光敏色素A調控光響應基因表達及其翻譯后修飾研究進展

鄧玲, 劉勛成

光敏色素A調控光響應基因表達及其翻譯后修飾研究進展

鄧玲1,2,3, 劉勛成1,2*

(1. 中國科學院華南植物園，廣州 510650; 2. 華南國家植物園, 廣州 510650; 3. 中國科學院大學，北京 100049)

光是調節植物生長發育最重要的環境信號因子之一。植物通過光受體感受自然環境中光的強度、方向以及光周期等信號的變化，從而調控其生長發育過程。光敏色素A (phytochrome A, PHYA)是植物中唯一的遠紅光受體蛋白，具有在黑暗下在細胞質中合成，而在照光后快速入核和降解的特性，并通過多種途徑精確調節了植物光響應基因的轉錄網絡。同時，蛋白質翻譯后修飾在調節PHYA穩定性和活性的過程中發揮了重要的作用。該文論述了PHYA調節光響應基因表達以及PHYA翻譯后修飾方向的研究進展，并展望了PHYA在農作物分子設計育種中的應用前景。

光敏色素；光受體；光信號轉導；翻譯后修飾

光不僅是植物光合作用的能量來源，也是調節植物生長發育重要的環境信號因子。在長期的進化過程中，植物形成了極為精細和完善的光感受和信號轉導系統。光受體是植物識別和感受光的重要因子。在感知環境中光的強度、方向和光周期變化后，光受體發生定位、翻譯后修飾和蛋白水平等生化特性的改變，通過光信號轉導途徑調控光響應基因的表達，并最終調節植物的生長發育過程[1]。目前, 已經鑒定報道的植物光受體有5類：感受紅光(620～700 nm)和遠紅光(700～800 nm)的光敏色素(phyto- chromes, PHYs)，感受藍光和UV-A區(320～380 nm)的隱花色素(cryptochromes, CYRs)，感受藍光(380～ 500 nm)的向光素(phototropins, PHOTs)，感受藍綠光(450～520 nm)的ZTLs (zeitlupes)類蛋白，以及感受紫外光UV-B區(280～320 nm)的紫外光受體(UV RESISTANCE LOCUS 8, UVR8)[2]。不同類型的光受體調控了植物從種子萌發、幼苗形態建成、莖的伸長直至開花結實的整個生命周期過程[3]。

作為植物中唯一的遠紅光受體，光敏色素A (PHYA)具有區別于其他光受體的特性，如幼苗從黑暗轉入照光后，PHYA快速的從細胞質穿梭至細胞核并被降解[4–6]。PHYA在進入細胞核后，通過調控關鍵轉錄因子如HY5 (elongated hypocotyl 5)和PIFs (phytochrome interacting factors)等蛋白穩定性來調節光響應基因的表達；另一方面，PHYA也直接結合到下游光響應基因的啟動子區域，并促進或抑制其基因的表達[7–9]。

蛋白質翻譯后修飾(post-translational modifications, PTMs)能調節蛋白質定位、結構、活性、互作以及生物學功能等，是真核生物生命活動的重要調節方式，其中常見的有磷酸化、泛素化、甲基化、?；吞腔萚10]。大量的研究表明，磷酸化和泛素化等修飾在調節植物光受體生化特性和光信號轉導途徑中發揮重要的作用。如光照誘導的磷酸化修飾影響PHYA在細胞中的定位和功能[4,11]，而泛素化修飾則引起PHYA的降解[12–13]；同時，光誘導的磷酸化修飾增強了隱花色素CRY1/CYR2以及向光素PHOT1的激酶活性[14–16]。

本文主要綜述了近年來對光敏色素重要成員—— PHYA介導光響應基因表達的作用機制，以及蛋白質翻譯后修飾調節PHYA特性方面的研究進展，以期為利用光照提高農作物的產量和品質的分子育種提供理論參考。

1 光敏色素成員及結構特征

擬南芥基因組編碼5個光敏色素家族成員: PHYA、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE，其中PHYA和PHYB為最主要的光敏色素。PHYA主要感知遠紅光(700～ 750 nm)，而PHYB則主要感知紅光(600～700 nm)。根據光敏色素在光下的穩定性，通常將其分為光穩定類型和光不穩定類型，其中僅PHYA為光不穩定類型的光敏色素[17]。光敏色素存在2種可逆的活性形式，即：在黑暗中吸收遠紅光后的非活性的紅光吸收形式(Pr)，該形式定位于細胞質中，性質穩定不易降解；另一種為吸收紅光后的具有活性的遠紅光吸收形式(Pfr)[18–22]。

光敏色素在細胞質內以脫輔基的形式合成。脫輔基的光敏色素蛋白不能接收光子，在通過自催化共價結合四吡咯環色素小分子(PB)后，能夠組裝成具有完整生物學功能的光敏色素全蛋白[21,23]。植物光敏色素成員均具有類似的結構域。在蛋白結構上，PHYA可分為氨基端(N端)的光信號感受區和羧基端(C端)的光信號傳遞區域，中間由靈活的鉸鏈區相連接(圖1)。N端區域包括N端延伸區(NTE)、PAS、GAF和PHY等結構域，主要負責信號的輸入；C端區域含有2個PAS的PAS相關結構域(PRD)以及組氨酸激酶(HKRD)相關結構域，主要負責調控、二聚化和信號的輸出功能[18]；鉸鏈區則可能在光敏色素Pr與Pfr形式相互轉換的過程中具有關鍵調控作用[4]。

圖1 PHYA蛋白的結構域

2 PHYA介導的光信號基因表達的作用途徑

在擬南芥中，PHYA的突變體在持續白光和紅光下表現為野生型的光形態建成的表型，而在持續遠紅光下則表現為暗形態建成的表型，說明PHYA主要負責遠紅光信號的感知與傳遞[24–26]。在持續藍光下，PHYA突變體也表現為長下胚軸的表型，表明PHYA也參與藍光信號的感受與響應[27–28]。

前人研究表明，在黑暗條件下，PHYA蛋白定位于細胞質中；在感受光信號后，PHYA發生結構變化，在FHY/FHL蛋白的輔助下進入細胞核[29]。研究表明，PHYA通過多種途徑參與調控光響應基因的表達。首先，入核的PHYA與一組特殊的bHLH (basic helix-loop-helix)類型的轉錄因子發生直接相互作用。這類與PHYA及其它光敏色素互作的轉錄因子被稱為光敏色素互作因子(PIFs)，包含有多個成員，PIF1～PIF8，這類蛋白為植物光形態建成的抑制因子[30–36]。PIFs類蛋白具有直接結合光響應基因啟動子區域的G-box (CACGTG)順式作用元件并調控其表達的活性。PHYA與PIFs蛋白互作，誘導其發生磷酸化并最終被泛素化途徑降解，進而間接的調節植物光響應基因表達[30](圖2)。

其次，研究表明PHYA也能通過調控COP1 (con-stitutive photomorphogenic 1, COP1)與SPA (suppressor of phytochrome A)組成的蛋白復合體調節光響應基因表達。COP1為一種E3泛素連接酶，是植物光信號轉導的主效抑制因子[37–40]。亞細胞定位研究顯示，在黑暗生長的幼苗中COP1定位于細胞核；而當幼苗轉入光照后COP1穿梭至細胞質中[41]。在黑暗下，COP1/SPA復合體與關鍵的光信號途徑轉錄因子發生蛋白互作, 如HY5、HYH (HY5 homolog)、FHY3 (far-red elongated hypocotyls 3)、HFR1 (long hypocotyl in far-red 1)、FAR1 (far-red impaired response 1)和LAF1 (long after far-red light 1)等，并引起這些轉錄因子發生泛素化降解，從而抑制植物的光形態建成[42–47]。當植物轉入照光后，PHYA進入細胞核，與COP1/SPA復合體發生蛋白互作，誘導COP1蛋白出核，抑制其形成有功能的E3泛素連接酶復合體，從而釋放了各種轉錄因子的活性并啟動大量光響應基因的表達[48]；同時，COP1/SPA復合體也引起PHYA蛋白發生泛素化修飾，并最終被降解(圖3)。

此外，前人通過高通量染色質免疫共沉淀測序檢測, 認為PHYA可以結合到大量光響應基因的啟動子區域，表明PHYA可能不依賴下游PIFs轉錄因子的形式，而是直接參與調控了光響應基因的表達[9](圖2)。最近的研究表明，光激活的PHYA和PHYB與轉錄因子ERF55和ERF58的DNA結合結構域互作，通過阻止它們與靶基因的結合，從而調控光依賴的種子萌發途徑[49]。這些研究充分表明, PHYA以多種復雜的調控途徑介導了植物光信號的轉導以及光響應基因的表達。

圖2 PHYA調控光響應基因表達的作用模式。A: 黑暗條件；B: 照光條件。

3 PHYA蛋白的翻譯后修飾及調控作用

蛋白質是執行細胞功能的基本單元，通常在表達后還需要經過不同程度的翻譯后修飾才能發揮生物學功能。近年來的研究表明，多種翻譯后修飾，如磷酸化和泛素化修飾等在參與調節PHYA活性、穩定性以及生物學功能方面發揮了重要的作用[4,11,50–61]。

3.1 磷酸化修飾

在生物體內，磷酸化是蛋白翻譯后修飾中最為廣泛的共價修飾形式，同時也是原核生物和真核生物中最重要的調控修飾形式，對蛋白質功能的正常發揮起著重要的調節作用[62]。蛋白的磷酸化修飾是指不同類型的蛋白質激酶(kinase)將ATP或GTP的位磷酸基團轉移到底物蛋白質的氨基酸殘基上, 如絲氨酸(serine, Ser)、蘇氨酸(threonine, Thr)和酪氨酸(tyrosine, Tyr)位點上，而其逆向過程則是由多種蛋白質磷酸酶(phosphatase)催化調控。

早期對燕麥的研究表明，黑暗生長的燕麥幼苗體內的PHYA發生磷酸化修飾，后續利用純化的PHYA蛋白進行鑒定，發現磷酸化的位點位于NTE區的Ser-8和Ser-18以及鉸鏈區的Ser-599號位點上(圖3)[50]。對這些磷酸化修飾位點的功能分析表明，鉸鏈區Ser-599號位點的磷酸化阻止了燕麥PHYA與其下游信號元件(如NDPK2)的相互作用[51]，而NTE區的Ser到Ala (丙氨酸)模擬去磷酸化突變則能增加PHYA蛋白的穩定性和生物活性[52–54]。研究表明,除燕麥PHYA對Ser-8和Ser-18位點能進行自磷酸化作用外[55–56]，其他的一些因子也參與介導PHYA的磷酸化和去磷酸化修飾。如燕麥的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白磷酸酶FyPP可以去磷酸化燕麥的PHYA[63]。同時，燕麥FyPP/PAPP5蛋白磷酸酶與PHYA蛋白直接互作，并特異性的去磷酸化Pfr形式的PHYA，其作用位點為鉸鏈區的Ser-598的磷酸根[57–58](圖3)。

最近研究表明，擬南芥PHYA蛋白鉸鏈區的3個氨基酸位點Ser-590、Thr-593、Ser-602均可以被磷酸化，這些位點的磷酸化調節了PHYA的生物活性[4,11](圖3)。同時，擬南芥PHYA的磷酸化形式是由細胞核中的Pfr形式產生的，且磷酸化的PHYA可能是活性最強的形式[4]。

圖3 PHYA蛋白多個位點發生磷酸化修飾。A: 燕麥PHYA自磷酸化以及被FyPP/PAPP5去磷酸化; B: 燕麥PHYA上3個位點發生磷酸化; C: 擬南芥PHYA的hinge區域3個位點發生磷酸化。

3.2 泛素化修飾

在真核生物中，蛋白質的降解主要依賴于一類稱為泛素的小分子降解途徑。泛素分子在泛素激活酶、結合酶和連接酶等的作用下，對靶蛋白進行特異性修飾的過程。PHYA是最早被發現發生泛素化修飾的光受體蛋白[59–61]。

近年來，高通量蛋白質組學分析表明，擬南芥PHYA蛋白上存在6個泛素化修飾的賴氨酸位點, 這些修飾位點位于不同的結構域上，黃化的擬南芥幼苗照射紅光后，這些位點泛素化水平迅速增加，引起PHYA被26S蛋白酶體途徑快速降解。然而，在添加26S蛋白酶體抑制劑MG132處理后，僅能微弱的減緩PHYA蛋白的降解，表明除了26S蛋白酶體途徑，其它未知的途徑也參與到PHYA的泛素化降解途徑[12](圖4)。此外，另一項研究表明，擬南芥PHYA蛋白第206位賴氨酸位點主要介導了PHYA蛋白的泛素化降解，幼苗照射紅光后，該位點突變為精氨酸后PHYA的泛素化水平明顯下降[13]。

圖4 擬南芥PHYA發生泛素化修飾和降解。A: 照光后發生泛素化并被26S蛋白酶體途徑降解; B: 6個賴氨酸位點發生泛素化修飾。

3.3 其他尚未明確的翻譯后修飾

除已報道的磷酸化和泛素化修飾，PHYA也可能存在著其他翻譯后修飾作用。高通量蛋白質乙?；M學分析表明，在早期發育的水稻()種子中，PHYA的285位賴氨酸位點發生乙?；揎梉64]，表明乙?；揎椏赡軈⑴c調控水稻PHYA的生物學功能。由于賴氨酸殘基不僅可以發生泛素化和乙?；揎?，還可以發生小泛素化修飾。在擬南芥PHYA上鑒定發生泛素化修飾的賴氨酸位點，也可能是小泛素化和乙?；刃揎椃绞桨l生的潛在位點。這些修飾如何協同調控PHYA蛋白穩定性及生物學功能，仍有待進一步的研究。

4 討論和展望

前人研究表明，有生理活性的Pfr形式的PHYA通過多種途徑調控光響應基因的表達：(1) PHYA在照光入核后與PIFs轉錄因子互作，引起PIFs的泛素化降解從而調節下游基因的表達[30–36]；(2) PHYA入核后抑制COP1和SPA形成有功能的E3泛素連接酶復合體，促進轉錄因子如HY5、FHY3和HFR1的累積，進而啟動光響應基因表達[42–48]；(3) PHYA入核后直接結合光響應基因啟動子并調控其表達[9]。以上研究充分揭示了PHYA間接調控基因轉錄的作用機制，然而，PHYA如何直接參與調控光響應基因的表達，其機制仍未探明。表觀遺傳修飾如組蛋白乙?；图谆揎椩谡{節染色質結構和基因表達過程中起到重要的作用[65–66]。在后續的研究中，鑒定PHYA互作的表觀遺傳因子，解析PHYA對染色質結構的影響，將有助于闡明PHYA直接調控光響應基因表達的分子機制。

近期的研究表明，PHYA活性和穩定性受到磷酸化和泛素化等多種翻譯后修飾調節。擬南芥PHYA鉸鏈區3個位點Ser-590、Thr-593和Ser-602的磷酸化修飾調節了PHYA的生物活性[4,11]。擬南芥PHYA蛋白上6個賴氨酸發生泛素化，這些修飾降低了PHYA的穩定性[12–13]。然而，植物體內哪些激酶參與調節這些位點的磷酸化？PHYA的泛素化修飾被哪些因子動態調節？此外，水稻中發現的PHYA的乙?；揎椨泻紊飳W作用？在后續研究中，進一步鑒定介導PHYA翻譯后修飾的上游因子，將有助于更深入的揭示PHYA活性調節以及參與遠紅光信號轉導的分子機制。

盡管PHYA的生物學功能尚未完全闡明，但其已知生化功能特性也為農作物的改良育種提供了重要的思路。最近，利用植物PHYA能夠靈敏感光，以及與伴侶蛋白FHY1在不同波長光下結合(660 nm)或分離(730 nm)的特點，研究人員開發出了一種光依賴的轉錄激活系統，該系統具有超高的光靈敏度并能高倍的誘導基因表達，該系統有望在農作物性狀的改良中得到應用[67]。同時，光敏色素不僅是感受光信號的蛋白，也是感知環境溫度的受體因子[68],針對全球變暖的環境問題，我們可以利用光敏色素感受光和溫度的特性，可以對植物光敏色素進行改造，獲得更加耐受高溫的農作物。此外，PHYA具備獨特的在黑暗中積累而在光下降解的特性，這一特性可以作為一種分子開關，精確地調節農作物重要代謝物的生物合成。

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Research Progress of Phytochrome A in Regulating Light-responsive Gene Expression and Its Post-translational Modifications

DENG Ling1,2,3, LIU Xuncheng1,2*

(1. South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650, China; 2. South China National Botanical Garden, Guangzhou 510650, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049, China)

Light is one of the most important critical factors that regulate plant growth and development. Photoreceptors perceive the changes in light intensity, direction and photoperiod to regulate the entire lifecycle of plants further. Phytochrome A (PHYA) is the unique far-red light receptor in plants. PHYA is synthesized in the cytosol in the dark; upon light illumination, PHYA is translocated into the nucleus and degraded rapidly. PHYA precisely regulates the transcription network via multiple pathways. Furthermore, post-translational modifications have been shown to play an essential role in modulating the stability and activity of PHYA. The research progress on PHYA-mediated transcription and post-translational modifications of PHYA were summarized, and the application prospects of PHYA in molecular design breeding in crops were also discuss.

Phytochrome; Photoreceptor; Light signal transduction; Post-translational modification

10.11926/jtsb.4723

2022–09–05

2022–10–29

國家自然科學基金項目(32070551, 31771366)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070551, 31771366).

鄧玲(1998年生)，女，碩士研究生，研究方向為植物新型蛋白質修飾與表觀遺傳學。E-mail: dengling9803@163.com

* 通訊作者 Corresponding author. E-mail: xunchengliu@scbg.ac.cn