分枝列當寄生甜瓜時吸器形成過程中內源激素的動態變化

田芳 張學坤 姚兆群 董雪 曹小蕾 趙思峰

摘要

本研究采用石蠟切片和顯微觀察分析分枝列當寄生甜瓜時的吸器形成過程，利用液相色譜質譜聯用?（LCMS）?檢測吸器形成過程中24種植物內源激素變化。結果表明：分枝列當種子在接種甜瓜根部第3?天開始萌發，接種第7?天分枝列當吸器頂端穩固地附著在寄主根部，吸器侵入甜瓜根皮層，并在甜瓜根皮層細胞內擴展，擴展過程中形成大量的爪狀結構，接種第11?天時分枝列當吸器細胞與寄主根維管束連接。共有17種植物激素參與了吸器形成過程，其中生長素類吲哚3甲醛含量在列當吸器形成過程中降低了83.36%，細胞分裂素類反式玉米素核苷的含量在增長了5.02倍;油菜素內酯含量增長了481.95倍，推測這3類植物激素在分枝列當吸器形成過程中可能起到重要的調控作用。

關鍵詞

分枝列當;?甜瓜;?吸器;?內源激素

中圖分類號：?S?451

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022696

Dynamic?change?of?endogenous?hormones?during?the?formation?of?haustorium?of?Orobanche?aegyptiaca?parasitizing?melon

TIAN?Fang，?ZHANG?Xuekun，?YAO?Zhaoqun，?DONG?Xue，?CAO?Xiaolei，?ZHAO?Sifeng*

（Key?Laboratory?at?the?Universities?of?Xinjiang?Uygur?Autonomous?Region?for?Oasis?Agricultural?Pest?Management?

and?Plant?Protection?Resource?Utilization，?College?of?Agriculture，?Shihezi?University，?Shihezi?832003，?China）

Abstract

In?this?study，?the?formation?process?of?haustorium?of?Orobanche?aegyptiaca?was?analyzed?by?paraffin?section?and?microscopic?observation，?and?the?dynamic?changes?of?endogenous?hormones?in?O.aegyptiaca?at?different?stages?of?haustorium?formation?during?parasitism?to?melon?roots?were?detected?by?liquid?chromatography?mass?spectrometry?（LCMS）.?The?results?show?that?the?seeds?of?O.aegyptiaca?began?to?germinate?on?the?third?day?after?inoculation，?the?haustorium?top?was?firmly?attached?to?the?melon?root?on?the?7th?day，?and?then?haustorial?cell?invaded?the?cortex?of?melon?root，?forming?a?large?number?of?clawlike?structures?in?the?cell?layer?of?the?cortex?of?melon?root.?On?the?11th?day，?haustorial?cells?were?connected?with?host?vascular?bundle.?Phytohormone?test?results?showed?that?a?total?of?17?phytohormones?were?involved?in?the?formation?process?of?haustorium?in?O.aegyptiaca，?and?the?contents?of?auxin，?cytokinin?and?brassinolide?changed?significantly.?The?content?of?auxin?indole3carboxaldehyde?decreased?by?83.36%，?the?content?of?cytokininlike?transzeatinriboside?increased?by?5.02?times?and?brassinolide?increased?by?481.95?times?in?the?formation?process?of?haustorium.?These?three?phytohormones?might?play?an?important?role?in?regulating?haustorium?formation?in?O.aegyptiaca.

Key?words

Orobanche?aegyptiaca;?melon;?haustorium;?endogenous?hormones

分枝列當?Orobanche?aegyptiaca?Pers.可寄生甜瓜、西瓜、向日葵、番茄等重要經濟作物并造成嚴重經濟損失［12］，其通過吸器與寄主建立寄生關系并從寄主中獲取生長發育所需要的水分和各種營養物質。吸器對分枝列當的生長發育至關重要［34］。列當種子感受到寄主植物根系分泌物后開始萌發，萌發后朝向寄主根部生長，胚根貼附到寄主根表后，在黃酮類、酚酸類、醌類、細胞分裂素以及cyclohexene?oxides等寄主分泌的誘導因子作用下開始形成吸器，吸器的形成是列當由自養生長階段向異養生長階段（寄生狀態）轉變的重要步驟［58］。在列當吸器形成的不同階段，吸器內部的氨基酸、糖類、酚類、酶等物質會發生顯著變化［3］。生長素和細胞分裂素是具有拮抗作用的植物激素，兩者在大麻列當O.ramosa吸器發育早期高表達從而調節吸器發育［5］?，采用RNAi技術沉默分枝列當乙烯合成路徑相關基因PaACS，調控寄主向寄生物傳遞養分的基因Pam6PR和列當感知寄主分泌物信號的基因PaPrx1、PaACS和Pam6PR后，分枝列當產生的瘤節數量和生物量顯著降低［6］。細胞分裂素及一種苔蘚植物內生真菌Diplodia?cupressi分泌的兩種環氧環己烷類的植物毒素可誘導彎管列當Orobanche?crenata和向日葵列當O.cumana的吸器發育［9］;用細胞分裂素處理O.ramosa愈傷組織后將其與番茄根共培養，愈傷組織的侵襲力顯著增強，且與細胞分裂素相關的吸器誘發基因PrRR5、PrCKX2、PrCKX4、PrTRN2和PrZFP6表達量迅速增加，說明細胞分裂素與吸器形成密切相關［5］。

馬來酰肼是一種能在植物韌皮部和木質部傳遞的植物生長調節劑，可干擾瓜列當吸器的形成，被用于番茄上防治瓜列當，并已在以色列登記使用［7］。

為了明確分枝列當侵染甜瓜時吸器的形成過程及參與吸器形成的內源激素含量的變化，在分枝列當萌發和寄生甜瓜的不同階段連續取樣，采用石蠟切片技術和顯微觀察分析分枝列當吸器形成過程，明確分枝列當吸器形成的細胞學特征;同時利用液相色譜質譜聯用技術（LCMS）檢測分枝列當侵染甜瓜時吸器形成過程中植物激素的種類及含量，探究植物激素在分枝列當吸器形成過程中的作用。為進一步明確分枝列當吸器形成機制以及為后續建立有效列當防治措施提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?材料

供試甜瓜品種‘K1076?’由新疆農業科學院哈密瓜研究中心提供，分枝列當種子采集于新疆昌吉呼圖壁縣軍戶農場，經形態學和分子生物學鑒定為分枝列當。

1.2?試驗方法

1.2.1?甜瓜幼苗培育

甜瓜種子用2%的次氯酸鈉溶液處理15?min，再用75%乙醇處理3?min，最后用無菌水沖洗5次后放入裝有200?mL無菌水的三角瓶中，置于恒溫搖床中在27℃和170?r/min條件下培養，24?h后選取露白的種子播種于裝有純蛭石的128孔穴盤中，保濕并置于溫室（溫度28℃、光照強度10?000?lx，?L∥D=16?h∥8?h）中培養2～3周。待幼苗長出第一片真葉后，用蒸餾水沖洗甜瓜幼苗根部，隨后將其根平鋪在根室（直徑15?cm培養皿中依次放入一層12?cm×12?cm無菌海綿和2張直徑15?cm濾紙）中，并用錫箔紙覆蓋根室遮光，加水繼續培養［10］。

1.2.2?列當種子接種甜瓜

選取完全成熟的分枝列當種子，用1%的次氯酸鈉溶液處理15?min，75%乙醇處理2?min，再用無菌水沖洗4次備用。待根室中甜瓜幼苗培養1周后，在每株甜瓜幼苗新根周圍接種0.08?g列當種子。

1.2.3?列當寄生過程觀察

分枝列當種子接種甜瓜根部后3?d開始萌發，在顯微鏡下觀察分枝列當初始吸器狀態（S0：接種第5天）、附著狀態（S1：接種第7天）、吸器基部開始膨大（S2：接種第9天）及寄生基部膨大形成小瘤，與寄主建立寄生關系（S3：接種第11天）4個發育階段的組織形態。分別選取4個發育階段的分枝列當與甜瓜連接部位組織，將其置于2.5%戊二醛固定液中固定，制作石蠟切片，在顯微鏡下觀察寄生甜瓜根部的分枝列當的細胞結構。石蠟切片的制作參照白金瑞的方法［11］：將樣品置于2.5%戊二醛固定液中固定24?h，依次用75%、85%、90%、95%及100%乙醇進行脫水處理，隨后用二甲苯溶液處理15?min，將樣品置于融化的石蠟液與二甲苯溶液的混合液（V∶V=1∶1）中，在45℃的烘箱中浸蠟4?h，隨后置于純蠟液中于65℃烘箱中浸蠟8?h。用包埋機包埋樣品，于-20℃下冷卻，以10?μm的厚度連續切片，并置于45℃的烘箱中烤片。將烤過的切片依次置于二甲苯溶液7?min，二甲苯溶液5?min、無水乙醇5?min、無水乙醇5?min進行脫蠟，清水沖洗干凈，最后用加拿大樹膠進行封片，在光學顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.4?列當寄生過程中植物激素的檢測

待分枝列當生長到S0、S1、S2、S3階段時，剪取列當與甜瓜幼苗根連接部位組織的樣品，每個階段3個重復，每個重復取約0.15?g連接組織，將其迅速置于液氮中冷凍，于-80℃保存，委托諾禾致源科技股份有限公司進行LCMS/MS檢測，具體操作如下：

準確稱取24種植物激素標準品，制備成混標母液，用甲醇將其稀釋一系列濃度的工作液。配制一定濃度的indole3acetic?acidD4、jasmonic?acidD5、N6isopentenyladenineD6、dihydrozeatinD3、gibberellin?A1D4、salicylic?acidD4、abscisic?acidD6溶液得到內標溶液（IS）。線性、內標和質控的母液及工作溶液均保存于-20℃冰箱。

液氮研磨組織樣本，迅速稱取100?mg粉末置于2?mL離心管，加入400?μL預冷的含混合內標的提取液（50%乙腈），渦旋混勻，4℃低溫萃取30?min，經12?000?r/min離心10?min后，取上清液并將其緩慢經過Oasis?PRiME?HLB小柱;再次加入1?mL?30%乙腈，緩慢經過小柱，收集溶液，將兩次溶液合并到1個離心管中，混勻后通過LCMS分析。色譜柱：Waters?XSelect?HSS?T3（2.1?mm×150?mm，2.5?μm）;A相：含0.01%甲酸的水;B相：含0.01%甲酸的乙腈;柱溫45℃，進樣量：10?μL;流速：0.3?mL/min。質譜條件：電噴霧電離（ESI），離子源溫度550℃，負模式離子源電壓-4?500?V，正模式離子源電壓4?500?V，氣簾氣35?psi，霧化氣60?psi，輔助氣60?psi。采用多反應監測（MRM）進行掃描，對標準液的濃度系列分別進行?LCMS?檢測。

1.2.5?數據處理

試驗數據采用Excel?2010和IBM?SPSS?statistics?20進行方差統計分析。用Duncan氏新復極差法檢驗不同發育階段之間的差異顯著性（P<0.05），利用Origin?2020軟件進行繪圖。

2?;結果與分析

2.1?分枝列當寄生甜瓜過程觀察

在根室條件下，分枝列當種子在接種至甜瓜根部后第3?天開始萌發，第5?天芽管頂端膨大形成初始吸器（S0時期，圖1a），第7?天時穩固地貼附在寄主根部（S1時期，圖1b），第9?天時列當寄生基部開始膨大（S2時期，圖1c），接種后第11?天，寄生部位形成瘤節（S3時期，圖1d），形成完整的寄生體系。

2.2?分枝列當吸器形成過程中細胞結構觀察

石蠟切片結果表明，接種后第7天，分枝列當成功附著在甜瓜根上，此時分枝列當的吸器細胞貼附在甜瓜根表皮（圖2a）。接種后第8天和第9天吸器細胞在甜瓜根皮層細胞間隙擴展，侵入根表皮組織（圖2b，?c），在此過程中吸器會特化形成一個爪狀的結構，利于吸器侵入細胞后在甜瓜根皮層組織中固著（圖2d）。接種后第11天，列當吸器的侵入細胞呈柵欄狀整齊排列在寄主維管束周圍（圖2e），與寄主維管束建立連接關系，在此基礎上列當吸器侵入細胞繼續擴展到寄主維管束的另一端與維管束連接（圖2f），完全建立起寄生關系。

2.3?吸器形成過程中內源激素變化情況

2.3.1?分枝列當吸器形成過程中生長素類激素含量變化

分枝列當吸器形成過程中生長素類激素吲哚3甲醛（indole3carboxaldehyde，?IND）、3吲哚甲酸（indole3carboxylic?acid，?ICA）、吲哚丁酸（3indolebutyric?acid，?IBA）和吲哚3乙酸（indole3acetic?acid，?IAA）等生長素類激素含量變化情況見圖3。IND、IAA、IBA在S0時期的含量顯著高于S1、S2、S3時期。在S0、S1、S2、S3時期IND含量分別為179.9、49.95、42.21?ng/g和29.93?ng/g，從形成初始吸器（S0時期）到吸器細胞與維管束連接（S3時期）IND含量降低83.36%;在S0～S3時期IAA含量依次為26.21、7.21、8.71?ng/g和11.67?ng/g，S0時期的IAA含量為S1時期的3.6倍。S0～S3時期IBA含量依次為15.61、5.77、6.16?ng/g和7.71?ng/g，IBA在S0時期的含量比S1時期高1.71倍。ICA含量在吸器形成過程中變化不明顯。

2.3.2?分枝列當吸器形成過程中細胞分裂素類含量變化

本研究共檢測到了異戊烯基腺嘌呤（N6isopentenyladenine，?IP）、異戊烯基腺苷（isopentenyl?adenosine，?IPA）、反式玉米素核苷（transzeatinriboside，?TZR）和激動素（kinetin，?KT）4種細胞分裂素，但未檢測到反式玉米素（transzeatin，?tZ）和雙氫玉米素（dihydrozeatin，?DhZ）。從分枝列當初始吸器形成時期（S0時期）至吸器細胞與維管束連接時（S3時期），TZR含量依次為1.53、1.25、2.42?ng/g和9.21?ng/g，IPA含量依次為0.68、0.42、0.55?ng/g和4.09?ng/g，相比S0時期，S3時期TZR含量增加了約5.02倍，而IPA含量增加了約5.01倍。IP在S0～S3時期的含量依次為4.16、0.91、1.32?ng/g和1.87?ng/g，相比S0時期，S3時期IP的含量下降了約55%;KT在S0～S3時期的含量依次為2.28、1.35、2.07?ng/g和2.03?ng/g，其中S0時期的含量顯著高于S1時期（圖4）。

2.3.3?分枝列當吸器形成過程中赤霉素類含量變化

共檢測到了GA1、GA3、GA4?3種赤霉素類激素，但未檢測到GA7。其中GA1在分枝列當吸器形成（S0時期）至吸器細胞與維管束連接（S3時期）含量依次為6.32、3.86、7.11?ng/g和4.26?ng/g，S0時期的含量顯著高于S1時期。GA3在S0～S3時期含量依次為4.41、1.88、5.60?ng/g和5.08?ng/g，S0時期、S2時期、S3時期的含量顯著高于S1時期;而GA4含量在分枝列當吸器形成過程中變化不顯著（圖5）。

2.3.4?分枝列當吸器形成過程中茉莉酸類激素含量變化

茉莉酸類化合物在植物的生長發育和抗逆性方面發揮重要作用。本研究檢測到了N茉莉酸異亮氨酸（Njasimonic?acidisoleucine，JAIle）、二氫茉莉酸（dihydrojasmonic?acid，H2JA）、茉莉酸［（±）jasmonic?acid，?JA］3種茉莉酸類激素。JAIle在分枝列當吸器形成（S0時期）至吸器細胞與維管束連接（S3時期）含量依次為1.56、2.01、2.89?ng/g和2.32?ng/g，S2時期的含量顯著高于S1、S0、S3時期。H2JA在S0～S3時期含量依次為0.69、1.49、0.85?ng/g和0.86?ng/g，S1時期的含量顯著高于S0、S2、S3時期，JA在S0～S3時期含量依次為0.37、0.50、0.34?ng/g和1.38?ng/g，S3時期的含量顯著高于S0、S1、S2時期（圖6）。

2.3.5?分枝列當吸器形成過程中脫落酸、乙烯、水楊酸、油菜素內脂等激素含量變化

本研究檢測了分枝列當吸器形成過程中脫落酸（abscisic?acid，ABA）、水楊酸（salicylic?acid，SA）、乙烯合成前體1氨基環丙烷羧酸（1aminocyclopropane1carboxylic?acid，ACC）、油菜素內酯（brassinolide，BR）等4種激素的含量。結果（圖7）表明：SA在分枝列當吸器形成過程中含量呈現上升的趨勢，在S3時期（61.24?ng/g）的含量顯著高于S0（22.99?ng/g）、S1（31.85?ng/g）、S2（23.02?ng/g）時期;ACC在S0時期（284.96?ng/g）的含量顯著高于S1（83.69?ng/g）、S2（83.69?ng/g）、S3（118.90?ng/g）時期;BR在S0時期的含量（237.04?ng/g），顯著低于S1時期（71?197.51?ng/g）、S2時期?（98?420.24?ng/g）、S3時期（114?241.46?ng/g）。

3?結論與討論

本研究采用顯微鏡觀察，明確了分枝列當種子

接種到甜瓜根部第11?天時可完成種子萌發、侵入細胞和與甜瓜根部維管束建立連接的寄生過程。在列當種子接種甜瓜根部第8天、第9天、第10天時，分枝列當侵入細胞在甜瓜根皮層擴展過程中會形成大量的爪狀結構，不僅擴大了侵入面積而且可起到固著作用。在接種第11?天時，分枝列當侵入細胞與甜瓜維管束連接，根據石蠟切片觀察結果可將分枝列當吸器形成過程分為初始吸器狀態（S0）、附著狀態（S1）、吸器基部膨大（S2）及吸器細胞與維管束連接（S3）4個階段。對4個階段植物激素進行檢測，生長素類激素在分枝列當S0時期的含量顯著高于其他3個階段。Zhang等對檀香Santalum?album吸器形成過程轉錄組分析結果表明：生長素類激素合成基因在吸器形成前期處于高表達水平［12］。Ishida等研究表明生長素生物合成基因YUC3在根寄生植物松蒿Phtheirospermum?japonicum吸器與寄主接觸點的表皮細胞中特異性表達，說明生長素類激素在松蒿吸器的形成中起關鍵作用［13］。在本研究中生長素類激素IND、IAA、IBA含量在初始吸器階段（S0時期）的含量顯著高于吸器形成后期，推測生長素類激素在分枝列當初始吸器形成過程中具有重要作用。

本研究結果表明，細胞分裂素類激素參與了分枝列當吸器形成，其中，反式玉米素核苷、異戊烯基腺苷在吸器形成前期含量保持穩定，后期含量顯著上升，異戊烯基腺嘌呤、激動素在吸器形成前期含量顯著下降后期保持穩定。推測異戊烯基腺嘌呤、激動素介導調控了吸器形成前期，而反式玉米素核苷、異戊烯基腺苷介導調控了吸器形成后期，說明細胞分裂素類激素在分枝列當吸器的形成過程中具有關鍵作用。寄生植物松蒿乙烯信號突變體在吸器的侵入細胞形成階段和在寄主皮層擴展中表現出明顯的缺陷［14］，表明乙烯對吸器的形成具有重要的作用。在分枝列當吸器形成過程中乙烯合成前體1氨基環丙烷羧酸在初始吸器時期的含量顯著高于吸器形成后期，推測1氨基環丙烷羧酸可能在分枝列當吸器侵入細胞形成時發揮重要作用。

Furuhashi等用油菜素內酯單獨處理菟絲子時無法誘導出吸器［15］，但在本研究中油菜素內酯在吸器形成后期的含量顯著高于初始吸器時期。本研究檢測了茉莉酸類、水楊酸、脫落酸、赤霉素類等植物激素在分枝列當吸器形成過程中的含量變化，檢測結果顯示：茉莉酸、N茉莉酸異亮氨酸、水楊酸在分枝列當吸器形成后期含量顯著高于前期，說明這幾類植物激素對寄生植物吸器形成具有關鍵作用，但植物激素調節植物生長發育是一個相互獨立又協同作用的過程［16］，分枝列當吸器形成或許是多種植物激素協同作用的結果，其中以生長素、細胞分裂素、油菜素內酯在分枝列當吸器形成過程中可能起主導作用。

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