, 其余2種酶活性則低于‘ZK54’；‘LX1-3’在17 DAF的PG、-Gal、PE和Cx活性高于‘ZK54’，-Xyl則低于‘ZK54’;‘LX1-3’在23 DAF的-Xyl和PE活性高于‘ZK54’, 其余3種酶活性則低于‘ZK54’ (圖3)。

2.4 相關性分析

對果實性狀、細胞壁組分和相關酶活性共計15個指標進行相關分析(表1)，結果表明，5個果實性狀(FD、PT、FLD、FFW和FDW)間均存在極顯著正相關關系；在細胞壁組分中，WSP與CSP間呈顯著正相關，ISP與CSP呈極顯著正相關，與纖維素含量呈顯著正相關；在細胞壁相關酶活性中，PG與-Gal和-Xyl間存在極顯著正相關關系，與PE呈顯著正相關性，-Gal與-Xyl間呈極顯著正相關。細胞壁組分WSP含量與PT、FFW和FDW間呈顯著正相關；細胞壁相關酶活性與生長性狀和細胞壁組分間多數存在負相關關系，PG活性分別與FD和CSP含量呈極顯著負相關，與PT、FLD、ISP含量呈顯著負相關；-Gal活性與FD、PT、FLD呈極顯著負相關，與FFW、FDW、CSP含量呈顯著負相關；-Xyl活性與5個果實性狀間呈極顯著負相關，與CSP含量呈顯著負相關；PE與ISP和CSP含量間呈極顯著負相關；Cx活性與5個果實性狀間呈顯著負相關。

圖1 苦瓜不同發育時期的FD、FLD、PT、FFW和FDW。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。FD: 果實橫徑; FLD: 果實腔徑; PT: 果肉厚度; FFW: 果實鮮質量; FDW: 果實干質量。下同

3 結論和討論

瓜果類蔬菜產品的經濟價值與質量、果徑、瓤腔徑、果肉厚等數量性狀，以及熟性、顏色等質量性狀密切相關，但不同性狀、同一性狀在不同種質間或不同發育階段均存在差異。研究表明，華南型黃瓜()不同品種的FLD差別最大, 且與FD呈極顯著正相關[30]，FT與FFW及產量呈極顯著及顯著正相關[31]。長果型黃瓜FD在6 DAF最大，9 DAF的增長速度變慢。短果型黃瓜FD則在12 DAF最大[32]?？喙系倪z傳基礎豐富，張燕等[33]報道51份苦瓜種質資源中有16份的品質性狀的平均變異系數達到29.24%，其中FD與FT、FFW與FD等8對性狀間呈現極顯著正相關；張玉燦等[34]對9個雜交組合苦瓜果實膨大過程進行觀察，FFW和FD在8 DAF內增長緩慢，8～20 DAF快速膨大，從20 DAF到轉色、成熟繼續緩慢增長并最終趨于穩定。本研究表明，2份苦瓜種質的FD、FLD、FT、FFW和FDW在3～10和10～17 DAF這2個時期增長迅速，其中薄肉型這5個性狀在3～10 DAF略高于厚肉型，而在10～17 DAF時期厚肉型逐漸超過薄肉型，并在17 DAF達到顯著差異，在17～23 DAF這5個性狀逐漸趨于平穩，表明苦瓜生長規律基本相似，但也存在品種間差異，須進行具體分析。相關性分析表明，這5個性狀間呈極顯著正相關關系，由此推斷苦瓜這些生長性狀隨果實的發育變化明顯，相互之間關系緊密，且有較大的品種效應，在遺傳改良上具有較大潛力。

圖2 苦瓜不同發育時期的WSP、ISP、CSP、HCE和CE含量。WSP: 水溶性果膠; ISP: 離子型果膠; CSP: 共價型果膠; HCE: 半纖維素; CE: 纖維素。下同

細胞壁組分會隨著果實發育階段的不同而出現變化。研究表明，不同質地甜瓜()果實細胞壁各組分含量差異較大，隨著甜瓜的發育和成熟，WSP和ISP含量不斷增加，但CSP、CE和HCE含量不斷減少[35]；不同棗()類果膠和CE降解起始時間不同，木棗發生在完熟期, 冬棗在脆熟期[36]；隨著果實的成熟，不同橄欖的WSP和CSP含量變化規律相似，但ISP含量表現不同,加工型橄欖‘長營’呈先上升后下降的趨勢；而鮮食型橄欖‘清欖1號’總體呈上升趨勢[16]。本研究表明，3種果膠在2種苦瓜種質發育過程中的變化趨勢各不相同，其中，WSP含量整體水平表現為厚肉型高于薄肉型，ISP和CSP表現為厚肉型“升-降-升”和薄肉型“先升后降”趨勢，CSP含量與WSP、ISP含量分別存在顯著和極顯著正相關關系，WSP含量與FT、FFW和FDW呈顯著正相關，HCE和CE含量變化趨勢相似，17 DAF厚肉型的均高于薄肉型, 再次證明細胞壁組分因種質、發育過程不同而呈現變化，對果實生長產生不同的影響，而發育中后期HCE和CE可能與苦瓜果肉增厚有較大聯系。

圖3 苦瓜不同發育時期的PG、β-Gal、β-Xyl、PE和Cx活性。PG: 多聚半乳糖醛酸酶; β-Gal: β-半乳糖苷酶; β-Xyl: β-木糖苷酶; PE: 果膠酶; Cx: 纖維素酶。下同

表1 苦瓜不同發育時期15個指標之間的相關性

*:<0.05;**:<0.01

在果實生長發育過程中，多種細胞壁酶參與調控果膠和纖維素-半纖維素的水解，造成細胞間連接減少、細胞離散，影響果實品質，這些酶在不同果實中或者同一果實的不同發育階段發揮不同的主導作用。研究表明，PG和-Gal活性隨靈武長棗的成熟而逐漸上升[37]，且兩者差異很可能是造成不同葡萄()品種質地差異的主要原因[38]；PE活性對庫爾勒香梨()、子用西瓜(var.)和哈密瓜(var.)的耐貯性均有影響[39–41]；-Gal和Cx的活性與甘薯()的腐爛率和失重率呈極顯著正相關[42]，但與哈密瓜果實硬度呈極顯著負相關[41]。Cx可能促進橄欖果實中CE降解[16]，但番茄果實Cx活性隨生長發育基本保持不變，與CE含量的升高并無關聯[21]; 表明細胞壁代謝相關酶在不同種類果實中的作用機制可能存在差異。本研究表明，不同的苦瓜種質之間以及不同酶之間其活性差異較大，其中PG和PE在厚肉型種質中呈“降-升-降”的趨勢，而在薄肉型種質中呈“先降后升”趨勢，兩者與ISP和CSP含量“升-降-升”和“先升后降”的變化趨勢呼應，-Gal和-Xyl活性在3 DAF顯著高于其他時期，但隨著果實發育，Xyl活性在2份種質中均依次下降，-Gal活性在厚肉型中17 DAF小幅上升，呈“降-升-降”趨勢，薄肉型呈“先降后升”趨勢，相關分析顯示，部分酶活性之間呈(極)顯著正相關，酶活性與成分之間以及與果實性狀之間呈(極)顯著負相關，表明酶與酶之間存在一定的協同作用，其活性影響細胞壁組分的合成和降解，-Xyl和-Gal活性在3 DAF顯著高于其它時期，表明兩者在苦瓜早期生長的調控效應較其他階段較高，此結果符合大多數植物果實早期發育的細胞變化規律，即在果實生長發育早期主要以細胞分裂為主，細胞壁裂解頻繁，需要許多細胞壁酶進行高效作業，以達到快速獲得大量細胞的目的。相關性分析結果也印證了在果實發育后期即細胞分裂結束后，酶活性趨于平穩，細胞轉入膨大生長期，隨著細胞體積的膨大，果實也隨之不斷增大，最終影響苦瓜果實的產量及品質。

綜上，苦瓜的FD、FLD、FT、FFW和FDW隨果實發育不斷增大，細胞壁組分HCE和CE含量可能對中后期果實發育，尤其是果肉增厚有較大影響，細胞壁代謝相關酶活性與果實發育也關系緊密，-Xyl和-Gal活性在花后3 d高于其他時期,推測這2種酶可能與苦瓜早期發育有較大關聯，具體機制需進一步深入研究。

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Differences of Cell Wall Components and Related Enzyme Activities inFruits at Different Development Stages

QIU Boyin, LIN Hui, ZHANG Qianrong, LI Yongping, WEN Qinfang, ZHU Haisheng*, LI Dazhong*

(Fujian Key Laboratory of Vegetable Genetics and Breeding, Fujian Engineering Research Center for Vegetables, Crops Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China)

In order to understand the causes of fruit quality differences in, the contents of cell wall components and related enzyme activities in thick flesh-type ‘LX1-3’ and thin flesh-type ‘ZK54’ were studied during fruit development. The results showed that diameter (FD), lumen diameter (FLD)，pulp thickness (PT), fresh weight (FFW) and fresh weight (FDW) of fruit in ‘LX1-3’ were all higher than those in ‘ZK54’ at 17 days after flowering (DAF). The contents of cell wall components and related enzyme activities were different among cultivars. the content of water-soluble pectin in ‘LX1-3’ was higher than that of ‘ZK54’, and it was significantly positively correlated with PT, FFW, FDW. The contents of hemicellulose (HCE) and cellulose (CE) in ‘LX1-3’ were higher than those in ‘ZK54’ at 17-23 DAF. The activities of-Gal and-Xyl of both cultivars at 3 DAF were higher than those at the other three stages. The variation trend of PG,-Gal and pectinase activities was consistent with that of ionic pectin and covalent pectin. The activities of-Gal,-Xyl and cellulase had (extremely) significantly negatively correlated with 5 growth traits, as well as PG with FD, FLD and PT. Therefore, cell wall components and enzyme activities were closely related to fruit development.-Xyl and-Gal played major roles in early fruit development, while HCE and CE had great influence on middle and later fruit developments.

; Fruit; Development; Cell wall component; Enzyme activity

10.11926/jtsb.4699

2022-07-08

2022-08-04

福建省公益類科研院所專項(2020R10310010)；福建省農業科學院自由探索科技創新項目(ZYTS2021001)；福建省農科院蔬菜遺傳育種科技創新團隊項目(CXTD2021038)；福建省農科院科技創新平臺專項(CXPT202001)資助

This work was supported by the Special Project for Basic Research of Public Research Institute in Fujian (Grant No. 2020R10310010), the Project for Freely Explore Scientific and Technological Innovation in Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. ZYTS2021001), the Project for Vegetable Genetics and Breeding Technology Innovation Team of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. CXTD2021038), and the Special Project for Science and Technology Innovation Platform of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. CXPT202001).

裘波音(1984年生)，女，博士，助理研究員，主要從事蔬菜生物技術與育種研究。E-mail: qby747_1030@163.com

* 通訊作者 Corresponding author. E-mail: zhs0246@163.com; 772857984@qq.com