組織保護劑對病毒核酸與豚鼠皮膚組織樣本RNA 的保存效果探究

李華，徐蘭舉，黃學亮，王亞如，刁立琴*，于月欣*

1.河北納科生物科技有限公司，石家莊 050035；2.河北以嶺醫院，石家莊 050090；3.河北省藥品醫療器械檢驗研究院，石家莊 050227

在分子生物學實驗與檢測過程中，生物樣本的保存對于檢測結果的真實性和可重復性至關重要。儲存后的生物材料應在分析前具有最小的變化，以便為研究人員提供高質量的樣品，從而得出可靠以及可重復的實驗或檢測結果［1］。冷凍組織是目前現代生物學檢測中最常用的生物樣本，樣本的冷凍儲存和運輸過程中通常會選擇液氮作為儲存劑［2］。液氮的低溫特性是樣本保存的理想條件，但其可能會導致接觸者的活組織產生快速凍結現象?？焖賰鼋Y現象被稱為“低溫燒傷”，會造成參與樣品存儲和檢測的實驗人員嚴重凍傷［3］。除液氮外，干冰也是進行生物樣品低溫運輸的常用方式。但干冰同樣存在易凍傷的危險，且其易升華，放置在普通密閉容器內有爆炸的危險。當大量使用干冰時，要保持環境的通風，防止大量氣體揮發造成人員窒息。液氮和干冰的危險性質以及高昂的運輸成本極大地限制了其常規使用［4］。此外，冷凍樣品往往會導致生物樣本細胞內外的冷凍損傷和滲透應激［5］。因此，探究易于實施、成本低廉且更安全的樣品儲存運輸方式對生物樣品的結果檢測至關重要。

很多臨床手術樣本很難及時凍存到液氮或者干冰，甚至-80 ℃冰箱中，因此RNA 樣本的采集、運輸、保存及使用困難。RNA later是由Ambion公司研發的組織保護劑產品。RNA保護劑的問世解決了臨床組織樣品中RNA 極易降解的難題。本文研發了一種新配方的組織保護劑，探究了其對病毒核酸載量的保護效果，比較了其與市售RNA later產品以及常規儲存方式對豚鼠皮膚組織樣本RNA 提取量和純度的影響，旨在為實驗生物樣品RNA的保存與運輸提供一種安全簡便的選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Hartley 豚鼠，SPF 級，250～350 g，雌雄各半，購自青島康大愛博生物科技有限公司。許可證號：SCXK（魯）2021 003。

1.2 主要試劑與儀器

組織保護劑屬于本公司自研產品，其組成成分如下：在去離子水中，充分溶解40%硫酸銨、5%氯化鈉、1 mg·L-1RNase 抑制劑混合液、0.1%DEPC 水。待所有試劑充分溶解后，使用有機酸（HCl 與H2SO4等量混合），調節溶液pH 至5.5～6.0。

實驗涉及試劑：自研組織保護劑（河北納科生物科技有限公司，210902）、市售RNA later（美國賽默飛公司，91226297）、RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP419）、DEPC 水（北京索萊寶科技有限公司，R1600）、無水乙醇（天津市大茂化學試劑廠，3852）、硫酸銨（美國Sigma-Aldrich公司，7783-20-2）、氯化鈉（天津市永大化學試劑有限公司，7647-14-5）、RNase 抑制劑混合液（Thermo Fisher，Promega and New England Biolab，N8080119）、瓊脂糖電泳Maker［生工生物工程（上海）股份有限公司，B600022-0050］、Super gelred（美國US EVERBRIGHT INC 公司，IS0429）、瓊脂糖粉末（美國賽默飛公司，0000733422）、6×loading buffer（上海碧云天生物技術有限公司，D0071）、50×TAE 緩沖溶液（北京索萊寶科技有限公司，T1060）。

實驗涉及儀器：NanoDrop×2000c 分光光度計（美國賽默飛公司）、4 ℃離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）、瓊脂糖電泳儀（美國Bio-rad公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 核酸病毒的病毒載量檢測 本研究收集了20 例新型冠狀病毒感染患者的核酸病毒，將其放入組織保護劑中。核酸病毒管在4 ℃、室溫（25 ℃）和37 ℃放置不同時間后，送河北以嶺醫院檢驗科PCR 實驗室檢測。與初始核酸病毒載量相比較，核酸病毒放置不同時間后病毒載量的改變情況。本研究共設置以下分組：4 ℃條件下，保存0 d組、7 d組、14 d組、21 d組和30 d組；25 ℃條件下，保存0 d 組、1 d 組、3 d 組、5 d 組和7 d 組；37 ℃條件下，保存0 h組、6 h組、12 h組、18 h組和24 h組。

1.3.2 皮膚組織樣本RNA 提取量、純度和降解情況檢測 本研究取豚鼠皮膚組織樣本，放入液氮組、市售RNA later 液組和組織保護劑組中。3 個實驗組的組織樣本在4 ℃放置30 d、25 ℃放置7 d或37 ℃放置24 h 后，稱量20 mg 豚鼠皮膚組織樣本，檢測不同保存方式在保存相同時間后組織樣本RNA 的降解情況。使用組織研磨器在液氮中研磨組織塊，然后按照RNA 提取試劑盒的步驟提取組織細胞RNA。提取RNA 后，進行RNA 提取量和純度的檢測。

本研究進一步利用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳進行RNA 降解情況的檢測，各組取2.5 μL RNA 與0.5 μL 6×loading buffer 混合，進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察RNA條帶的情況。

1.3.3 統計方法 本研究中所有實驗數據均使用SPSS 20.0 進行統計分析，使用均數±標準差表示。t檢驗進行組間數據的統計學分析，P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 核酸病毒載量的檢測

合適的樣本保存液能夠保證病毒的檢出率，避免發生漏檢［6］。在4 ℃條件下，20 份新型冠狀病毒樣本分別保存0、7、14、21 和30 d 后，進行各組病毒核酸的提取，通過實時熒光PCR 檢測病毒載量的變化，結果如表1所示，20份病毒樣本的循環數（Ct）值分別放置0、7、14、21 和30 d 后，Ct值均在初始Ct值附近波動，各處理Ct值之間無統計學差異（P＞0.05），證實本組織保護劑在4 ℃條件下可以保存病毒30 d，對病毒核酸具有較好的保護效果。

表1 4 ℃放置不同時間后病毒核酸載量的比較Table 1 Comparison of viral nucleic acid load at 4 ℃ for different time

本研究同時檢測了在25 ℃條件下，保存0、1、3、5和7 d后，Ct值的波動情況。如表2所示，與0 d組相比較，1 d 組、3 d 組、5 d 組和7 d 組的Ct值均無統計學差異（P＞0.05）。該結果表明，25 ℃條件下，組織保護劑可以保存病毒7 d。

表2 25 ℃放置不同時間后病毒核酸載量的比較Table 2 Comparison of viral nucleic acid load at 25 ℃ for different time

如表3所示，本研究檢測了在37 ℃條件下，核酸病毒在保護劑中保存0、6、12、18和24 h后Ct值的變化情況。與0 h 組相比較，各實驗組的Ct值均無統計學差異（P＞0.05）。該結果表明，在37 ℃的條件下，組織保護劑對病毒載量的保存效果可以長達24 h。

表3 37 ℃放置不同時間對病毒核酸載量的比較Table 3 Comparison of viral nucleic acid load at 37 ℃ for different time

2.2 皮膚組織樣本的RNA檢測

RNA 很容易被RNA 酶降解，因此需要一種高效、無害的方法來優化RNA 的保存和提?。?］。RNA 的濃度和純度是進行RNA 樣本質量評價的主要標準和進行后續研究的必要前提［8］。本研究取豚鼠的皮膚組織，放入液氮、市售RNA later 和組織保護劑中，市售RNA later 和組織保護劑組在4 ℃放置30 d 后，取20 mg 組織提取RNA，比較各組組織RNA 的提取量和純度。如圖1A 所示，組織保護劑保存樣本的RNA 提取量與液氮保存或市售RNA later 保存無統計學差異（P＞0.05）。瓊脂糖電泳凝膠結果顯示，各組RNA 條帶均存在28 S 和18 S 條帶，且28 S 條帶灰度值：18 S 條帶灰度值＞1∶1，接近2∶1，說明各組所提RNA 的完整性好（圖1B）。本研究檢測了各組樣本RNA 在A260/A280吸光度值、A260/A230吸光度值的改變。液氮組A260/A280吸光度均值為1.91、A260/A230吸光度均值為2.07；市售RNA later 組的A260/A280吸光度均值為1.93、A260/A230吸光度均值為2.06；組織保護劑組的A260/A280吸光度均值為1.96、A260/A230吸光度均值為2.07。如圖1C～D 所示，各實驗組RNA 的A260/A280吸光度值與A260/A230吸光度值之間無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 4 ℃放置30 d后不同處理對RNA保護的驗證結果Fig.1 Verification results of RNA protection by tissue protectant after 30 days at 4 ℃

圖2 為豚鼠皮膚組織樣本在25 ℃放置7 d 的結果。組織保護劑保存樣本的RNA 提取量、A260/A280吸光度值和A260/A230吸光度值與液氮保存組或市售RNA later保存組無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 25 ℃放置7 d后不同處理對RNA保護的驗證結果Fig.2 Verification results of RNA protection by tissue protectant after 7 days at 25 ℃

本研究取豚鼠的皮膚組織在各實驗組中37 ℃放置24 h 后，取20 mg 組織進行組織中RNA的提取。如圖3 所示，與液氮保存組或市售RNA later 組相比較，組織保護劑保存樣本的RNA 在提取量、純度方面均無統計學差異（P＞0.05）。上述結果表明，本公司自研生產的組織保護劑與進口市售RNA later 具有相近的RNA 保護效果，可以作為其替代品應用。

圖3 37 ℃放置24 h后不同處理對RNA保護的驗證結果Fig.3 Verification results of RNA protection by tissue protectant after 24 hours at 37 ℃

3 討論

隨著我國生命科學領域的迅速發展，更多研究者開始注重生物資源的利用。此時，生物樣本的質量對生物科學領域的研究愈發重要［9］。在醫學研究中，生物樣本是聯系分子信息與疾病發現的橋梁［10］。無論是用于研究還是治療，細胞和組織低溫保存的整個過程都充滿了風險［11］。生物樣本的保存環境和運輸條件會嚴重影響樣本質量，對檢測結果至關重要［12］。在心臟移植手術中，心臟保存液是一個非常重要的因素，其保存效果直接影響著移植心臟的功能狀態、患者的臨床預后及遠期生活質量［13］。本研究將核酸病毒樣本以及豚鼠皮膚的組織樣本保存在自研的組織保護劑中，結果證實組織保護劑對病毒載量以及皮膚組織樣本RNA 具有很好的保護效果，能夠滿足安全高效運輸樣本的要求。

病毒樣本的保存和運輸條件對其檢測結果的準確性至關重要［14］。本研究探究了組織保護劑對核酸病毒的保存效果，結果證實核酸病毒在4 ℃條件下放置30 d，25 ℃條件下放置7 d 以及37 ℃條件下放置24 h，Ct值均在初始Ct值附近波動，證實組織保護劑對病毒載量具有很好的保護效果，有助于檢測的高效性和準確性。隨著分子生物技術在生物學、醫學等方面的廣泛應用，從生物實驗材料成功提取總RNA 是保證后續實驗正常進行的必要前提［15］。豚鼠皮膚組織樣本RNA 的保護效果探究中，在4 ℃放置30 d，25 ℃放置7 d以及37 ℃放置24 h后，組織保護劑保存樣本RNA的提取量、RNA 條帶完整性、純度與液氮保存組及市售RNA later 保存組均無統計學差異。上述結果表明，組織保護劑與市售RNA later 均具有對RNA質量和純度的保護效果。

上述結果表明河北納科生物科技有限公司生產的組織保護劑對核酸病毒載量以及豚鼠皮膚組織中的RNA 具有良好的保護效果。在不需液氮的情況下，組織保護劑對豚鼠皮膚組織的RNA 具有良好的保護效果，這將降低實驗的研發成本并保護研發人員的安全。此外，本公司組織保護劑配方中95%原料來自國產原料，極大降低了實驗成本。綜上所述，本公司成功開發生產的組織保護劑，能夠代替傳統的冷凍保存組織樣本，安全有效降低實驗樣本的儲存成本。